王睿,余陳歡,方杰,曹暢

(1.杭州市中醫(yī)院,杭州 310007;2.浙江省醫(yī)學科學院,杭州 310007)

電針延緩HepG2裸鼠荷瘤生長趨勢及對PCNA表達影響

王睿1,余陳歡2,方杰2,曹暢1

(1.杭州市中醫(yī)院,杭州 310007;2.浙江省醫(yī)學科學院,杭州 310007)

目的觀察電針干預對HepG2裸鼠荷瘤生長趨勢及PCNA表達的影響。方法將32只裸鼠隨機分為電針組、電刺激組、模型組與空白組,每組8只。采用HepG2建立皮下荷瘤裸鼠模型。電針組采用雙下肢足三里十三陰交穴進行電針干預,電刺激組取相同穴位進行直接電流刺激。觀測荷瘤體積變化、瘤重比和腫瘤生長抑制率,并檢測荷瘤組織PCNA的表達水平。結(jié)果電針組、電刺激組和模型組干預前后荷瘤體積比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);電針組、電刺激組干預后荷瘤體積與模型組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),但電針組荷瘤體積生長趨勢較緩。各組干預前后裸鼠體重比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。電針組干預后瘤重比與電刺激組和模型組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);但電刺激組干預后瘤重比與模型組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。電針組干預后腫瘤生長抑制率與電刺激組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。電針組和電刺激組干預后PCNA表達水平與模型組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);但電針組干預后PCNA表達水平與電刺激組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結(jié)論電針干預在一定程度上可延緩HepG2荷瘤生長趨勢。

電針;電刺激;HepG2荷瘤;PCNA;裸鼠

目前我國惡性腫瘤的疾病負擔日益嚴重,發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升趨勢[1-2],并給患者帶來巨大的經(jīng)濟壓力[3]。隨著2006年世界衛(wèi)生組織提出腫瘤是一種慢性的可控性疾病[4],“帶瘤生存”的理念逐漸被廣泛接受[5-6]。經(jīng)過有效的抗腫瘤治療后,病情相對穩(wěn)定,但不再接受或耐受放化療和手術(shù)的癌癥患者和老年患者,都是針灸發(fā)揮調(diào)控效應(yīng)的切入點和優(yōu)勢所在[7-8]。本研究運用 PCNA作為可觀評價指標,探討電針對HepG2裸鼠荷瘤的生長是否有正向調(diào)控作用,為將針灸運用到臨床“帶瘤生存”提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級BALB/C(nu/nu)裸鼠32只,雌雄各半,體重16～20g,4～5周齡。由浙江省醫(yī)學科學院動物實驗中心負責調(diào)劑[動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2013-0016],常規(guī)飼養(yǎng)。實驗前將裸鼠常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)1星期,對所有裸鼠稱重,使用剪趾方法編號。按體重的順序排列,采用隨機數(shù)字法分為電針組、電刺激組、模型組和空白組4組,每組8只。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

DMEM粉、RPMI1640培養(yǎng)液(Sigma中國),蘇木素染液、伊紅染液(國藥集團化學試劑有限公司),PCNA組化試劑盒(谷歌生物),組化試劑盒 DAB顯色劑(DAKO)。

1.2.2 主要儀器

RM2016病理切片機、KD-P組織攤片機(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備),Eclipse Ti-SR倒置熒光顯微鏡、DS-U3成像系統(tǒng)(日本尼康),DL-5M高速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司),GT1001組化筆(Gene tech)。

1.3 動物模型制備

首先將HepG2細胞置于含10%PBS的DMEM細胞培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)和傳代,選擇對數(shù)生長期細胞,使用RPMI1640培養(yǎng)液配制為2×107/mL細胞。分別在電針組、電刺激組和模型組裸鼠右前肢腋窩下,接種濃度為2×107/mL的 HepG2細胞懸液0.2mL(含活細胞5×106/0.2mL)。接種細胞后每日定時觀察裸鼠細胞接種部位的成瘤情況[9]。所有裸鼠均在皮下種植腫瘤細胞后1星期即可觸及瘤塊生長。

1.4 干預方法

電針組取雙側(cè)下肢足三里十三陰交,穴位定位及操作依據(jù)《實驗針灸學》[10]。采用小鼠固定器十雙腿膠布固定的方法進行捆綁,電針操作選用蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品的0.18mm×10mm美容用毫針進行針刺,然后接華佗牌電針儀(型號 SDZ-Ⅱ),電針儀頻率選擇2/100 Hz疏密波,電流強度從0.1 mA開始逐漸加強,根據(jù)裸鼠耐受情況,以身體開始扭動和嘶叫為度。

電刺激組使用相同方式的固定,采用電極直接刺激雙側(cè)足三里和三陰交位,電流強度、頻率等同電針組。

模型組和空白組均使用相同方式的固定,不予其他特殊處理。

各組均每日干預1次,每次干預30min,連續(xù)治療10次。

1.5 觀察指標

1.5.1 荷瘤體積變化

裸鼠接種腫瘤細胞后密切觀察荷瘤生長情況。等裸鼠荷瘤肉眼可見后,于干預開始第2、5、8天與實驗結(jié)束第2天使用電子游標卡尺測量荷瘤的長徑(a)、短徑(b),分別計算腫瘤體積(V)、相對腫瘤體積(RTV)和相對腫瘤增殖率(T/C)[11]。

1.5.2 瘤重比和腫瘤生長抑制率

實驗結(jié)束第2天將裸鼠稱重后,頸椎脫臼處死各組裸鼠,完整剝離腫瘤,去除血污、脂肪等非腫瘤組織,稱取瘤體重量,計算瘤重比和腫瘤生長抑制率[12]。

1.5.3 荷瘤組織的PNCA免疫組化

細胞增殖能力的評價采用荷瘤組織的 PNCA免疫組化檢測。在每組內(nèi)隨機挑選3個切片,每張切片隨機挑選3個200倍視野進行拍照,合計9個視野。應(yīng)用Image-Pro Plus6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標準,對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度值(IOD值)[13]。

1.6 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示,如符合正態(tài)分布,采用方差分析(one-way ANOVA);如不符合正態(tài)分布,采用非參數(shù)檢驗(Mann-Whitney U)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 電針對裸鼠荷瘤體積變化的影響

由表1可見,干預前后各組荷瘤體積比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。干預后計算RTV值,模型組為(2.61±0.61),電針組為(2.28±1.11),電刺激組為(3.42±1.63);計算T/C(%)值,以模型組為100%,電針組為(146±93)%,電刺激組為(89±42)%,各組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。從干預前到干預后,各時間點荷瘤體積繪制成的折線趨勢圖(見圖2)可大致看出電針組裸鼠荷瘤生長速度較其余兩組相對緩慢。

表1 各組各時間段裸鼠瘤體積比較 (±s,mm3)

表1 各組各時間段裸鼠瘤體積比較 (±s,mm3)

注:與同組治療前比較1)P＜0.05;與對照組比較2)P＜0.05

?

圖1 各組各時間點荷瘤體積折線趨勢圖

2.2 電針對荷瘤裸鼠瘤重比和腫瘤生長抑制率的影響

表2 各組平均瘤重、瘤重比和腫瘤生長抑制率比較(n=8)(±s)

表2 各組平均瘤重、瘤重比和腫瘤生長抑制率比較(n=8)(±s)

注:與模型組比較1)P＜0.05;與電刺激組比較2)P＜0.05

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由表2及圖2可見,各組干預前后裸鼠體重比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。干預后計算瘤重比,電針組優(yōu)于電刺激組和模型組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),但電刺激組和模型組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);計算腫瘤生長抑制率后顯示,電針組腫瘤生長抑制率與電刺激組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖2 各組干預前后裸鼠體重比較

2.3 荷瘤組織PCNA表達比較

由圖3可見,紅圈所示棕黃色為PCNA陽性表達的細胞,與模型組比較,電針組與電刺激組均對裸鼠腫瘤組織PCNA表達有一定的下調(diào)作用,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),但電針組與電刺激組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見表3。

表3 各組荷瘤PCNA免疫組化IOD值比較 (±s)

表3 各組荷瘤PCNA免疫組化IOD值比較 (±s)

注:與模型組比較1)P＜0.05

?

圖3 荷瘤組織PCNA表達(×200)

3 討論

帶瘤生存的目的是經(jīng)有效治療后,腫瘤病灶可處于相對靜止狀態(tài),人體與腫瘤“長期共存”。運用針灸的優(yōu)勢不在于直接殺傷腫瘤細胞,而是通過作用于腫瘤生長的內(nèi)在環(huán)境,糾正機體失衡狀態(tài),提高整體免疫功能,達到控瘤生存目的[14-16]。補其不足,瀉其有余,恢復陰平陽秘的狀態(tài),是中醫(yī)學控瘤的基本原則。尤其中晚期和老年惡性腫瘤患者正處于正邪俱傷或正氣已虛、不耐攻伐的階段,為實現(xiàn)帶瘤生存,更需重視脾胃正氣的培補[17-18]?！肚Ы鹨矸健?“腹中積聚,皆針胞門?！薄夺樉募滓医?jīng)》:“胞中有大疝瘕積聚……補尺澤、太溪、手陽明寸口。”上文均描述了針灸通過扶正驅(qū)邪和疏通經(jīng)絡(luò)的作用達到治瘤目的。針灸立足于對整體功能的調(diào)節(jié),不產(chǎn)生毒副反應(yīng),搭配其他治療方法,能起到減毒增效的作用,使其在古往今來腫瘤攻克中占有一席之地[19-20]。

針灸作為“中醫(yī)基礎(chǔ)理論”指導下開展應(yīng)用的學科,使用足三里十三陰交表里經(jīng)配穴法,以扶正固本、培補脾胃和調(diào)和陰陽為治療原則。足三里是足陽明胃經(jīng)的下合穴,是健脾和胃、補益后天之要穴,可調(diào)節(jié)脾胃的運化功能。三陰交是足太陰脾經(jīng)的腧穴,主治脾胃虛弱,有健脾益氣、溫中補虛之功效?！鹅`樞·根結(jié)》:“用針之要,在于知調(diào)陰和陽。”闡明了針灸治療疾病具有調(diào)和陰陽的作用。足陽明胃經(jīng)的足三里和足太陰脾經(jīng)的三陰交穴配伍,能發(fā)揮陰陽經(jīng)腧穴間的協(xié)同作用,調(diào)節(jié)機體陰陽平衡。既往研究證實,針灸可通過改善腫瘤免疫功能[21-22]或者調(diào)整生物節(jié)律[23],發(fā)揮抗腫瘤和改善患者生存質(zhì)量的作用,還具有經(jīng)濟、安全和操作簡便等優(yōu)勢。因此,針灸對腫瘤調(diào)控的臨床價值是可以作為帶瘤生存期的維持手段,長期運用于臨床,不會給患者家庭帶來過重的經(jīng)濟負擔[24-27]。

本研究設(shè)置電刺激組作為對照,運用同樣的電針儀和刺激強度,把電極直接貼敷在相同穴位的皮膚上進行干預,目的是盡可能排除電流刺激本身對荷瘤裸鼠作用的影響,可更精確地觀測腧穴針刺效應(yīng)[28-29]。并運用增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)評價腫瘤細胞增殖狀態(tài),其是在細胞周期 S期廣泛表達的一種核蛋白,陽性表達說明細胞正處于增殖期[30-33]。綜合分析瘤重比和干預前到干預后荷瘤體積增長趨勢等結(jié)果,并考慮到電針組PCNA呈下調(diào)表達,說明電針可以通過相關(guān)通路影響到腫瘤細胞的增殖,初步認為電針具有一定的延緩荷瘤生長趨勢作用。但目前僅能證明在HegG2癌細胞株上,還需要選擇不同的腫瘤細胞株進行研究。并且本研究觀測得到的生長趨勢有延緩變化的結(jié)果,僅體現(xiàn)在實施干預的這一段時間里,在將來的研究中,需對針灸后效應(yīng)和電針對荷瘤裸鼠生存時間的影響進行深入探討。本研究后續(xù)還將對電針組與模型組間差異表達的microRNA進行篩選工作,運用基因芯片技術(shù)更好地探索電針控瘤機制。

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Electroacupuncture Delaying Tumor Growth and its Effect on PCNA Expression in HepG2 Nude Mice

WANG Rui1, YU Chen-huan2, FANG J ie2, CAO Chang1. 1.Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310007,China;2.Zhejiang Academy of Medical Science,Hangzhou 310007,China

ObjectiveTo explore the effect of electroacupuncture intervention on tumor growth and PCNA expression in HepG2 nude mice.MethodsThirty-two nude mice were randomized to electroacupuncture,electrostimulation, model and blank control groups,8 mice each. A nude mouse model of subcutaneous tumor was made with HepG2. The electroacupuncture group

electroacupuncture at points Zusanli and Sanyinjiao on bilateral lower limbs and the electrostimulation group, direct electrical stimulation of the same points. The tumor volume, the tumor/weight ratio and the tumor growth inhibition rate were observed. PCNA expression in the tumor tissue was determined.ResultsThere was no statistically significant pre-/post-intervention difference in the tumor volume in the electroacupuncture, electrostimulation and model groups (P＞0.05). There was no statistically significant post-intervention difference in the tumor volume between the electroacupuncture or electrostimulation group and the model group (P＞0.05), but tumor growth tended to slow in the electroacupuncture group. There was no statistically significant pre-/post-intervention difference in the nude mouse weight in every group (P＞0.05). There was a statistically significant post-intervention difference in the tumor/weight ratio between the electroacupuncture group and the electrostimulation or model group (P＜0.05), but no statistically significant post-intervention difference in the tumor/weight ratio between the electrostimulation and model groups (P＞0.05). There was a statistically significantpost-intervention difference in the tumor growth inhibition rate between the electroacupuncture and electrostimulation groups (P＜0.05). There was a statistically significant post-intervention difference in the PCNA expression level between the electroacupuncture or electrostimulation group and the model group (P＜0.05), no statistically significant post-intervention difference in the PCNA expression level between the electroacupuncture and electrostimulation groups (P＞0.05).ConclusionElectroacupuncture can delay HepG2 tumor growth to a certain extent.

Electroacupuncture; Electrostimulation; HepG2 tumor; PCNA; Nude mice

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.07.0852

1005-0957(2017)07-0852-05

2017-03-12

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目(2015ZA161);浙江省院所專項(2015D3006)

王睿(1987—),男,主治醫(yī)師,博士,Email:k444www@163.com

余陳歡(1982—),男,副研究員,博士,Email:yuchenhuan2002@163.com