王孜一，戴新華，劉照，李紅梅，王紹利

(1.中國計量科學研究院，北京 100013； 2.常州市計量測試技術(shù)研究所，江蘇常州 213164)

血清中皮質(zhì)醇成分分析標準物質(zhì)的研制＊

王孜一1，2，戴新華1，劉照1，李紅梅1，王紹利2

(1.中國計量科學研究院，北京 100013； 2.常州市計量測試技術(shù)研究所，江蘇常州 213164)

皮質(zhì)醇是一種重要的腎上腺皮質(zhì)激素，同時也是一種重要的臨床診斷標志物，為保證檢測結(jié)果具有溯源性、可比性和準確性，研制了血清中皮質(zhì)醇成分分析標準物質(zhì)。對血清樣品進行分離、過濾、混勻、分裝，進行均勻性檢驗、穩(wěn)定性考察和定值分析。采用超高效液相色譜-同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-ID-MS/MS)法進行定值，混合健康男性血清和健康女性血清中皮質(zhì)醇的定值結(jié)果分別為107.63 ng/g(U=1.44 ng/g，k=2)， 92.24 ng/g (U=1.68 ng/g，k=2)。采用CCQM-K63a比對樣品對定值方法進行驗證，測量結(jié)果在該比對參考值的不確定度范圍內(nèi)。研制的皮質(zhì)醇成分分析標準物質(zhì)符合國家一級標準物質(zhì)技術(shù)要求。

血清；皮質(zhì)醇；標準物質(zhì)；同位素稀釋質(zhì)譜法

AbstractHydrocortisone is an important kind of adrenocortical hormone，as well as an important kind of clinical diagnosis marker. For the purpose of the traceability，comparability and accuracy of detection results，hydrocortisone reference material was developed. Serum was filtrated, mingled and packed, and the value determination, homogeneity examination and stability investigation were conducted. The certi fied value of reference material was determined by ultra high performance liquid chromatography-isotope dilution tandem mass spectrometry (HPLC-ID-MS/MS). The content of hydrocortisone in healthy male and health female serum determined by this method were 107.63 ng/g (U=1.44 ng/g，k=2) and 92.24 ng/g (U=1.68 ng/g，k=2)，respectively. Meanwhile, the method was veri fied by the comparison sample of CCQM-K63a and the measured value was within the range of uncertainty of this comparison’s reference value. Experimental results showed that, serum hydrocortisone component analysis reference material met the requirements of technical norm of national primary reference material.

Keywordsserum; hydrocortisone; reference material; isotope dilution mass spectrometry

皮質(zhì)醇是一種重要的腎上腺皮質(zhì)激素［1］，在體液循環(huán)中大部分與蛋白質(zhì)鍵合。皮質(zhì)醇不僅對調(diào)節(jié)人體中脂肪和蛋白質(zhì)的代謝發(fā)揮重要作用，而且對免疫系統(tǒng)和其它內(nèi)分泌系統(tǒng)亦發(fā)揮重要作用［2］。在當前臨床醫(yī)學和藥物學的研究中，皮質(zhì)醇是一種非常重要的臨床診斷標志物，臨床上常以血清中皮質(zhì)醇濃度作為篩選腎上腺皮質(zhì)功能異常的首選指標。如果血清中皮質(zhì)醇水平升高，則反映出常見疾病有腎上腺皮質(zhì)功能亢進、雙測腎上腺皮質(zhì)增生或腫瘤等，另外非腎上腺疾病，如慢性肝病、妊娠及雌激素治療等也會引起血清中皮質(zhì)醇的增高；如果血清中皮質(zhì)醇降低則反映出腎上腺皮質(zhì)功能減退、垂體功能減退等。因此準確測定血清中皮質(zhì)醇的含量，對于臨床正確診斷腎上腺功能尤為重要。血清中皮質(zhì)醇的常規(guī)檢測方法有免疫分析法［3-4］、液相色譜法［5-7］、氣相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用法［8-9］、液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用法［10-12］。不同檢測方法得到的測量結(jié)果有較大的差異，為了實現(xiàn)測量結(jié)果的準確性和可比性，需要建立完善的臨床檢驗量值溯源體系，其中標準物質(zhì)的研制就是量值溯源體系建立過程中的重要環(huán)節(jié)。

目前國內(nèi)尚無血清中皮質(zhì)醇成分分析標準物質(zhì)。為了滿足臨床檢測需求，筆者研制了血清中皮質(zhì)醇成分分析標準物質(zhì)(以下簡稱血清中皮質(zhì)醇標準物質(zhì))。采用超高液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法(UPLC-ID-MS/MS)［10，12-13］結(jié)合單點校正法［14］，按照ISO Guide35［15］和JJG 1006-1994 《國家一級標準物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》［16］的要求對血清中皮質(zhì)醇標準物質(zhì)樣品進行均勻性檢驗和穩(wěn)定性考察，然后定值并對定值結(jié)果的不確定度進行了評定。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：Xevo TQS型，美國Waters公司；

固相萃取柱：Sep-Pak C18Catridges (500 mg)，美國Waters公司；

氮吹儀：美國Organomation公司；

電子天平：XP205型，最小分度值為0.01 mg，瑞士METTLER TOLEDO公司；

渦 旋 振 蕩 器：Touch Mixer MT-51型，日 本Yamata公司；

超聲波清洗機：Branson5510型，美國Branson公司；

純 水 處 理 系 統(tǒng)：Mill-Q Academic型，法 國Millipore公司；

移液器：20,200,1 000，5 000 μL，德國 Eppendorf公司；

甲醇、乙腈、乙酸乙酯：色譜級，德國Merck公司；甲酸：質(zhì)譜級，美國Sigma公司；

皮質(zhì)醇純品：采用質(zhì)量平衡法進行定值，確定其純度為(99.0±0.4)%，德國Dr公司；

皮質(zhì)醇同位素標記物 (［9，11，12，12-D4］皮質(zhì)醇)：標示純度大于98%，美國劍橋?qū)嶒炇遥?/p>

血清樣品：-70℃冰凍保存，北京安貞醫(yī)院和軍事醫(yī)學科學院提供。

1.2 皮質(zhì)醇純度的確定

采用質(zhì)量平衡法對皮質(zhì)醇純品進行純度測定，并采用定量核磁法進行了驗證，經(jīng)過均勻性檢驗和穩(wěn)定性考察，最終得到其純度值。

1.3 標準溶液和內(nèi)標溶液的配制

標準溶液和內(nèi)標溶液為皮質(zhì)醇和[9,11,12,12-D4]皮質(zhì)醇的無水甲醇溶液，均為重量法配制。配制成質(zhì)量分數(shù)為1.0 mg/g的標準儲備溶液，于-20℃下密封保存。

1.4 血清皮質(zhì)醇標準物質(zhì)制備

1.4.1 血液的采集與檢驗

血清原料由安貞醫(yī)院和軍事醫(yī)學科學院提供，分為健康男性血清和健康女性血清。對獻血者進行血型及5項指標(艾滋、梅毒、乙肝、丙肝、轉(zhuǎn)氨酶)檢測，均合格。

1.4.2 血清的分離

血液采集后在室溫放置2 h，再在4℃下放置4～6 h以保證血液充分凝固，剔除溶血或乳糜血。血清分離采用低溫大容量血液離心機以3 500 r/min離心2次，每次10 min。小心將血清移入另一不含任何添加劑或抗凝劑的采血袋中，于-20℃保存，以備血清混合和后續(xù)工藝。

1.4.3 血清的混合

將預定數(shù)量符合要求的血清融化混合，放入相應體積容器(如5 L大立瓶，此容器應按照嚴格程序進行清洗和滅菌除熱原)，混合時間不少于30 min，以保證充分混勻。

1.4.4 去除蛋白質(zhì)

將混勻后的血清無菌轉(zhuǎn)入已處理的離心瓶，采用高速冷凍離心機，以6 000 r/min，于4℃下離心30 min，以去除纖維蛋白等固形物質(zhì)。小心收集離心上清液，必要時可進行再離心以保證完全清除纖維蛋白等固形物質(zhì)。

1.4.5 除菌過濾分裝

除菌過濾和分裝在百級分裝間進行，嚴格按血液生物制品的除菌分裝程序操作?；旌虾蟮难逑群蠼?jīng)0.45μm和0.22 μm濾膜過濾至大立瓶，大立瓶放在攪拌器上進行攪拌，以防止血清上下分層造成不均勻。血清經(jīng)過濾后采用5 mL凍存管分裝，每支裝2.5 mL血清，分裝完畢2 h內(nèi)凍存于-70℃冰箱中。

1.5 儀器條件

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱：ACQUIT UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國 Waters公司)；流動相：甲醇 -為含0.1%的甲酸水溶液(體積比60∶40)，等度洗脫，流量為0.4 mL/min；進樣體積：5 μL ；運行時間：3.5 min。

1.5.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)對樣品進行離子化；在正離子模式下進行掃描；毛細管電壓：2.90 kV；錐孔電壓：16 V；脫溶劑氣體：N2，溫度為400℃，流速為1 000 L/h；錐孔氣流量：150 L/h；噴霧器壓力：7.0×105Pa；采用多反應離子監(jiān)測(MRM)方式，皮質(zhì)醇和皮質(zhì)醇同位素的母離子分別為m/z363.22，367.29；選擇相應的子離子m/z121.06，121.14作為定量離子對血清中皮質(zhì)醇含量進行測定。

2 均勻性檢驗

根據(jù)JJG 1006-1994［16］和JJG 1343-2012［17］對研制的標準物質(zhì)進行均勻性檢驗。抽樣檢驗方法：從血清中隨機抽取11個包裝，進行瓶間均勻性檢驗；每一瓶分別取3個子樣，每個子樣測量3次，進行瓶內(nèi)均勻性檢驗。兩種血清的均勻性檢驗結(jié)果見表1。

男性血清中皮質(zhì)醇含量總平均值=107.632，F(xiàn)=1.13 ；F0.05(10，22)=2.75，F(xiàn)＜F0.05(10，22)。

女性血清中皮質(zhì)醇含量總平均值=92.234，F(xiàn)=0.58 ；F0.05(10，22)=2.75，F(xiàn)＜F0.05(10，22)。

表1 血清中皮質(zhì)醇標準物質(zhì)均勻性檢驗結(jié)果 μg/g

根據(jù)JJG 1006-1994［16］和JJG 1343-2012［17］中的要求，采用F檢驗法對研制的標準物質(zhì)進行均勻性檢驗，通過比較組間方差和組內(nèi)方差，二者的比值小于統(tǒng)計檢驗的臨界值，故兩種血清中的皮質(zhì)醇含量是均勻的。

3 穩(wěn)定性考察

根據(jù)標準物質(zhì)研制技術(shù)規(guī)范的要求，考察樣品在-70℃下的長期穩(wěn)定性。一級標準物質(zhì)的穩(wěn)定性應在12個月以上。長期穩(wěn)定性是樣品在規(guī)定的保存條件下，按先密后疏的原則，用UPLC-ID-MS/MS同位素稀釋質(zhì)譜法采取同步穩(wěn)定性評估的方法對在 -70℃儲存 1，3，6，12 個月的樣品進行抽樣，檢測其含量的變化。短期穩(wěn)定性是在(-20±5)℃及(4±5)℃溫度范圍內(nèi)，采取同步穩(wěn)定性評估的方法，用HPLC-ID-MS/MS法分別對儲存4周和7天的樣品進行穩(wěn)定性監(jiān)測。凍融性試驗是采取同步穩(wěn)定性評估的方法，用HPLC-ID-MS/MS法分別對凍融1次和2次的樣品進行穩(wěn)定性監(jiān)測。一般每次取2包裝，每個包裝取3個子樣，測3次，取平均值。兩種血清的穩(wěn)定性考察結(jié)果見表2。

血清中皮質(zhì)醇樣品經(jīng)過12個月的穩(wěn)定性考察，在不同時間的測量結(jié)果采用趨勢分析，即線性擬合。對表3數(shù)據(jù)進行分析計算。利用穩(wěn)定性評估基本模型公式Y(jié)=β0－β1X，經(jīng)過計算得各參數(shù)值見表3。

由表3數(shù)據(jù)可知，對于男性血清和女性血清，均有|β1|＜ts(β1)，可見研制的標準物質(zhì)在 12 個月內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 血清中皮質(zhì)醇的穩(wěn)定性考察結(jié)果 μg/g

表3 血清中皮質(zhì)醇的長期穩(wěn)定性考察結(jié)果

4 定值

采用UPLC-ID-MS/MS方法測量血清中皮質(zhì)醇的濃度，分別隨機抽取研制2種不同血清標準物質(zhì)樣品各11支，每支樣品分別取3個子樣，進行樣品前處理。測定時采用單點校準法［12］，每個樣品與其標準同一批測定，分析時以標準、樣品、標準、樣品的順序進樣，每個樣品用前一個標準校準，每個標準及樣品重復進樣測定3次，以所得結(jié)果的均值作為該樣品的測量結(jié)果，血清中皮質(zhì)醇濃度的標準值為11支樣品測量值的平均值。

4.1 樣品前處理

將血清樣品從-70℃冰箱中取出，放置于室溫平衡2 h，輕微振蕩混合均勻，避免產(chǎn)生氣泡。用取樣器取下層無氣泡的血清0.5 mL加入10 mL離心管中稱量，根據(jù)血清樣品中皮質(zhì)醇的濃度，向樣品中加入皮質(zhì)醇內(nèi)標溶液，使其中皮質(zhì)醇與內(nèi)標物的比接近1∶1，稱量質(zhì)量。血清樣品中加入6 mL 0.5 mol/L的磷酸調(diào)節(jié)pH值至1.5，靜置，在室溫下平衡1 h。平衡后，用固相萃取(SPE)柱分離血清中的皮質(zhì)醇。SPE柱先用5 mL甲醇和5 mL水活化，然后以3～4 mL/min的速度上樣，用12 mL水和5 mL水-乙腈(體積比80∶20)淋洗，最后用2 mL甲醇洗脫，洗脫液在40℃下氮氣吹干，用0.5 mL水復溶后，以1 mL乙酸乙酯萃取2次，將兩次萃取液合并，在40℃下用氮氣吹干。然后用2.5 mL流動相復溶，充分渦旋以保證完全溶解。用0.22 μm有機膜過濾，移至色譜分析瓶中，將樣品進行HPLC-MS/MS分析，色譜圖見如圖1。

圖1 血清樣品的MRM色譜圖

4.2 方法確認

采用定值方法對CCQM-K63a比對樣品(其比對結(jié)果的參考值為100.46 ng/g，擴展不確定度為1.83 ng/g)進行測定，測定結(jié)果為100.28 ng/g，相對偏差為0.42%，測量結(jié)果在比對參考值的不確定度范圍內(nèi)，證明定值方法的準確性良好。

4.3 方法檢出限和定量限

采用儀器自帶數(shù)據(jù)處理軟件計算出不同濃度血清中皮質(zhì)醇樣品的信噪比，逐漸稀釋樣品至信噪比S/N=10時，根據(jù)稀釋倍數(shù)計算出血清中皮質(zhì)醇的質(zhì)量分數(shù)，計算得該方法的定量限為LOQ=0.05 ng/g；當稀釋至S/N=3時，計算得檢出限為LOD=0.014 ng/g。

4.4 定值結(jié)果

男性血清和女性血清中皮質(zhì)醇含量不同，經(jīng)過測量和計算，兩種不同血清中皮質(zhì)醇定值結(jié)果見表4。

表4 血清中皮質(zhì)醇標準物質(zhì)定值結(jié)果

5 定值結(jié)果的不確定度評定

根據(jù)ISO，EURACHEM導則和測量不確定度評定與表示，對血清中皮質(zhì)醇測量結(jié)果的不確定度進行評定。

5.1 不確定度來源

血清中皮質(zhì)醇標準物質(zhì)定值結(jié)果的不確定度由3部分組成：標準物質(zhì)的不均勻性引入的不確定度ubb；標準物質(zhì)的不穩(wěn)定性引入的不確定度uls；標準物質(zhì)定值過程引入的不確定度uchar。

5.2 不確定度分量

(1) 標準物質(zhì)定值的不確定度由儀器測量重復性引入的A類不確定度uA和樣品稱量、標準配制、純品標準物質(zhì)引入的B類不確定度uB合成得到，

(2) 均勻性引入的不確定度，用方差分析法進行計算，得到標準物質(zhì)均勻性引入的不確定度ubb。

(3) 穩(wěn)定性引入的不確定度，血清中皮質(zhì)醇的穩(wěn)定性考察結(jié)果表明血清中皮質(zhì)醇在考察期間是穩(wěn)定的。采用趨勢分析進行計算，得到標準物質(zhì)穩(wěn)定性引入的不確定度uls。

各不確定度分量評定結(jié)果見表5。

表5 定值不確定度分量評定結(jié)果 ng/g

5.3 不確定度合成

表6 血清中皮質(zhì)醇標準物質(zhì)的標準值和不確定度 ng/g

6 結(jié)論

(1)研制血清皮質(zhì)醇標準物質(zhì)，采用超高效液相色譜-同位素稀釋質(zhì)譜法對該標準物質(zhì)進行定值。該標準物質(zhì)研制技術(shù)路線、樣品制備及定值方法的選擇充分考慮了目前國內(nèi)外相關(guān)限量要求和檢測方法特點，均勻性和穩(wěn)定性良好，符合國家一級標準物質(zhì)技術(shù)規(guī)范要求。

(2)該標準物質(zhì)可用于臨床檢驗、衛(wèi)生檢驗檢疫等分析測試領(lǐng)域中分析儀器的校準、分析方法的確認評價以及實驗室測量質(zhì)量控制等。

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團簇質(zhì)譜、光譜為合成氨催化劑提供新思路

許多能源相關(guān)的化學過程中，化學反應是在具有催化功能的界面或者團簇分子表面上發(fā)生的。要弄清團簇和催化表面的反應機理，在原子分子層次上研究團簇以及表面相關(guān)的化學反應過程是非常必要的。不久前，中國科學院大連化學物理研究所復合氫化物材料化學研究組研究員陳萍團隊和分子反應動力學國家重點實驗室團簇光譜與動力學研究組研究員江凌團隊合作在合成氨反應機理研究中取得新進展，相關(guān)結(jié)果發(fā)表在《德國應用化學》(Angew Chem Int Ed，DOI:10.1002/ange.201703864)上，并被選為“熱點文章”。

實現(xiàn)溫和條件下氨的高效合成一直是催化領(lǐng)域的重要研究課題。陳萍團隊首次報道了具有優(yōu)異低溫活性的LiH-3d過渡金屬這一復合催化劑體系，并提出了“氮轉(zhuǎn)移”催化機理：LiH作為第二催化中心，可以轉(zhuǎn)移過渡金屬表面的氮物種形成Li2NH/LiNH2，繼而加氫放氨。這種雙中心的催化機制打破了單一過渡金屬上反應物種的活化能壘和吸附能之間的限制關(guān)系，使得氨的低溫低壓合成成為可能(Nature Chemistry，2017，9，64)。而該催化劑上氮的活化和轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化的微觀機制尚有待深入研究。

在該工作中，大連化物所研究團隊以LiH-Fe復合催化劑為研究對象，發(fā)現(xiàn)Fe與LiH在界面處存在強的相互作用。利用自主研制的團簇質(zhì)譜與光譜聯(lián)用實驗裝置，并與密度泛函理論計算緊密結(jié)合，成功探測到該催化劑表(界)面存在Li-Fe-H三元氫化物物種(如Li4FeH6，Li5FeH6等)。更為有趣的是這些氫化物物種可與N2反應直接轉(zhuǎn)化為含有Fe-(NH2)-Li和LiNH2的物質(zhì)，實現(xiàn)了N2的解離、向Li的轉(zhuǎn)移和加氫；同時，三元氫化物中與Fe結(jié)合帶負電荷的氫則轉(zhuǎn)化為與N結(jié)合帶正電荷的氫，完成了兩電子轉(zhuǎn)移。這些基于團簇反應的研究結(jié)果暗示了在Fe-LiH表(界)面形成的Li4FeH6很可能是催化活性中心，而N2的活化則有可能從傳統(tǒng)Fe基催化劑C7位上的均裂過程轉(zhuǎn)變?yōu)椤皻渲怆x”機制。這項研究加深了對LiH-3d過渡金屬催化劑上合成氨反應機理的認識，為新型高效合成氨催化劑的設(shè)計開發(fā)提供了思路。

上述工作得到國家杰出青年基金、基金委重點項目、教育部能源材料化學協(xié)同創(chuàng)新中心(iChEM)和大連化物所甲醇轉(zhuǎn)化與煤代油新技術(shù)基礎(chǔ)研究專項(DICPDMTO)的資助。

(中國化工儀器網(wǎng))

Development of Serum Hydrocortisone Component Analysis Reference Material

Wang Ziyi1,2, Dai Xinhua1, Liu Zhao1, Li Hongmei1, Wang Shaoli2
(1. National Institute of Metrology， Beijing 100013， China；2. Changzhou Institute of Measurement & Testing Technology, Changzhou 213164, China)

O657

A

1008-6145(2017)04-0004-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2017.04.001

*國家科技基礎(chǔ)專項(2011FY130100)

聯(lián)系人：戴新華；E-mail: daixh@nim.ac.cn

2017-05-18