秦明，王紅芳，劉振國(guó)，王穎，王帥，郗學(xué)鵬，劉春蕾，張衛(wèi)星，胥保華

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018）

中華蜜蜂和意大利蜜蜂耐寒性能差異比較

秦明，王紅芳，劉振國(guó)，王穎，王帥，郗學(xué)鵬，劉春蕾，張衛(wèi)星，胥保華

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271018）

【目的】研究中華蜜蜂(Apis cerana cerana，簡(jiǎn)稱中蜂)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica，簡(jiǎn)稱意蜂)體內(nèi)抗寒系統(tǒng)的組成，為探究中蜂和意蜂耐寒性能的差異提供理論依據(jù)?！痉椒ā吭囼?yàn)選取室外相同環(huán)境條件越冬的中蜂和意蜂各5群，于2015年12月20日每群隨機(jī)選取蜜蜂立即測(cè)定兩者的過冷卻點(diǎn)、冰點(diǎn)，比較其耐寒性能差異。然后分別測(cè)定蜂體游離水、結(jié)合水、脂肪、糖原和蛋白質(zhì)含量以及海藻糖酶的活性。利用高效液相色譜測(cè)定血淋巴中山梨醇、海藻糖、甘露醇的含量。在海藻糖的生物合成通路中確定4個(gè)重要調(diào)控基因，選擇β-action和β-肌動(dòng)蛋白分別作為中蜂和意蜂的內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中蜂和意蜂海藻糖4個(gè)相關(guān)調(diào)控基因在越冬期時(shí)mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異?！窘Y(jié)果】越冬期中蜂和意蜂過冷卻點(diǎn)差異顯著，中蜂的過冷卻點(diǎn)顯著低于意蜂（P＜0.05），但二者冰點(diǎn)沒有顯著性差異(P＞0.05);越冬期中蜂和意蜂蜂體含水量存在顯著差異,中蜂體內(nèi)游離水含量顯著低于意蜂(P＜0.05)，而結(jié)合水含量顯著高于意蜂(P＜0.05);越冬中期蜂體脂肪含量在兩蜂種間差異不顯著(P＞0.05)；中蜂和意蜂蜂體和血淋巴蛋白質(zhì)含量差異不顯著(P＞0.05)；意蜂在越冬期時(shí)體內(nèi)糖原含量明顯低于中蜂，并且差異顯著(P＜0.05)；中蜂血淋巴中甘露醇、山梨醇含量接近于意蜂的兩倍，海藻糖含量也相對(duì)高于意蜂，差異顯著(P＜0.05);中蜂蜂體和血淋巴的海藻糖酶活性均顯著低于意蜂(P＞0.05)；以中蜂為對(duì)照組，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)意蜂的海藻糖酶基因(Tre-2)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)表達(dá)量明顯高于中蜂(P＜0.05)；而基因Tre-1表達(dá)情況相反；海藻糖合成酶基因(TPS)表達(dá)量在中蜂和意蜂體內(nèi)無顯著差異(P＞0.05)?！窘Y(jié)論】與意蜂相比，中蜂能夠通過降低體內(nèi)游離水含量，提高糖原和小分子糖含量，調(diào)節(jié)海藻糖酶活性和相關(guān)基因表達(dá)等方式降低體內(nèi)過冷卻點(diǎn)，提高自身耐寒性能。

中華蜜蜂；意大利蜜蜂；過冷卻點(diǎn)；耐寒性；差異

0 引言

【研究意義】蜜蜂不僅可以給人們提供營(yíng)養(yǎng)豐富的蜂產(chǎn)品，而且在生態(tài)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)作物授粉等方面都發(fā)揮了重要作用，世界上有2/3的農(nóng)作物依賴蜜蜂授粉。蜜蜂是變溫動(dòng)物，其生命活動(dòng)與外界環(huán)境溫度密切相關(guān)。低溫是制約蜂群發(fā)展的主要因素，蜜蜂可以通過生態(tài)適應(yīng)和自身體內(nèi)的生理生化調(diào)節(jié)來應(yīng)對(duì)寒冷環(huán)境，這種蜜蜂抵抗寒冷環(huán)境的能力稱為蜜蜂耐寒性。蜜蜂的耐寒性在品種間存在差異，研究不同品種蜜蜂的耐寒性差異對(duì)耐寒蜂種的選擇培育、區(qū)域飼養(yǎng)品種的選擇等均具有理論和實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】昆蟲耐寒性研究表明，昆蟲可以采取不同的策略來應(yīng)對(duì)寒冷環(huán)境，其抗寒機(jī)制包括降低體內(nèi)含水量[1]、積累脂肪和小分子耐寒物質(zhì)、大分子抗凍蛋白（抗凍蛋白、熱休克蛋白等）的表達(dá)。昆蟲體內(nèi)的化學(xué)物質(zhì)可以相互作用形成耐寒系統(tǒng)，在低溫環(huán)境中，昆蟲可以通過生理生化反應(yīng)啟動(dòng)自身耐寒系統(tǒng)。不同昆蟲的耐寒系統(tǒng)也存在一定差異。梁中貴等[2]報(bào)道了越冬松阿扁葉蜂（Acantholyda posticalis）體內(nèi)抗寒系統(tǒng)為小分子碳水化合物、丙氨酸、甘油、糖蛋白；韓瑞東等[3]報(bào)道了越冬赤松毛蟲（Dendrolimus spectabilis）體內(nèi)抗寒物質(zhì)系統(tǒng)為小分子碳水化合物類、糖蛋白、氨基酸類；孫緒艮等[4]研究證明，越冬桑尺蠖（Phthonadria atrilineata）的抗寒物質(zhì)系統(tǒng)為小分子糖、氨基酸、糖蛋白。除此之外，昆蟲體內(nèi)在越冬期會(huì)積累一些大分子抗凍蛋白（抗凍蛋白AFP、熱激蛋白HSP、脂蛋白等）。HUANG等[5]分離了美洲斑潛蠅（Liriomyza sativa）ls-hsp19.5、ls-hsp20.8、ls-hsp21.7，發(fā)現(xiàn)它們均為其抗寒必需成員，但是響應(yīng)低溫脅迫的強(qiáng)度不同；GRAHAM[6]克隆了多種抗凍蛋白的氨基酸序列，并對(duì)不同來源的抗凍蛋白進(jìn)行比較，分離純化編碼抗凍蛋白的cDNA；BEHROOZI等研究表明，在極地和溫帶地區(qū)一些昆蟲在越冬期時(shí)積累低分子糖或多元醇[7-9]。但是當(dāng)前有關(guān)蜜蜂耐寒性的研究較少，周冰峰等[10]報(bào)道，在氣溫低于14℃的花期，中華蜜蜂（Apis cerana cerana，簡(jiǎn)稱中蜂）出勤數(shù)是意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica，簡(jiǎn)稱意蜂）的3倍。工蜂采集飛行最適溫度為18—30℃，氣溫低于9.5℃，意蜂停止巢外活動(dòng)，低于6.5℃中蜂停止巢外活動(dòng)；李志勇等[11]針對(duì)越冬期東方蜜蜂和西方蜜蜂的過冷卻點(diǎn)（super-cooling point，SCP）進(jìn)行測(cè)試并對(duì)其與越冬性能的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在越冬期，東方蜜蜂過冷卻點(diǎn)明顯低于西方蜜蜂。相比而言，東方蜜蜂對(duì)低溫具有更強(qiáng)的適應(yīng)性和應(yīng)變能力，更易抗寒越冬；常志光等[12]對(duì)不同蜂種越冬后期血淋巴SOD活力與抗寒力進(jìn)行相關(guān)研究，結(jié)果表明卡尼鄂拉蜂（A. m. carnica）與意蜂血淋巴總SOD活力差異顯著，其活力與過冷卻點(diǎn)具有顯著相關(guān)性。【本研究切入點(diǎn)】中蜂和意蜂對(duì)寒冷的適應(yīng)力存在差異，但關(guān)于如何客觀評(píng)價(jià)兩者耐寒性和自身耐寒系統(tǒng)的差異仍缺少深入的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過比較越冬期間中蜂和意蜂過冷卻點(diǎn)、冰點(diǎn)（freezing point，F(xiàn)P）、耐寒物質(zhì)含量、關(guān)鍵酶活性以及基因表達(dá)的不同，客觀評(píng)價(jià)兩者抗寒性差異，為系統(tǒng)建立蜜蜂抗凍耐寒能力的測(cè)定與分析體系提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2015—2016年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院完成。

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)蜂群在11月前人工飼喂越冬飼料，穩(wěn)定群勢(shì)，在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)蜂場(chǎng)室外相同環(huán)境條件進(jìn)行越冬。于2015年12月中旬選取室外越冬的中蜂和意蜂各5群，每群隨機(jī)抽取蜜蜂分別測(cè)定兩者的過冷卻點(diǎn)、冰點(diǎn)、水分、脂肪、糖原、蛋白質(zhì)、小分子糖的含量、海藻糖酶活性及相關(guān)基因表達(dá)的差異。糖原試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）、海藻糖酶試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）、考馬斯亮藍(lán)（A045-2）低溫恒溫槽（DCW-3506型，寧波市海曙天恒儀器廠）和數(shù)據(jù)采集器（TemP32型，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)氣象研究所）、UV-2450紫外分光光度計(jì)、高效液相色譜儀（沃特世公司）、7500 Real-Time PCR儀（ABI 7500，USA）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 過冷卻點(diǎn)、冰點(diǎn)測(cè)定 參考秦玉川等[13]的方法：采用熱電偶方法進(jìn)行過冷卻點(diǎn)測(cè)定，使用的儀器為低溫恒溫槽和數(shù)據(jù)采集器等組成的過冷卻點(diǎn)測(cè)定系統(tǒng)。將溫度探頭置于蜜蜂腹部，并進(jìn)行固定，溫度探頭與計(jì)算機(jī)系統(tǒng)相連置于低溫恒溫槽中，蜂體溫度隨著恒溫箱溫度以2℃·min-1持續(xù)下降，直至蜂體開始結(jié)冰，蜂體釋放潛熱，溫度陡然上升，釋放潛能的起始處記錄的溫度為過冷卻點(diǎn)；蜂體溫度繼續(xù)回升，直到再次下降，此轉(zhuǎn)折點(diǎn)記錄的溫度即冰點(diǎn)[14]。取中蜂和意蜂各30只（每群6只）分別進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 蜂體含水量測(cè)定 從每群中蜂和意蜂蜂群中各取10只，用電子天平（精度0.01 mg）稱量鮮重（FW），然后將蜜蜂樣本放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中65℃，48 h后測(cè)定干重（DW），計(jì)算蜂體的游離水含量=[(FW-DW)/FW]×100%。將測(cè)完游離水的蜂體繼續(xù)放入105℃干燥箱中72 h，測(cè)定質(zhì)量（BW），計(jì)算蜂體的結(jié)合水含量=[(DW-BW)/DW] ×100%。

1.2.3 蜂體脂肪含量測(cè)定 將測(cè)完含水量的蜂體采用氯仿甲醇法用2 mL氯仿-甲醇（2﹕1）溶液勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，勻漿器用1 mL氯仿-甲醇溶液洗2次，離心10 min（3 000 r/min）后倒入新離心管，重復(fù)上一步。加入1.2 mL 1.6% CaCL2，蓋緊搖晃后靜置1 h，并用0.5 mL 2% CaCL2-氯仿-甲醇（3﹕8﹕4）混合液的下層液清洗兩次，轉(zhuǎn)入離心管。離心10 min，將上層液用吸管吸去，并取1 mL 2% CaCL2-氯仿-甲醇（3﹕8﹕4）混合液的上層液輕輕置于離心管下層液。離心10 min，將上層液小心吸去，下層液轉(zhuǎn)入稱過的稱量瓶中，在70℃干燥24 h，稱重即為脂肪質(zhì)量。

1.2.4 蜂體糖原含量測(cè)定 每群取10只蜜蜂，采用糖原含量試劑盒測(cè)定。將蜂體加入0.75 mL提取液充分勻漿，轉(zhuǎn)移至10 mL試管中，然后置于沸水浴中煮沸20 min，隔5 min振搖試管一次，使充分混勻，待蜂體全部溶解后，取出試管冷卻，用蒸餾水定容至5 mL，混勻，紫外分光光度計(jì)620 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.5 小分子糖含量測(cè)定 每群取30只蜜蜂，用毛細(xì)管分別取意蜂和中蜂血淋巴各50 μL于離心管中，加入100 μL 10%三氯乙酸搖勻，3 000 r/min離心3 min后取上清過濾。過濾后的樣品以標(biāo)準(zhǔn)甘露醇、山梨醇、海藻糖溶液作為對(duì)照，采用液相色譜分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 蛋白質(zhì)含量和海藻糖酶活測(cè)定 每群取15只蜜蜂，采用海藻糖酶試劑盒測(cè)定。按照蜂體組織質(zhì)量（g）或血淋巴（mL）﹕提取液體積（mL）為1﹕9的比例，冰浴中勻漿。8 000×g，4℃離心10 min，取上清紫外分光光度計(jì)550 nm測(cè)定。余下蜂體上清可用提取液1﹕9稀釋、血淋巴上清1﹕49稀釋后，用考馬斯亮藍(lán)方法，在紫外分光光度計(jì)595 nm處測(cè)定蛋白濃度。

1.2.7 總RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） 采用qRT-PCR法檢測(cè)海藻糖酶基因（Trehalase-1，Tre-1）、海藻糖酶（Trehalase-2，Tre-2）、海藻糖合成酶基因（Trehalose-6-phosphate Synthase，TPS）和葡萄糖焦磷酸化酶基因（UDP-Glucose Pyrophosphrylase，UGP）的表達(dá)水平。每群選取兩只蜜蜂液氮研磨，Trizol法提取總mRNA，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa：DRR037A）立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA，調(diào)節(jié)樣品cDNA濃度于相同水平后，-20℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR取1 000 ng cDNA加入到20 μL熒光定量體系中，按照熒光定量試劑盒（TaKaRa）操作指南，用7500 Real-Time PCR儀（ABI 7500，USA）檢測(cè)目的基因相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃，10 s；變性95℃，5 s；退火60℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)，熔解曲線添加，1個(gè)循環(huán)。目的基因引物設(shè)計(jì)參考序列來自于NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，以action和β-actin為內(nèi)參，采用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，委托生工生物科技有限公司合成引物，引物序列如表1所示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）和T檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。P＜0.05表示差異顯著。

表1 基因引物序列Table 1 Sequences of gene primers

2 結(jié)果

2.1 越冬期中蜂和意蜂過冷卻點(diǎn)及冰點(diǎn)

越冬期中蜂和意蜂的過冷卻點(diǎn)分別為（-7.58± 0.19）、（-6.88±0.15）℃，冰點(diǎn)分別為（-3.75±0.28）、（-3.50±0.32）℃。同一時(shí)期中蜂的過冷卻點(diǎn)顯著低于意蜂（P＜0.05），但冰點(diǎn)無顯著差異（P＞0.05）。該結(jié)果表明在越冬期中蜂的耐寒能力要優(yōu)于意蜂（圖1）。

2.2 越冬期中蜂和意蜂蜂體含水量

中蜂和意蜂體內(nèi)結(jié)合水含量分別為（4.13±0.33）%和（1.45±0.05）%，兩者差異顯著（P＜0.05）。而游離水含量結(jié)果與結(jié)合水含量相反，中蜂游離水含量（62.03±0.84）%顯著低于意蜂蜂體游離水含量（71.24±0.29）%（P＜0.05）（圖2）。

2.3 越冬期中蜂和意蜂蜂體脂肪、糖原含量

越冬期中蜂和意蜂蜂體脂肪含量沒有顯著差異（P＞0.05），分別為（5.98±1.35）%、（8.79±0.91）%。但是兩者糖原含量差異顯著，中蜂蜂體糖原含量（8.12±0.90）mg·g-1顯著高于意蜂（5.24±0.29）mg·g-1（P＜0.05）（表2）。

圖1 中蜂和意蜂過冷卻點(diǎn)能力Fig. 1 The supercooling ability of A. c. cerana and A. m. ligustica

圖2 中蜂和意蜂蜂體含水量Fig. 2 The content of water in the body of A. c. cerana and A. m. ligustica

表2 中蜂和意蜂蜂體脂肪和糖原含量Table 2 Fat and glycogen content in the body of A. c. cerana and A. m. ligustica

2.4 越冬期中蜂和意蜂蛋白質(zhì)含量

中蜂蜂體和血淋巴蛋白質(zhì)含量分別為（4.14±0.01）、（7.94±0.33）g·L-1；意蜂蜂體和血淋巴蛋白質(zhì)含量分別為（3.65±0.02）、（7.42±0.01） g·L-1，中蜂雖比意蜂蛋白質(zhì)含量高，但沒有達(dá)到顯著水平（P＞0.05）（圖3）。

圖3 中蜂和意蜂蜂體和血淋巴蛋白質(zhì)含量Fig. 3 The content of protein in the body and hemolymph of A. c. cerana and A. m. ligustica

2.5 越冬期中蜂和意蜂血淋巴小分子糖含量

意蜂和中蜂血淋巴甘露醇分別為（3.99±0.09）、（6.72±0.50）mg·mL-1，差異顯著（P＜0.05）；海藻糖濃度為（11.37±0.33）、（15.87±0.28）mg·mL-1，差異顯著（P＜0.05）；山梨醇濃度分別為（4.82± 0.48）、（9.61±0.75） mg·mL-1，差異顯著（P＜0.05）。表明越冬期中蜂血淋巴小分子糖含量明顯高于意蜂（圖4）。

2.6 越冬期中蜂和意蜂海藻糖酶活性

意蜂蜂體海藻糖酶活（13.33±0.15）μg·min-1·mg-1顯著高于中蜂（12.69±0.17）μg·min-1·mg-1（P＜0.05）；血淋巴海藻糖酶活性的結(jié)果與蜂體一致，中蜂與意蜂分別為（6.00±0.01）、（6.43±0.01）μg·min-1·mg-1，差異顯著（P＜0.05）（圖5）。

圖4 中蜂和意蜂蜂體和血淋巴可溶性糖含量Fig. 4 The content of sugar in the body and hemolymph of A. c. cerana and A. m. ligustica

圖5 中蜂和意蜂蜂體和血淋巴海藻糖酶活性Fig. 5 The activity of trehalase in the body and hemolymph of A. c. cerana and A. m. ligustica

2.7 越冬期中蜂和意蜂Tre-1、Tre-2、UGP、TPS表達(dá)水平

采用qRT-PCR法對(duì)中蜂和意蜂海藻糖酶-1（Tre-1）、海藻糖酶-2（Tre-2）、葡萄糖焦磷酸化酶基因（UGP）和海藻糖合成酶基因（TPS）的表達(dá)水平進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明意蜂的Tre-1表達(dá)量明顯低于中蜂（P＜0.05）；意蜂Tre-2表達(dá)量比中蜂顯著升高（P＜0.05）；在海藻糖合成途徑中，越冬時(shí)TPS表達(dá)量在中蜂和意蜂之間沒有顯著差異（P＞0.05）；意蜂UGP表達(dá)量相比于中蜂顯著提高（P＜0.05）（圖6）。

圖6 中蜂和意蜂Tre-1、Tre-2、TPS、UGP表達(dá)水平Fig. 6 The expression level of Tre-1, Tre-2, TPS, UGP of A. c. cerana and A. m. ligustica

3 討論

蜜蜂耐寒性是其越冬性能的重要體現(xiàn)。昆蟲體液可以耐受0℃以下的低溫仍不結(jié)冰，這種現(xiàn)象稱為過冷卻[15]。在許多昆蟲耐寒性的研究中，過冷卻點(diǎn)常作為衡量耐寒性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[16]。過冷卻點(diǎn)是昆蟲體內(nèi)液體結(jié)冰的溫度[17]，研究表明甲蟲的過冷卻點(diǎn)呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性變化，越冬期間過冷卻點(diǎn)顯著降低，因此過冷卻方式是其在低溫下存活的重要策略[18]。本試驗(yàn)研究顯示中蜂過冷卻點(diǎn)顯著低于意蜂，其結(jié)果與李志勇等[11]的測(cè)定結(jié)果一致，說明中蜂的耐寒能力顯著高于意蜂，可以更好地適應(yīng)中國(guó)北方地區(qū)的冬季低溫脅迫而順利越冬，對(duì)其群體的存活和繁殖均有重要意義。

當(dāng)寒冷冬季外界溫度變化時(shí)，昆蟲體內(nèi)的水分狀態(tài)與其抗凍能力有很大關(guān)系，有些昆蟲在越冬前會(huì)降低體內(nèi)含水量或提高結(jié)合水和游離水的比例來增強(qiáng)耐寒性[19-20]。梁中貴等研究顯示松阿扁葉蜂和赤松毛蟲幼蟲在越冬前將體內(nèi)游離水轉(zhuǎn)化為結(jié)合水[2-3]；于令媛等[21]研究表明，在2009年11月至次年3月（越冬期）大草蛉（Chrysopa pallens）預(yù)蛹體內(nèi)含水量與7月份（生長(zhǎng)期）相比顯著降低，其中1月體內(nèi)含水量最低，而7月升至最高。本研究中越冬期中蜂蜂體游離水含量明顯低于意蜂，引起過冷卻點(diǎn)和冰點(diǎn)降低，避免胞內(nèi)和其他重要部位受冷害[22]，與上述研究結(jié)果一致。

脂肪和糖原是昆蟲越冬期間的主要能源物質(zhì)，在冬季溫度降低時(shí)蟲體即開始儲(chǔ)存糖原，以保證順利度過越冬期[23]。本研究中中蜂和意蜂脂肪含量沒有明顯差異，這可能是由于蜜蜂個(gè)體較小所導(dǎo)致的。中蜂蜂體糖原含量在越冬期明顯高于意蜂，并且差異顯著，這與王鵬等[24]的研究結(jié)果相符。ROZSYPAL等[25]研究顯示糖原在越冬期其含量逐漸下降，說明糖原也是衡量越冬昆蟲抗寒能力的一個(gè)重要指標(biāo)，中蜂機(jī)體可以在寒冷條件下轉(zhuǎn)化生成更多的糖原為自身所需供能。

越冬期中蜂和意蜂蜂體和血淋巴蛋白質(zhì)含量均沒有明顯差異，這可能是與試驗(yàn)昆蟲種類有關(guān)，蛋白質(zhì)并不一定是蜜蜂越冬供能的主要物質(zhì)。越冬期間許多昆蟲體內(nèi)聚集低分子量的糖（醇）等小分子抗寒物質(zhì)，如葡萄糖、山梨醇、甘露醇、海藻糖等以及氨基酸和脂肪酸等物質(zhì)[26-27]。試驗(yàn)測(cè)定在越冬期中蜂血淋巴山梨醇、甘露醇以及海藻糖的含量明顯高于意蜂，并且差異顯著，這與陳永杰等[28]報(bào)道的桑螟（Diaphania pyloalis）越冬幼蟲在越冬初期至越冬后期海藻糖、果糖、甘露醇、山梨醇的含量在血淋巴內(nèi)含量顯著上升的結(jié)果相符。說明中蜂相對(duì)于意蜂在越冬期體內(nèi)積累更多小分子抗寒物質(zhì)，便于順利越冬。但是這些物質(zhì)的變化是通過增加體內(nèi)含水量，還是直接通過與酶或其他蛋白質(zhì)共同作用起到耐寒的功能還有待于進(jìn)一步研究。

作為昆蟲體內(nèi)重要的血糖，海藻糖存在于昆蟲幾乎所有的組織和器官中[29]，而血淋巴海藻糖含量的變化對(duì)于昆蟲調(diào)控碳水化合物的攝取以及體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的動(dòng)態(tài)平衡具有重要作用[30]。由于海藻糖結(jié)構(gòu)相當(dāng)穩(wěn)定，能在細(xì)胞表面形成特殊的保護(hù)膜，有效地保護(hù)生物分子結(jié)構(gòu)，從而能夠使生物體在寒冷、高溫、干燥失水等惡劣條件下還能有效維持生命活動(dòng)及生物特征。海藻糖酶是海藻糖代謝過程中一個(gè)重要的酶，特異性地將一分子海藻糖水解為兩分子葡萄糖而被昆蟲利用[31]。中蜂蜂體和血淋巴海藻糖酶活性均顯著低于意蜂，表明在越冬期寒冷條件下，中蜂通過降低海藻糖酶活性積累更多的海藻糖，從而在寒冷冬季到來時(shí)釋放更多葡萄糖。在昆蟲海藻糖合成代謝過程中，研究比較深入的是6-磷酸海藻糖合成酶（TPS）合成途徑。主要過程由海藻糖合成酶（TPS）催化尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-G）和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，然后在6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（TPP）催化下形成海藻糖，其中UDP-G由尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）催化而成[32]。分解途徑是由海藻糖酶專一性分解為兩分子的葡萄糖[27]。其中海藻糖酶有兩種，一種為可溶型（Tre-1），另一種為膜結(jié)合型（Tre-2）。本研究顯示在合成途徑中中蜂TPS表達(dá)量高于意蜂，但是差異不顯著；然而意蜂UGP表達(dá)量相比于中蜂顯著提高，這可能是因?yàn)樵谠蕉捌谥蟹浞e累海藻糖含量已經(jīng)足夠抵御當(dāng)時(shí)低溫環(huán)境，相反意蜂還需要合成更多的海藻糖，導(dǎo)致UGP表達(dá)更加活躍。中蜂Tre-1表達(dá)量上調(diào)的結(jié)果與鄔夢(mèng)靜等[33]試驗(yàn)結(jié)論一致：海藻糖酶基因在低溫下上調(diào)，表明其能夠通過控制昆蟲海藻糖的含量來調(diào)控抗寒過程。有兩種可能：一是在越冬期海藻糖酶活性升高，加速海藻糖分解為葡萄糖供能；二是由于TPS表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致的。而中蜂Tre-2表達(dá)量略低，說明這兩種酶在其中行使功能可能不同，這與秦資[34]關(guān)于異色瓢蟲（Harmonia axvridis）海藻糖酶基因低溫處理的變化結(jié)果相符。在越冬期間，Tre-1和Tre-2的表達(dá)與TPS表達(dá)相互調(diào)節(jié)，使昆蟲體內(nèi)海藻糖含量達(dá)到相對(duì)平衡。而Tre-1和Tre-2的表達(dá)差異可能與其催化效率不同有關(guān)。對(duì)于TPS、Tre-1、Tre-2三者之間的相互協(xié)調(diào)機(jī)制還需要進(jìn)一步的深入研究。

4 結(jié)論

越冬期間中蜂的過冷卻點(diǎn)顯著低于意蜂，中蜂體內(nèi)游離水含量降低、糖原等小分子糖含量的提高與抗寒性強(qiáng)弱密切相關(guān)，是越冬后期其群勢(shì)和存活率高于意蜂的重要原因。Tre-1、Tre-2、TPS、UGP的表達(dá)證實(shí)海藻糖在蜜蜂越冬過程中具有重要作用。

[1] 宋昌云, 肖鐵光, 譚九洲. 長(zhǎng)沙地區(qū)中華蜜蜂抗寒性研究. 作物研究, 2015, 29(3): 290-292.

SONG C Y, XIAO T G, TAN J Z. Research of cold resistance of Apis cerana cerana in Changsha reigon. Crop Research, 2015, 29(3): 290-292. (in Chinese)

[2] 梁中貴, 張衛(wèi)光, 劉學(xué)輝, 孟慶英, 孫緒艮. 松阿扁葉蜂越冬幼蟲體內(nèi)抗寒物質(zhì)分析. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2005, 42(6): 695-699.

LIANG Z G, ZHANG W G, LIU X H, MENG Q Y, SUN X G. Cold-hardiness analysis of over-wintering larva of Acantholyda posticalis. Chinese Bulletin of Entomology, 2005, 42(6): 695-699. (in Chinese)

[3] 韓瑞東, 孫緒艮, 許永玉, 張衛(wèi)光. 赤松毛蟲越冬幼蟲生化物質(zhì)變化與抗寒性的關(guān)系. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2005, 25(6): 1352-1356.

HAN R D, SUN X G, XU Y Y, ZHANG W G. The biochemical mechanism of cold-hardiness in overwintering larva of Dendrolimus spectabilis Butler (Lepidoptera: Lasiocampidae). Acta Ecologica Sinica, 2005, 25(6): 1352-1356. (in Chinese)

[4] 孫緒艮, 郭慧玲, 李恕廷, 王興華. 桑尺蠖越冬幼蟲的耐寒性研究.蠶業(yè)科學(xué), 2000, 26(3): 129-133.

SUN X G, GUO H L, LI S T, WANG X H. Study on cold hardiness of overwintering larvae, Phthonandria atrilineata Butler. Science of Sericulture, 2000, 26(3): 129-133. (in Chinese)

[5] HUANG L H, WANG C Z, KANG L. Cloning and expression of five heat shock protein genes in relation to cold hardening and development in the leafminer, Liriomyza sativa. Journal of Insect Physiology, 2009, 55(3): 279-285.

[6] GRAHAM L A, LIOU Y C, WALKER V K, DAVIES P L. Hyperactive antifreeze protein from beetles. Nature, 1997, 388(6644): 727-728.

[7] BEHROOZI E, IZADI H, SAMIH M A, MOHARAMIPOUR S. Physiological strategy in overwintering larvae of pistachio white leaf borer, Ocneria terebinthina Strg. (Lepidoptera: Lymantriidae) in Rafsanjan, Iran. Italian Journal of Zoology, 2012, 79(1): 44-49.

[8] BEMANI M, IZADI H, MAHDIAN K, KHANI A, SAMIH M A. Study on the physiology of diapause, cold hardiness and supercooling point of overwintering pupae of the pistachio fruit hull borer, Arimania comaroffi. Journal of Insect Physiology, 2012, 58(7): 897-902.

[9] SADEGHI R, IZADI H, MAHDIAN K. Energy allocation changes in overwintering adults of the common pistachio psylla, Agonoscena pistaciae Burckhardt & Lauterer (Hemiptera: Psyllidae). NeotropicalEntomology, 2012, 41(6): 493-498.

[10] 周冰峰, 許正鼎. 蜜蜂低溫采集活動(dòng)的研究. 中國(guó)蜂業(yè), 1988(5): 7-9.

ZHOU B F, XU Z D. Study on low temperature collection of bee. Apiculture of China, 1988(5): 7-9. (in Chinese)

[11] 李志勇, 薛運(yùn)波, 王志, 常志光. 東西方蜜蜂越冬期過冷卻點(diǎn)的測(cè)試及過冷與越冬性能的關(guān)系. 蜜蜂雜志, 2006(11): 12-13.

LI Z Y, XUE Y B, WANG Z, CHANG Z G. Study on the supercooling point of honeybees and the relationship between the supercooling point and the cold resistance. Journal of Bee, 2006(11): 12-13. (in Chinese)

[12] 常志光, 牛慶生, 閆德斌, 王志, 王海全. 不同蜜蜂品種越冬后期血淋巴總SOD活力與抗寒力的相關(guān)性研究. 中國(guó)蜂業(yè), 2015, 66(3): 16-18.

CHANG Z G, NIU Q S, YAN D B, WANG Z, WANG H Q. Different species of bee hemolymph late winter and cold hardiness total SOD activity relationships. Apiculture of China, 2015, 66(3): 16-18. (in Chinese)

[13] 秦玉川, 楊建才. 一種便攜式測(cè)定昆蟲過冷卻點(diǎn)的方法. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2000, 37(4): 236-238.

QIN Y C, YANG J C. A new simple method to test insect super-cooling point. Chinese Bulletin of Entomology, 2000, 37(4): 236-238. (in Chinese)

[14] OUYANG F, LIU Z, YIN J, SU J, WANG C, GE F. Effects of transgenic Bt cotton on overwintering characteristics and survival of Helicoverpa armigera. Journal of Insect Physiology, 2011, 57(1): 153-160.

[15] 張瑞, 馬紀(jì). 昆蟲過冷卻點(diǎn)的影響因素概述. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 19(11): 76-84.

ZHANG R, MA J. Insect supercooling point and its influence factors. Tianjin Agricultural Sciences, 2013, 19(11): 76-84. (in Chinese)

[16] COLINET H, RENAULT D, HANCE T, VERNON P. The impact of fluctuating thermal regimes on the survival of a cold-exposed parasitic wasp, Aphidius colemani. Physiological Entomology, 2006, 31(3): 234-240.

[17] MOREY A C, HUTCHISON W D, VENETTE R C, BURKNESS E C. Cold hardiness of Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) pupae. Environmental Entomology, 2012, 41(1): 172-179.

[18] KO?TáL V, MIKLAS B, DOLE?AL P, ROZSYPAL J, ZAHRADNICKOVA H. Physiology of cold tolerance in the bark beetle, Pityogenes chalcographus and its overwintering in spruce stands. Journal of Insect Physiology, 2014, 63: 62-70.

[19] WOLFE J, BRYANT G, KOSTER K L. What is ‘unfreezable water’, how unfreezable is it and how much is there? CryoLetters, 2002, 23(3): 157-166.

[20] BLOCK W, ZETTEL J. Activity and dormancy in relation to body water and cold tolerance in a winter active springtail (Collembola). European Journal of Entomology, 2003, 100: 305-312.

[21] 于令媛, 時(shí)愛菊, 鄭方強(qiáng), 盧虹, 張帆, 許永玉. 大草蛉預(yù)蛹耐寒性的季節(jié)性變化. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(9): 1723-1730.

YU L Y, SHI A J, ZHENG F Q, LU H, ZHANG F, XU Y Y. Seasonal changes in the cold hardiness of Chrysopa pallens (Rambur) prepupa. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(9): 1723-1730. (in Chinese)

[22] HORTON D R, LEWIS T M, NEVEN L G. Reduced cold-hardiness of pear psylla (Homoptera: Psyllidae) caused by exposure to external water and surfactants. The Canadian Entomologist, 1996, 128(5): 825-830.

[23] 景曉紅, 康樂. 昆蟲耐寒性的測(cè)定與評(píng)價(jià)方法. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2004, 41(1): 7-10.

JING X H, KANG L. Overview and evaluation of research methodology for insect cold hardiness. Chinese Bulletin of Entomology, 2004, 41(1): 7-10. (in Chinese)

[24] 王鵬, 凌飛, 于毅, 張安盛, 門興元, 李麗莉, 許永玉. 桃小食心蟲越冬幼蟲過冷卻能力及體內(nèi)生化物質(zhì)動(dòng)態(tài). 生態(tài)學(xué)報(bào), 2011, 31(3): 638-645.

WANG P, LING F, YU Y, ZHANG A S, MEN X Y, LI L L, XU Y Y. The dynamics of super-cooling ability and biochemical substances in the overwintering Carposina niponensi Walsingham (Lepidoptera: Carposinidae) larvae. Acta Ecologica Sinica, 2011, 31(3): 638-645. (in Chinese)

[25] ROZSYPAL J, KOSTAL V, ZAHRADNICKOVA H, ?IMEK P. Overwintering strategy and mechanisms of cold tolerance in the codling moth (Cydia pomonella). PLoS ONE, 2013, 8(4): e61745.

[26] LEE R J, DENLINGER D L. Insects at Low Temperature. New York: Chapman and Hall, 1991: 17-46.

[27] LI Y P, GONG H, PARK H Y. Biochemistry and physiological overwintering in the mature larvae of the pine needle gall midge, Ccodiplosis joponensis. Cryo Letters, 2000, 21(3): 149-156.

[28] 陳永杰, 孫緒艮, 張衛(wèi)光, 郭彥彥, 牟志剛, 郭光智. 桑螟越冬幼蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物的變化與抗寒性的關(guān)系. 蠶業(yè)科學(xué), 2005, 31(2): 111-116.

CHEN Y J, SUN X G, ZHANG W G, GUO Y Y, MU Z G, GUO G Z. Relationship between variation of protein, amino acid, low-molecular carbohydrate in over-wintering Diaphania pyloalis Walker larvae and cold-hardiness. Science of Sericulture, 2005, 31(2): 111-116. (in Chinese)

[29] 于彩虹, 盧丹, 林榮華, 王曉軍, 姜輝, 趙飛. 海藻糖—昆蟲的血糖. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 2008, 45(5): 832-837.

YU C H, LU D, LIN R H, WANG X J, JIANG H, ZHAO F. Trehalose-the blood sugar in insects. Chinese Bulletin of Entomology, 2008, 45(5): 832-837. (in Chinese)

[30] THOMPSON S N. Trehalose-the insect ‘blood’ sugar. Advances in Insect Physiology, 2003, 31: 205-285.

[31] 秦加敏, 羅術(shù)東, 和紹禹, 吳杰. 昆蟲海藻糖與海藻糖酶的特性及功能研究. 環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào), 2015, 37(1): 163-169.

QIN J M, LUO S D, HE S Y, WU J. Researching in characters and functions of trehalose and trehalase in insects. Journal of Environmental Entomology, 2015, 37(1): 163-169. (in Chinese)

[32] KLOWDEN M J. Physiological Systems in Insects. Burlington: Elsevier Inc. Academic Press, 2007: 293-356.

[33] 鄔夢(mèng)靜, 徐青葉, 劉雅, 施興榮, 沈祺達(dá), 楊萌萌, 王世貴, 唐斌.異色瓢蟲低溫脅迫下過冷卻點(diǎn)變化及抗寒基因表達(dá)分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49(4): 677-685.

WU M J, XU Q Y, LIU Y, SHI X R, SHEN Q D, YANG M M, WANG S G, TANG B. The super cooling point change of Harmonia axyridis under low temperature stress and its cold-resistance genes’ expression analysis. Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(4): 677-685. (in Chinese)

[34] 秦資. 異色瓢蟲TPS與Treh1基因低溫誘導(dǎo)表達(dá)分析[D]. 杭州: 杭州師范大學(xué), 2012.

QIN Z. The expression analysis of TPS and Treh1 genes under cold induction in Harmonia axvridis. Hangzhou: Hangzhou Normal University, 2012. (in Chinese)

（責(zé)任編輯 岳梅）

Comparison of Different Cold Resistance Between Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica

QIN Ming, WANG HongFang, LIU ZhenGuo, WANG Ying, WANG Shuai, CHI XuePeng, LIU ChunLei, ZHANG WeiXing, XU BaoHua
(College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong)

【Objective】 The objective of this research is to study the composition of cold resistance system in Apis cerana cerana and Apis mellifera ligustica, and to provide a theoretical basis for the study of the differences of cold resistance between the two species. 【Method】Five A. c. cerana colonies and five A. m. ligustica colonies which overwintered under the same equivalent environment were randomly selected with 10-25 bees in each colony on December 20th, 2015. The supercooling point (SCP) and freezing point (FP) were measured immediately, and their cold tolerance were compared. The free water, bound water, fat, glycogen, protein and the trehalase activities were determined, respectively. Four important regulatory genes were sure through the biosynthetic pathway of trehalose. The relative expression of the four important regulatory genes at mRNAlevel were detected by real-time fluorescent quantitative PCR in over-wintering period. 【Result】 Compared with A. m. ligustica, the super-cooling point was significantly higher than A. c. cerana (P＜0.05). The freezing point showed no obvious difference (P＞0.05). The free-water content of A. c. cerana was significantly lower than A. m. ligustica (P＜0.05), by contrast the bound-water content of A. c. cerana was obviously higher than A. m. ligustica (P＜0.05). There was no obvious difference in the fat content between A. cerana cerana and A. m. ligustica (P＞0.05). There were no significant differences in the protein content of two bee species (P＞0.05); glycogen content of A. c. cerana had significantly increased than A. mellifera ligustica in mid-winter (P＜0.05). The mannitol, sorbic alcohol content of A. c. cerana was twice as that of A. m. ligustica in the hemolymph (P＜0.05). The content of trehalose in A. c. cerana was obviously higher than A. m. ligustica (P＜0.05). The trehalase activity of A. c. cerana significantly reduced compared with A. m. ligustica in the body and hemolymph (P＜0.05). Compared with A. c. cerana, the relative expression levels of Tre-2 and UGP had significantly increased in A. m. ligustica (P＜0.05), but Tre-1 was obviously lower (P＜0.05). There was no obvious difference in the relative expression levels of TPS between A. c. cerana and A. m. ligustica (P＞0.05).【Conclusion】A. c. cerana decreases supercooling point by reducing the content of free water, increasing the content of glycogen and low molecular sugar, regulating trehalase activity related genes expression to increase its cold resistance.

Apis cerana cerana; Apis mellifera ligustica; super-cooling point (SCP); cold resistance; difference

2016-12-14；接受日期：2017-03-10

國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-45）、山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目“優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)蜜蜂及蠶桑新品種培育”（2014-2016）

聯(lián)系方式：秦明，E-mail：736906976@qq.com。通信作者胥保華，E-mail：bhxu@sdau.edu.cn