楊丹，李清，王貴禧，馬慶華，朱利泉

（1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400716；2中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所/國家林業(yè)局林木培育實(shí)驗(yàn)室/林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091）

平歐雜種榛實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選與體系建立

楊丹1，李清2，王貴禧2，馬慶華2，朱利泉1

（1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400716；2中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所/國家林業(yè)局林木培育實(shí)驗(yàn)室/林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091）

【目的】構(gòu)建中國榛屬植物主要栽培種平歐雜種榛實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選體系，并篩選穩(wěn)定的內(nèi)參基因，為榛屬植物的基因表達(dá)分析提供內(nèi)參基因，進(jìn)而為其植物資源利用和創(chuàng)新育種研究提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā坷谜n題組前期對平歐雜種榛不同親和性授粉、授粉后不同時(shí)間的雌蕊轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)搜索，共選取12個(gè)候選內(nèi)參基因；以平歐雜種榛主栽品種‘達(dá)維’的盛花期雌蕊、未伸長期雄花序、幼嫩葉片、花粉、一年生枝形成層、嫩莖、根尖、根蘗等8個(gè)不同組織器官為研究材料；通過反轉(zhuǎn)錄PCR初篩，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測表達(dá)量，并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Ct程序和RefFinder在線網(wǎng)站評價(jià)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性?！窘Y(jié)果】反轉(zhuǎn)錄PCR初篩表明，12個(gè)候選內(nèi)參基因引物的特異性良好，ChaSTP5和ChaTF在不同組織器官材料中表達(dá)存在明顯差異，其余候選內(nèi)參基因在8個(gè)組織中均有表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的表達(dá)譜分析表明，Ch18S rRNA的表達(dá)量最高，ChaSTP5表達(dá)量最低，其余10個(gè)候選內(nèi)參基因均為中等表達(dá)量；ChaSTP5和ChaTF的穩(wěn)定性最差，其余10個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性處于中等水平。geNorm、NormFinder、BestKeeper和Delta Ct的結(jié)果表明，ChaActin均排名第一，為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，Ch18S rRNA的排名均在前五，而其他候選內(nèi)參基因在不同程序分析結(jié)果中的排名存在差異。穩(wěn)定性綜合分析表明，ChaActin和Ch18S rRNA的穩(wěn)定性良好，即在8個(gè)不同組織器官中表達(dá)量均一且在4個(gè)穩(wěn)定性分析程序中均排名靠前，適合作為內(nèi)參基因；geNorm程序的變異系數(shù)分析則表明，選取6個(gè)內(nèi)參基因便可對RT-qPCR的數(shù)據(jù)進(jìn)行精準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)化處理；相關(guān)性分析表明，4個(gè)程序均在0.01水平上呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性，NormFinder和Delta Ct程序的相關(guān)性最高，Delta Ct與BestKeeper的相關(guān)性最低?！窘Y(jié)論】建立了平歐雜種榛實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選體系：以反轉(zhuǎn)錄PCR初篩引物，熒光定量PCR分析引物特性及基因表達(dá)，4個(gè)程序單獨(dú)評價(jià)引物穩(wěn)定性，RefFinder綜合分析選出最適穩(wěn)定內(nèi)參基因，并選出榛屬植物8個(gè)不同組織器官中最為穩(wěn)定的2個(gè)內(nèi)參基因ChaActin和Ch18S rRNA。

平歐雜種榛；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；內(nèi)參基因；穩(wěn)定性；體系建立

0 引言

【研究意義】榛子為樺木科（Betulaceae）榛屬（Corylus）植物，是世界四大堅(jiān)果之一。全世界榛屬植物約有25種[1]，主要分布于亞洲、歐洲及北美洲，其中商業(yè)化栽培的只有歐洲榛（C. avellana L.）的一些品種[2]；中國原產(chǎn)的榛屬植物分為8個(gè)種和2個(gè)變種，廣泛分布于中國的20余個(gè)省區(qū)，栽培種為通過平榛（C. heterophylla Fisch.）和歐洲榛種間雜交獲得的平歐雜種榛（C. heterophylla Fisch. × C. avellana L.）的若干品種[3]。上述榛屬植物資源豐富，在樹體特征、堅(jiān)果性狀、抗逆性，以及自交不親和特性等方面存在豐富的變異類型，大量特異性狀基因亟待挖掘和利用。目前，針對東部榛疫?。‥astern Filbert Blight）的歐洲榛抗性育種[4-5]，針對抗寒性的中國平榛與歐洲榛的種間雜交[6-7]，以及針對榛屬植物孢子體自交不親和特性開展的S位點(diǎn)基因研究[8-10]，是世界榛子育種領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題。隨著研究的深入，分子生物學(xué)技術(shù)將成為榛屬植物資源利用和育種創(chuàng)新方面重要的研究手段，將在特異性狀基因挖掘和分子輔助育種工作中發(fā)揮精準(zhǔn)、高效的研究優(yōu)勢，具有重要的研究意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）是基因克隆工作的重要組成部分，指在反應(yīng)體系中引入熒光染料或帶熒光標(biāo)記探針的一種改良型PCR，其具有耗時(shí)短、高靈敏度、重復(fù)性強(qiáng)、樣品需要量少等優(yōu)點(diǎn)[11-13]，被廣泛的用于基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄分析。RT-qPCR是以cDNA為模板，初始的RNA質(zhì)量、產(chǎn)量、反轉(zhuǎn)錄效率和擴(kuò)增效率等均會(huì)影響基因表達(dá)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[14]，目前，常用引入內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理的方式來減弱誤差[15]。理想的內(nèi)參基因是在各種條件下均能穩(wěn)定表達(dá)[11]，因此，在前期研究中一般選取Tubulin（微管蛋白基因），Actin（肌動(dòng)蛋白基因），GAPDH（3-磷酸甘油醛脫氫酶基因），18S rRNA等管家基因（House-keeping Gene）作為內(nèi)參基因。越來越多的研究證明[16-20]：管家基因在一般情況下可以穩(wěn)定表達(dá)，但在一些特殊的生命活動(dòng)中或試驗(yàn)處理?xiàng)l件下其表達(dá)出現(xiàn)了不穩(wěn)定性。因此，篩選出適合的穩(wěn)定的內(nèi)參基因，成為了實(shí)時(shí)熒光定量PCR的關(guān)鍵性問題，常用的內(nèi)參基因篩選方法有：geNorm[21]、Normfinder[22]、BestKeeper[19]和Delta Ct[23]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，關(guān)于平歐雜種榛的相關(guān)分子機(jī)理研究日益增多，國內(nèi)外還沒有關(guān)于系統(tǒng)性篩選適合平歐雜種榛實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的相關(guān)報(bào)道，而利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析其相關(guān)基因的表達(dá)時(shí)，則是未經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和篩選，直接引用其他物種基因作為內(nèi)參基因[24]。隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)成熟和成本逐漸降低，篩選獲取適合平歐雜種榛自身的穩(wěn)定內(nèi)參基因變得尤為重要。使用穩(wěn)定、合適的內(nèi)參基因，才能夠更加準(zhǔn)確計(jì)算出基因的表達(dá)情況?！緮M解決的關(guān)鍵問題】運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析12個(gè)候選內(nèi)參基因在平歐雜種榛不同組織器官中的穩(wěn)定性，并篩選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因，以期構(gòu)建其熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選體系，為后期平歐雜種榛相關(guān)的基因表達(dá)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015年1月至2016年8月在中國林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用平歐雜種榛主栽品種‘達(dá)維’（育種代號(hào)84-254）作為材料，所有樣品采自中國林業(yè)科學(xué)研究院玉泉山榛子實(shí)驗(yàn)基地。根據(jù)榛屬植物的植物學(xué)特性并參閱其他相似研究，試驗(yàn)選用了8個(gè)不同的組織部位（表1）。2015年1月，隨機(jī)采集‘達(dá)維’的一年生枝條200條，分成兩份（其中一份去雄），置于0—2℃冷庫中保濕存放。2015年3月，于25℃溫室中隔離水培：去雄的一份，待雌花開放后，收集雌蕊；另一份待雄花序拉長后收集花粉，裝在帶有棉塞的玻璃瓶中，置于-80℃冰箱中備用。其余組織樣品依據(jù)榛子的植物學(xué)特性，分別在田間取樣。所用樣品均經(jīng)液氮速凍后，存放于-80℃冰箱備用。

表1 研究材料Table 1 Samples

1.2 候選內(nèi)參基因的選取和引物設(shè)計(jì)

利用筆者課題組前期對平歐雜種榛不同親和性授粉、授粉后不同時(shí)間雌蕊的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)（暫未公布），以FDR值（False Discovery Rate）小于0.01和表達(dá)量Log2比率值介于-1和1之間為篩選標(biāo)準(zhǔn)，選出表達(dá)穩(wěn)定的序列作為候選內(nèi)參基因；此外，通過Blast獲得actin、ubiquitin、18S ribosomal RNA、alpha tubulin、beta-tubulin、elongation factor 1-alpha和GAPDH這7種常用傳統(tǒng)內(nèi)參基因的同源序列，通過上述篩選方法獲取候選內(nèi)參基因；根據(jù)榛屬相關(guān)文獻(xiàn)[24-26]，收集其所使用的內(nèi)參基因及其引物。

利用在線引物設(shè)計(jì)程序Primer 3.0（http://bioinfo. ut.ee/primer3-0.4.0/）設(shè)計(jì)RT-qPCR引物，參數(shù)設(shè)置：引物Tm值為58—62℃，擴(kuò)增片段長度范圍為150—200 bp，引物長度范圍為19—21 nt，GC含量范圍為45%—55%，其他為默認(rèn)設(shè)置參數(shù)；并運(yùn)用NCBI Blast驗(yàn)證引物的特異性。

1.3 RNA提取和cDNA合成

采用改良后的CTAB法提取總RNA，取部分RNA溶液經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(jì)Nanodrop 8000進(jìn)行檢測，分析其完整性與濃度。

每個(gè)樣品取1 μg RNA使用BIO-ROD公司的iScript? cDNA合成試劑盒進(jìn)行20 μL體系的反應(yīng)。反應(yīng)程序：25℃，5 min→42℃，30 min→85℃，5 min于PCR儀上完成。所得cDNA溶液（20 μL）稀釋5倍，保存于-20℃冰箱，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 反轉(zhuǎn)錄PCR

使用2×TSINGKE Master Mix（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司），于Veriti 96 well Thermal cycler PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系見表2；反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次；72℃徹底延伸7 min；保存于4℃。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢查。

1.5 熒光定量PCR

采用SYBR Green染料法，利用iTaqTM Universal SYBR?Green Supermix（BIO-RAD，USA）于C1000 Touch TM Thermal cycler PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)且每組引物設(shè)置一個(gè)陰性對照。反應(yīng)體系如表3所示；PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序（兩步法擴(kuò)增）：95℃預(yù)變性，3 min→（95℃變性，5 s→ 56℃退火+延伸，30 s）循環(huán)40次；溶解曲線反應(yīng)程序：65℃升溫至95℃，以0.5℃遞增，恒溫5 s。

表2 RT-PCR反應(yīng)體系Table 2 The reaction system of RT-PCR

表3 RT-qPCR反應(yīng)體系Table 3 The reaction system of RT-qPCR

1.6 引物評價(jià)

取等量不同組織部位樣品的cDNA模板，混合后依次稀釋5個(gè)梯度，每個(gè)梯度稀釋5倍，其濃度分別表示為55、54、53、52、51、50倍，作為模板，并參照1.5中的方法進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)。利用PCR儀自帶的計(jì)算軟件（CFX Manager 3.1），根據(jù)Cq（quantification cycle）值建立線性回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到斜率k和線性相關(guān)系數(shù)R2，并求得擴(kuò)增效率E（E=10-1/K-1）；并收集溶解曲線。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010對原始Cq值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；使用qBase軟件獲得候選內(nèi)參基因的Q值（Q=ECqmin-Cqsample；E代表擴(kuò)增效率，Cq min代表基因在一組樣品中最小的Cq值，Cq sample代表基因在一組樣品中各樣品的Cq值）。

利用程序geNorm、Normfider、Bestkeeper和Delta Ct法分析候選內(nèi)參基因在8個(gè)樣品中的穩(wěn)定性；運(yùn)用線網(wǎng)站RefFinder（http://fulxie.0fees.us/?type=reference& ckattempt=1&i=1）進(jìn)行綜合評價(jià)。根據(jù)geNorm、NormFinder、BestKeeper和Delta Ct計(jì)算12個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性值，利用SPSS軟件獲取其皮爾遜相關(guān)系數(shù)。

利用Microsoft Excel 2010和Origin 9.0軟件處理數(shù)據(jù)，繪制圖表。

2 結(jié)果

2.1 候選內(nèi)參基因的確定及其引物特異性和擴(kuò)增效率分析

在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，以FDR值小于0.01和表達(dá)量Log2比率值介于-1和1之間為篩選標(biāo)準(zhǔn)，選出穩(wěn)定表達(dá)的3個(gè)作為候選內(nèi)參基因（表4）。7個(gè)傳統(tǒng)內(nèi)參基因的同源序列中，18S rRNA和TUB在轉(zhuǎn)錄組中同源序列的表達(dá)存在差異，說明不適合作為內(nèi)參基因，最終選出5個(gè)作為候選內(nèi)參基因（表4）。

軟件設(shè)計(jì)的8對特異性引物和文獻(xiàn)收集4對特異引物（表5），合計(jì)12對引物。12對引物的擴(kuò)增效率E在86.3%—121.6%，而R2值均大于0.98（0.982—0.997），說明其線性回歸方程可信[27]。

表4 候選內(nèi)參基因Table 4 Description of candidate reference genes

表5 候選內(nèi)參基因引物Table 5 Primers of candidate reference genes

RT-PCR（reverse transcription PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR）產(chǎn)物的瓊脂糖電泳（圖1）表明，12對引物均為單一條帶，說明其特異性良好（AtActin電泳圖存在一條較低的條帶，經(jīng)陰性對照組比較，發(fā)現(xiàn)其應(yīng)該為引物二聚體，較高條帶為特異性擴(kuò)增的單一條帶）；而基因ChaSTP5和ChaTF的表達(dá)存在明顯差異，初步判斷這兩個(gè)基因不適合內(nèi)參基因。12個(gè)候選內(nèi)參基因引物的RT-qPCR溶解曲線（圖2）均為單一峰，也表明12個(gè)引物的特異性良好。

2.2 候選內(nèi)參基因表達(dá)譜

根據(jù)RT-qPCR的結(jié)果，分析了12個(gè)候選內(nèi)參基因在8個(gè)樣品中的Cq值分布情況（圖3）。12個(gè)候選內(nèi)參基因的Cq值介于32.09—16.02，波動(dòng)范圍較大。Cq值與其表達(dá)量成反比，因此，Ch18S rRNA的表達(dá)量最高（16.02—20.55），ChaSTP5表達(dá)量最低（25.34—32.09），其余10個(gè)候選內(nèi)參基因均為中等表達(dá)量。

通過Excel分析每個(gè)候選內(nèi)參基因在所有樣品中Cq值的平均數(shù)（mean），標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation，SD）和變異系數(shù)（co-variance，CV）如表6所示。根據(jù)變異系數(shù)，可初步判斷12個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性：ChaTF（9.92%）穩(wěn)定性最差，而VvActin（4.31%）和ChaActin（4.66%）則較穩(wěn)定；其余候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性處于中等水平。

圖1 12個(gè)候選內(nèi)參基因的RT-PCR瓊脂糖電泳圖Fig. 1 Agarose gel of RT-PCR products of 12 candidate reference genes

表6 候選內(nèi)參基因Cq值分析Table 6 Analysis of the Cq values of candidate reference genes

2.3 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

geNorm程序是根據(jù)計(jì)算所得的M值來表示候選基因表達(dá)穩(wěn)定性，M值越小的候選基因穩(wěn)定性越好。本研究中，geNorm程序的分析結(jié)果表明，ChaActin的M值最低，其穩(wěn)定性最好，適合作為內(nèi)參基因；其次，VvActin、ChaEF1-α和Ch18S rRNA的排名比較靠前，也可作為候選內(nèi)參基因；而ChaSTP5和ChaTF的M值高排名靠后，不適合作為備選的內(nèi)參基因（表7）。

此外，geNorm程序會(huì)根據(jù)變異系數(shù)（pairwise variation）來評估適合作為標(biāo)準(zhǔn)化處理所需內(nèi)參基因的數(shù)目，默認(rèn)變異系數(shù)（Vn/Vn+1）小于0.15時(shí)，所需最優(yōu)內(nèi)參基因數(shù)即為n個(gè)。但本研究的變異系數(shù)分析（圖4）的值均大于0.15，根據(jù)圖4中變異系數(shù)變化趨勢，認(rèn)為V6/V7（0.189）已經(jīng)屬于較低值，即選取6個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理。

NomFinder程序則是根據(jù)候選基因的表達(dá)穩(wěn)定值（stability value，SV），選出穩(wěn)定性最好的基因。SV值越小，候選基因越穩(wěn)定，反之亦然。本研究NormFinder分析結(jié)果表明，ChaActin的SV值最小，最為穩(wěn)定，這與geNorm中結(jié)果一致；其次穩(wěn)定性較好的為VvActin、ChaTUA、ChaEF1-α和Ch18S rRNA；最不穩(wěn)定的還是ChaSTP5和ChaTF（表7）。

導(dǎo)入Ct值，BestKeeper程序能計(jì)算獲得候選內(nèi)參基因在所有樣品中Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差（SD），變異系數(shù)（CV）和基因間相關(guān)系數(shù)（r）等值。由于程序限制僅可同時(shí)分析10個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，根據(jù)BestKeeper分析結(jié)果的SD排名（表7）可知：ChaActin依然是最為穩(wěn)定的內(nèi)參基因；其次穩(wěn)定性較好的為ChaUBQ14、VvActin和Ch18S rRNA；AtActin的穩(wěn)定性最差，不建議作為內(nèi)參基因使用。

圖2 12個(gè)候選內(nèi)參基因的溶解曲線Fig. 2 The melting curves of 12 candidate reference genes

Delta Ct法，通過Ct值計(jì)算候選內(nèi)參基因的平均標(biāo)準(zhǔn)差（Mean SD），以此評價(jià)其穩(wěn)定性，其值越小內(nèi)參基因越穩(wěn)定。本研究中Delta Ct法分析結(jié)果表明，穩(wěn)定性最好的是ChaActin、VvActin和Ch18S rRNA；ChaSTP5和ChaTF的SD最高，不適合作為內(nèi)參基因（表7）。

2.4 候選內(nèi)參基因綜合評價(jià)

RefFinder在線網(wǎng)站包括了2.3中4種內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價(jià)程序，并能對其分析結(jié)果進(jìn)行評價(jià)給出綜合排名。RefFinder綜合排名（表8）表明，ChaActin和VvActin排名靠前，說明Actin適合作為榛屬植物不同組織器官分析時(shí)的內(nèi)參基因，ChaActin位列第一，說明根據(jù)榛屬自身基因設(shè)計(jì)的引物更為合適；Ch18S rRNA則緊靠Actin之后，也是較為穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因，而根據(jù)2.3可知Ch18S rRNA在4個(gè)不同的穩(wěn)定性程序分析結(jié)果中排名均在前五之中；而ChaSTP5和ChaTF基因的綜合排名靠后，這與前面穩(wěn)定性分析結(jié)果相一致，說明其最不適合作為內(nèi)參基因。一般選取雙內(nèi)參基因更能對熒光定量結(jié)果進(jìn)行較為準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)化處理，綜合分析可知ChaActin和Ch18S rRNA可選取為最適的雙內(nèi)參基因。

表7 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性排名Table 7 The stability ranking of candidate reference genes

表8 穩(wěn)定性的綜合排名Table 8 The comprehensive ranking of stability

利用4種程序的排名穩(wěn)定性值的皮爾遜相關(guān)系數(shù)（pearson correlation coefficient，r）分析其相關(guān)性（表9）：4個(gè)程序均在0.01水平上顯著相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)均高于0.9；NormFinder和Delta Ct的相關(guān)性最高（r=0.994），其次為geNorm和NormFinder；而geNorm和Delta Ct與BestKeeper的相關(guān)性較低。

表9 程序的相關(guān)性分析Table 9 Correlation analysis of program

3 討論

圖3 12個(gè)候選內(nèi)參基因在8個(gè)樣品中的Cq值分布Fig. 3 Ct values of 12 candidate reference genes in 8 samples

圖4 變異系數(shù)分析Fig .4 Pairwise variation (V) calculated by geNorm

篩選合適的穩(wěn)定內(nèi)參基因是實(shí)現(xiàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析基因表達(dá)情況的先決條件，本研究根據(jù)筆者課題組前期轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)及前人相關(guān)研究，篩選出2個(gè)最適的穩(wěn)定內(nèi)參基因ChaActin和Ch18S rRNA。而戴超等[28]的研究證明，18S rRNA、Actin和Ubiquitin 3個(gè)基因適合作為白樺半定量PCR的內(nèi)參基因；陳新[25]的研究證明，半定量PCR中Actin也適合作為平榛的內(nèi)參基因，這均與本研究結(jié)果相一致，說明Actin在樺木科中表達(dá)穩(wěn)定，適合作為內(nèi)參基因。此外，這兩個(gè)基因在其他物種中也是常用的內(nèi)參基因，如：蔣婷婷等[29]研究中，Actin適合作為換錦花（Lycoris sprengeri）不同組織和不同花期以及石蒜屬（Lycoris）不同雜交種鱗莖的內(nèi)參基因；李冉等[30]研究表明在水稻（Oryza sativa）中稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis Guenee）處理后Actin的表達(dá)最穩(wěn)定；蘇曉娟等[31]認(rèn)為Actin和18S rRNA等基因適合作為毛果楊（Populus trichocarpa）不同組織以及鋅脅迫下的組培苗表達(dá)分析的內(nèi)參基因；張崗等[32]則以EF-1α/18S rRNA為內(nèi)參基因分析鐵皮石斛（Dendrobium officinale）FPS的組織表達(dá)情況；KIM等[33]認(rèn)為水稻逆境脅迫中18S rRNA表達(dá)穩(wěn)定性最高。

本研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)材料本身轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)的基因引物比直接引用其他材料引物的穩(wěn)定性更好，如ChaActin的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于AtActin，說明根據(jù)材料基因序列設(shè)計(jì)特異引物效果更好。前人研究也證明利用轉(zhuǎn)錄組等基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫可以快速篩選獲得理想的內(nèi)參基因：SANG等[34]利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出了適合分析超積累型東南景天（Hyperaccumulating Sedum alfredii Hance）的內(nèi)參基因UBC9和TUB；朱友銀等[35]利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出適合作為中國櫻桃（Prunus pseudocerasus）低溫響應(yīng)和鹽堿脅迫處理的內(nèi)參基因GAPDH，以及ABA處理和花芽休眠解除過程中的內(nèi)參基因ACTB和UBCE；而劉洪峰等[36]利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出適合牡丹（Paeonia ostii）的新型內(nèi)參基因PUF1639、MBF1A、PP2CFP和RPS9。綜上說明，利用轉(zhuǎn)錄組和基因芯片等基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫能夠更加高效、快速的篩選出合適的內(nèi)參基因。

本研究在構(gòu)建內(nèi)參基因篩選體系時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過反轉(zhuǎn)錄PCR能夠快速剔除在分析材料中表達(dá)明顯不穩(wěn)定的基因，實(shí)現(xiàn)對候選內(nèi)參基因的初步篩選，節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間和經(jīng)費(fèi)；相關(guān)性分析表明4個(gè)程序排名顯著相關(guān)，其中NormFinder和DeltaCt的相關(guān)性最高，與GUO等[37]的研究結(jié)果相一致。此外，geNorm程序可以根據(jù)配對變異（pairwise variation）V值，來確定理想候選內(nèi)參基因個(gè)數(shù)[21]。程序默認(rèn)Vn/Vn+1小于0.15，則沒有必要再引入第n+1個(gè)基因，反之則需引入新的內(nèi)參基因。本研究所用的材料為不同組織器官，其跨度本身較大，這可能是導(dǎo)致變異系數(shù)分析中其值均高于0.15的原因，而蔣婷婷等[29]也提到可能由于材料跨度過大會(huì)導(dǎo)致變異系數(shù)分析值均高于0.15。此外，程序本身也說明0.15并不是一個(gè)苛刻的限制，根據(jù)試驗(yàn)情況，其值可進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。但是為了篩選出適合于不同組織材料的內(nèi)參基因應(yīng)該選取更多的候選基因進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性分析，獲取最為合適的內(nèi)參基因，以達(dá)到數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化分析的要求。本研究中12個(gè)候選內(nèi)參基因在4種不同程序中的穩(wěn)定性排名存在一定的差異，這應(yīng)該是由于程序設(shè)計(jì)的原理不同而導(dǎo)致，在篩選內(nèi)參基因時(shí)應(yīng)該用4個(gè)程序同時(shí)進(jìn)行分析，從而選出最適的穩(wěn)定內(nèi)參基因，這樣結(jié)果的可靠性更高；而RefFinder在線網(wǎng)站能快速的對原始Ct值進(jìn)行分析得出綜合排名，由于其計(jì)算過程中未考慮到引物擴(kuò)增效率，其分析結(jié)果可能存在一定誤差，建議與4個(gè)程序單獨(dú)計(jì)算的結(jié)果進(jìn)行比較分析。

4 結(jié)論

本研究利用geNorm、Normfider、Bestkeeper和 Delta Ct法以及在線網(wǎng)站RefFinder，分析了12個(gè)候選內(nèi)參基因在榛屬植物8個(gè)不同組織器官中的表達(dá)穩(wěn)定性，篩選出2個(gè)最適的穩(wěn)定內(nèi)參基因ChaActin和Ch18S rRNA；并構(gòu)建了平歐雜種榛內(nèi)參基因的篩選體系：反轉(zhuǎn)錄PCR初篩引物，熒光定量PCR分析引物特性及基因表達(dá)，4個(gè)程序（geNorm、Normfider、Bestkeeper、和Delta Ct法）分別評價(jià)引物穩(wěn)定性，RefFinder綜合分析選出最適的穩(wěn)定內(nèi)參基因。研究結(jié)果為榛屬植物實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選與分析提供了研究基礎(chǔ)，也為其相關(guān)基因的組織表達(dá)分析提供了可參考的穩(wěn)定內(nèi)參基因。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Reference Genes Selection and System Establishment for Real-Time qPCR Analysis in Ping’ou Hybrid Hazelnut (C. heterophylla Fisch. × C. avellana L.)

YANG Dan1, LI Qing2, WANG GuiXi2, MA QingHua2, ZHU LiQuan1
(1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716;2Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry/Key Laboratory of Forestry Silviculture of State Forestry Administration/State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Beijing 100091)

【Objective】 The objective of this article is to construct a reference gene screening system of real-time qPCR inPing’ou hybrid hazelnut (C. heterophylla Fisch × C. avellana L, main cultivars of Corylus in China) for gene expression analysis, and provide a theoretical basis for the study of plant resource utilization and innovative breeding. 【Method】 Eight candidate genes were selected from the transcriptome sequencing data of the non-pollination, compatible pollination and incompatible pollination stigma of Ping’ou hybrid hazelnut in authors’ previous study. Four candidate genes were selected from related articles. Eight different tissues or organs, such as the blooming styles, the catkins before elongation, the young leaves, the pollen, the cambium of annual branch, the green stem, the root tip and the sucker of the main cultivar of Ping’ou hybrid hazelnut ‘Dawei’ were used as the samples in reverse transcriptional PCR and real-time qPCR experiments. The expression stability of twelve candidate reference genes was analyzed by geNorm, NormFinder, BestKeeper, Delta Ct and RefFinder programs. 【Result】 Reverse transcriptional PCR showed that the amplification of twelve primers was specific, there were significant differences in the expression of ChaSTP5 and ChaTF in different materials, and the remaining candidate reference genes were expressed in eight tissues. Real-time qPCR showed that the expression of Ch18S rRNA was at the highest level and ChaSTP5 was at the lowest level, and the remaining ten candidate reference genes belong to moderate expression. As for the stability of the candidate genes, ChaSTP5 and ChaTF were the least stable, and the stability of the remaining ten candidate genes was at a moderate level. The results of geNorm, NormFinder, BestKeeper and Delta Ct showed that ChaActin was the most stable reference gene and Ch18S rRNA ranked in the top five, while the ranking of other candidate reference genes was different. The stability analysis indicated that ChaActin and Ch18S rRNA are suitable as reference genes. The pairwise variation (V) calculated by geNorm showed that six reference genes could accurately normalize the date of real-time qPCR. There was a significant correlation between the four programs at 0.01 level, and the correlation between NormFinder and Delta Ct was the highest, Delta Ct and BestKeeper was the lowest. 【Conclusion】 The reference gene screening system for real-time qPCR in Ping’ou hybrid hazelnut was set up including four main steps: primers were screened first by reverse transcriptional PCR, real-time qPCR analysis was based on primer properties and gene expression, primer stability was evaluated using four programs (geNorm, NormFinder, BestKeeper, Delta Ct) and the optimal stable reference gene was selected by the comprehensive analysis of RefFinder. As for the reference genes selection, ChaActin and Ch18S rRNA were ranked as the most stable reference genes in 8 samples.

Ping’ou hybrid hazelnut (C. heterophylla Fisch. × C. avellana L.); quantitative real-time PCR; reference gene; stability; system establishment

2016-10-19；接受日期：2017-02-23

國家自然科學(xué)基金（31500560）、中國林科院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（CAFYBB2016QB002）

聯(lián)系方式：楊丹，E-mail：1508066790@qq.com。通信作者馬慶華，Tel：010-62888537；E-mail：mqhmary@sina.com。通信作者朱利泉，Tel：023-68250794；E-mail：zhuliquan@swu.edu.cn