十個八倍體小偃麥的細胞學(xué)鑒定和染色體構(gòu)成分析

亓?xí)岳脔U印廣李興鋒錢兆國王瑞霞吳 科王洪剛,*

1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 國家小麥改良分中心/作物生物學(xué)國家重點實驗室, 山東泰安 271018;2泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 山東泰安271000

十個八倍體小偃麥的細胞學(xué)鑒定和染色體構(gòu)成分析

亓?xí)岳?,2,**鮑印廣1,**李興鋒1錢兆國2王瑞霞2吳 科2王洪剛1,*

1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 國家小麥改良分中心/作物生物學(xué)國家重點實驗室, 山東泰安 271018;2泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 山東泰安271000

培育新的八倍體小偃麥, 對于利用偃麥草遺傳物質(zhì)進行小麥的遺傳改良具有重要意義。本研究利用細胞學(xué)和基因組原位雜交技術(shù), 對從中間偃麥草與小麥品種煙農(nóng)15雜交后代選育出的10個八倍體小偃麥山農(nóng)TE256、山農(nóng)TE259、山農(nóng)TE261、山農(nóng)TE262、山農(nóng)TE263、山農(nóng)TE265、山農(nóng)TE266、山農(nóng)TE267-1、山農(nóng)TE270和山農(nóng)TE274進行了細胞學(xué)鑒定和染色體構(gòu)成分析。結(jié)果表明, 10個八倍體小偃麥絕大多數(shù)單株根尖細胞的染色體數(shù)目為2n = 56, 個別單株含有54或55條染色體; 大多數(shù)2n = 56單株的花粉母細胞在減數(shù)分裂中期I的染色體構(gòu)型為2n = 28II, 少數(shù)花粉母細胞存在單價體、三價體或四價體, 后期 I染色體可均等分向兩極, 僅有極少數(shù)細胞出現(xiàn)染色單體提前分離等現(xiàn)象; 10個八倍體小偃麥均含有普通小麥的全套染色體和中間偃麥草的1個混合染色體基組, 其中間偃麥草染色體是由來自中間偃麥草 3個不同染色體基組的染色體構(gòu)成的混合染色體基組, 其染色體構(gòu)成分別為2St+8JS+ 2J+2J-St、2St+8JS+4J、2St+8JS+2J+2J-St、2St+8JS+2J+2J-St、2St+8JS+2J+2J-St、6St+4JS+2J+2J-St、4St+6JS+2J+2J-St、2St+8JS+4J、2St+8JS+4J和4St+6JS+4J, 與目前已報道的八倍體小偃麥均有所不同。研究結(jié)果可為這些新型八倍體小偃麥的研究和有效利用提供參考依據(jù)。

中間偃麥草; 八倍體小偃麥; GISH; 染色體構(gòu)成

中間偃麥草(Thinopyrum intermedium, 2n = 6x = 42, JJJSJSStSt)是小麥亞族中的多年生野生種, 對小麥的葉銹、條銹、稈銹、白粉病等免疫, 對黑穗病、葉枯病和根腐病、黃矮病、條紋花葉病等高抗, 并且抗寒冷、耐鹽堿和干旱, 是國內(nèi)外小麥遺傳改良中應(yīng)用較多的野生親本材料[1]。將中間偃麥草染色體組導(dǎo)入普通小麥遺傳背景育成的八倍體小偃麥,不僅保持了中間偃麥草抗病、耐寒、耐旱和大穗等優(yōu)良特點, 而且與普通小麥雜交易于成功, 在小麥品種遺傳改良研究中具有重要利用價值。

國內(nèi)外學(xué)者利用中間偃麥草與小麥雜交育成了多種八倍體小偃麥, 并對其染色體構(gòu)成進行了分析。1953年我國學(xué)者孫善澄[2]利用它與小麥雜交, 培育出“中 1”至“中 5”等八倍體小偃麥。1966年Cauderon[3]利用中間偃麥草與普通小麥 Vilromin雜交育成了八倍體小偃麥 TAF46。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)利用中間偃麥草進行小麥遺傳改良研究, 并育成了山農(nóng)TE253等13個八倍體小偃麥[4-7]。這些小偃麥已成為創(chuàng)造異附加系、異代換系和易位系, 向小麥轉(zhuǎn)移中間偃麥草有益基因的重要橋梁親本。王洪剛等[4]利用自育的6個八倍體小偃麥與中1、中2、中3、中4和中5雜交, 通過對雜種F1的染色體構(gòu)型分析并結(jié)合種子醇溶蛋白電泳分析結(jié)果推測, 兩類八倍體小偃麥或其中之一所攜帶的偃麥草染色體組可能是一種混合染色體組。張學(xué)勇等[8]利用細胞遺傳學(xué)方法, 對 5個八倍體小偃麥中附加的中間偃麥草染色體組分析認為, 中 1和中 2可能含有中間偃麥草的St染色體組, 而中3、中4和中5則含有中間偃麥草的E (Ee或Eb)染色體組。近年來, 隨著基因組原位雜交[9-12](genome in situ hybridization, GISH)和多色熒光原位雜交 (multicolour genome in situ hybridization, mcGISH)[13-14]等技術(shù)的發(fā)展, 為識別小麥和中間偃麥草染色體提供了新的技術(shù)手段。Chen等[9]以擬鵝觀草(Pseudoroegneria á. L?ve, 2n = 2x = 14, StSt)基因組(2n = 14, StSt) DNA為探針, 普通小麥總DNA為封阻對中間偃麥草進行GISH分析, 將其染色體分為3類, 第1類整條染色體顯示雜交信號, 為St基組染色體; 第 2類染色體兩端顯示雜交信號,為J基組染色體; 第3類在著絲粒周圍(偶爾端部也有)顯示雜交信號, 其余部分相對較弱, 為 JS基組染色體。鮑印廣等[6-7]利用GISH技術(shù)分析并明確了山農(nóng)TE253等5個八倍體小偃麥的染色體構(gòu)成。

本研究利用細胞學(xué)和基因組原位雜交技術(shù), 分析了10個八倍體小偃麥的根尖細胞染色體數(shù)目、花粉母細胞減數(shù)分裂中期 I染色體構(gòu)型及其中間偃麥草染色體構(gòu)成。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

10個八倍體小偃麥包括山農(nóng) TE256、山農(nóng)TE259、山農(nóng)TE261、山農(nóng)TE262、山農(nóng)TE263、山農(nóng)TE265、山農(nóng)TE266、山農(nóng)TE267-1、山農(nóng)TE270和山農(nóng) TE274, 均是由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)利用普通小麥品種煙農(nóng)15與中間偃麥草雜交育成, 中間偃麥草(PI547333)引自原中國科學(xué)院西北植物研究所, 擬鵝冠草(Z2774)引自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 煙農(nóng)15由國家小麥改良中心山東(泰安)分中心保存。

1.2 根尖細胞染色體觀察

種子室溫下浸泡露白后, 在4℃冰箱中冷凍24 h,然后在25℃條件下培養(yǎng), 根長1.5～2.0 cm時剪取根尖在冰水中處理24 h, 以卡諾氏固定液(V無水乙醇∶V冰醋酸= 3∶1)固定24 h以上。將固定好的根尖放入1 mol L-1鹽酸, 于60℃水浴中解離8～10 min, 以改良卡寶品紅染色, 壓片, 鏡檢, 照相。

1.3 花粉母細胞減數(shù)分裂染色體構(gòu)型分析

選取處于減數(shù)分裂中期 I的花藥, 以卡諾氏固定液固定24 h以上, 轉(zhuǎn)入70%乙醇保存。將固定好的花藥放入1 mol L-1鹽酸, 于60℃水浴中解離8～10 min, 以改良卡寶品紅染色, 壓片, 鏡檢, 照相。

1.4 基因組原位雜交

交參照 Han等[13]的方法, 略有改動。所用探針為擬鵝冠草或中間偃麥草基因組 DNA, 封阻 DNA為煙農(nóng)15基因組DNA。利用DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole)將小麥染色體復(fù)染成藍色。在OLYMPUS BX-60型熒光顯微鏡下觀察, 以DS-Ri1CCD相機(Nikon, 日本)采集圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 八倍體小偃麥根尖細胞染色體數(shù)目

隨機選取各八倍體小偃麥的10個單株觀察其根尖細胞染色體數(shù)目。絕大多數(shù)單株的根尖細胞染色體數(shù)目為2n = 56 (表1)。其中, 山農(nóng)TE256、山農(nóng)TE261、山農(nóng) TE262、山農(nóng) TE265和山農(nóng) TE267-1的10個單株染色體數(shù)目均為2n = 56; 山農(nóng)TE259、山農(nóng)TE263、山農(nóng)TE266、山農(nóng)TE270和山農(nóng)TE274的10個單株中有9株的染色體數(shù)目為2n = 56, 占90%, 個別單株的染色體數(shù)目為2n = 54或2n = 55。上述10個八倍體小偃麥可能附加了1組中間偃麥草染色體。

表1 10個八倍體小偃麥的根尖細胞染色體數(shù)目Table 1 Number of plants with different chromosome numbers in root tip cells of ten octoploid Trititrigia

2.2 八倍體小偃麥花粉母細胞的染色體構(gòu)型

分別選取5株染色體數(shù)目為2n = 56的八倍體小偃麥單株, 對其花粉母細胞減數(shù)分裂中期 I (PMC MI)的染色體構(gòu)型分析發(fā)現(xiàn), 除山農(nóng) TE265和山農(nóng)TE267-1為2n = 28II外, 在其余八倍體小偃麥中均觀察到其他染色體構(gòu)型。例如, 在觀察的60個山農(nóng)TE256花粉母細胞中, 57個細胞中的染色體聯(lián)會成28個二價體(圖1-A), 占95%; 1個細胞中觀察到2個單價體(圖1-B), 2個細胞中觀察到1個四價體(圖1-C); 山農(nóng)TE256在PMC MI期的平均染色體構(gòu)型為2n = 0.033I + 27.917II + 0.033IV, 相對紊亂系數(shù)為0.002; 花粉母細胞減數(shù)分裂后期I (PMC AI)染色體可均等分向細胞兩極(圖1-D)。與山農(nóng)TE256相似,在山農(nóng) TE259、山農(nóng) TE261、山農(nóng) TE262、山農(nóng)TE263、山農(nóng)TE266、山農(nóng)TE270和山農(nóng)TE274的絕大多數(shù)花粉母細胞減數(shù)分裂中期I均能觀察到28個二價體, 在少數(shù)細胞中可觀察到單價體、三價體、和四價體等現(xiàn)象(表2)。除山農(nóng)TE262相對紊亂系數(shù)為0.032外, 山農(nóng)TE259、山農(nóng)TE261、山農(nóng)TE262、山農(nóng)TE263、山農(nóng)TE266、山農(nóng)TE270和山農(nóng)TE274的相對紊亂系數(shù)均低于 0.01。山農(nóng) TE259、山農(nóng)TE261、山農(nóng)TE262、山農(nóng)TE263、山農(nóng)TE266、山農(nóng)TE270和山農(nóng)TE274的PMC MI平均染色體構(gòu)型分別為2n = 0.156I + 27.723II + 0.022III + 0.022IV、2n = 0.250I + 27.875II、2n = 0.120I + 27.290II + 0.080IV、2n = 0.090I + 27.865II + 0.045IV、2n = 0.133I + 27.933II、2n = 0.125I + 27.937II和2n = 0.152I + 27.891II + 0.022III (表2)。在PMC AI期, 上述材料 95%以上的細胞染色體可均等分向兩極, 僅有極少數(shù)細胞出現(xiàn)染色單體提前分離等現(xiàn)象。

2.3 八倍體小偃麥的花粉母細胞GISH鑒定

以中間偃麥草DNA作探針、普通小麥品種煙農(nóng)15的基因組DNA作封阻對10個八倍體小偃麥的花粉母細胞進行GISH鑒定顯示, 10個八倍體小偃麥花粉母細胞中均有 7個二價體呈現(xiàn)雜交信號, 其余染色體被封阻 DNA封閉, 且被 DAPI復(fù)染為藍色(圖2)。說明10個八倍體小偃麥中均附加了中間偃麥草的14條染色體, 附加的中間偃麥草染色體均能形成二價體, 具有較高的細胞學(xué)穩(wěn)定性。

圖1 八倍體小偃麥山農(nóng)TE256的染色體構(gòu)型Fig. 1 Chromosome configurations of octoploid Trititrigia Shannong TE256A: PMC MI, 2n = 28II; B: PMC MI, 2n = 2I + 27II; C: PMC MI, 2n = 26II + 1IV; D: PMC AI, 28 vs. 28.

表2 10個八倍體小偃麥PMC MI的染色體構(gòu)型Table 2 Chromosome configurations of ten octoploid Trititrigia at PMC MI

圖2 10個八倍體小偃麥花粉母細胞的基因組原位雜交鑒定Fig. 2 GISH patterns of ten octoploid Trititrigia at PMC MI10個八倍體小偃麥花粉母細胞( 2n = 28II )的基因組原位雜交結(jié)果均顯示, 7個二價體呈現(xiàn)綠色雜交信號, 來自中間偃麥草, 其余21個二價體被DAPI復(fù)染為藍色, 來自普通小麥煙農(nóng)15。TE256為山農(nóng)TE256的簡寫, 余同。GISH patterns of ten octoploid Trititrigia at PMC MI (2n = 28II), showing seven bivalents from Th. intermedium (green) and 21 bivalents from common wheat Yannong 15 (blue). TE256 is the abbreviation of Shannong TE256, and so forth.

2.4 八倍體小偃麥根尖細胞基因組原位雜交鑒定

為了進一步確定10個八倍體小偃麥中中間偃麥草染色體的染色體基組歸屬, 以擬鵝冠草DNA作探針, 煙農(nóng)15的基因組DNA作封阻, 對其根尖細胞染色體進行了GISH分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 10個八倍體小偃麥根尖細胞中均有14條染色體呈現(xiàn)雜交信號, 為中間偃麥草染色體; 而其余染色體被封阻DNA封閉呈現(xiàn)藍色, 為小麥染色體。進一步證明10個八倍體小偃麥均含有14條中間偃麥草染色體(圖3)。例如, 在山農(nóng)TE256中, 1對染色體的綠色信號均勻遍布整條染色體, 為St染色體; 4對染色體在著絲粒區(qū)域呈現(xiàn)亮綠色信號, 兩臂末端偶爾出現(xiàn)綠色信號, 為 JS染色體; 1對染色體僅在兩臂末端呈現(xiàn)綠色雜交信號,為J染色體; 1對染色體較為特殊, 整條長臂呈綠色,且中間有亮綠信號點, 而短臂僅在末端有雜交信號,為J-St易位染色體(圖4)。因此, TE256除含有普通小麥的全部染色體外, 還含有14條中間偃麥草染色體,其中2條為St染色體、8條為JS染色體、2條為J染色體、2條為J-St易位染色體。

山農(nóng)TE259、山農(nóng)TE261、山農(nóng)TE262、山農(nóng)TE263、山農(nóng)TE265、山農(nóng)TE266、山農(nóng)TE267-1、山農(nóng)TE270和山農(nóng)TE274除含有普通小麥的全部染色體外, 亦含有14條中間偃麥草染色體, 其染色體構(gòu)成分別為2St+8JS+4J、2St+8JS+2J+2J-St、2St+8JS+ 2J+2J-St、2St+8JS+2J+2J-St、6St+4JS+2J+2J-St、4St+ 6JS+2J+2J-St、2St+8JS+4J、2St+8JS+4J和4St+6JS+4J (圖4)。

圖3 10個八倍體小偃麥根尖細胞基因組原位雜交鑒定Fig. 3 GISH patterns of ten octploid Trititrigia at RTCs10個八倍體小偃麥根尖細胞(2n = 56) 的基因組原位雜交結(jié)果顯示, 14條染色體呈現(xiàn)綠色雜交信號, 來自中間偃麥草; 其余42條染色體被復(fù)染為藍色, 來自普通小麥煙農(nóng)15。TE256為山農(nóng)TE256的簡寫, 余同。GISH patterns of ten octoploid Trititrigia at RTCs (2n = 56), showing 14 chromosomes from Th. intermedium (green), and 42 chromosomes from common wheat Yannong 15 (blue). TE256 is the abbreviation of Shannong TE256, and so forth.

圖4 10個八倍體小偃麥中的中間偃麥草染色體構(gòu)成Fig. 4 Th. intermedium chromosomes of ten octoploid Trititrigia TE256為山農(nóng)TE256的簡寫, 余同。TE256 is the abbreviation of Shannong TE256, and so forth.

3 討論

八倍體小偃麥含有小麥的全部染色體和偃麥草的14條染色體, 兼具偃麥草和普通小麥親本的性狀特點, 且更容易與小麥雜交, 雜種后代穩(wěn)定相對較快, 是向小麥轉(zhuǎn)移偃麥草有益基因的重要橋梁。培育新的八倍體小偃麥可豐富小偃麥的類型, 對于利用偃麥草遺傳物質(zhì)進行小麥的遺傳改良具有重要意義。本研究證明10個八倍體小偃麥的染色體數(shù)目基本為2n = 56, PMC MI期的染色體構(gòu)型基本為2n = 28II, 具有較高的細胞學(xué)穩(wěn)定性; 10個八倍體小偃麥中的中間偃麥草染色體構(gòu)成, 與目前已報道的八倍體小偃麥[5-7,10-12,15-17]均有所不同, 為新的八倍體小偃麥類型。本研究結(jié)果可為供試八倍體小偃麥的研究及有效利用提供參考依據(jù)。

對10個八倍體小偃麥中的中間偃麥草染色體基組分析發(fā)現(xiàn), 它們均為混合染色體基組, 其染色體由中間偃麥草JS、J和St三個染色體基組中的不同染色體構(gòu)成, 且來自JS、J染色體基組的染色體較多。這與Bao等[6-7]的研究結(jié)果一致。綜合目前八倍體小偃麥染色體基組的染色體構(gòu)成研究結(jié)果, 除Zhang等[15]報道了小偃麥78829含有完整的14條St染色體以外, 其余八倍體小偃麥[5-7,10-12,16-17]中的偃麥草染色體基組都是混合染色體基組。生物的染色體基組是功能和遺傳的基本單位, 其包含的各條染色體是一個協(xié)調(diào)的整體。八倍體小偃麥中的中間偃麥草混合染色體基組的染色體來自 3個不同的染色體基組, 且小偃麥生長發(fā)育正常, 說明其混合染色體基組內(nèi)各染色體間具有良好的遺傳互補和協(xié)調(diào)性,作為功能單位所包含的遺傳信息是完整的。由于中間偃麥草含有 3種不同的染色體基組, 其染色體基數(shù)為 7, 它們在小偃麥形成過程中產(chǎn)生混合染色體基組的種類可能是多樣的, 從而可產(chǎn)生豐富的小偃麥新類型。但在小偃麥形成過程中, 其中間偃麥草的混合染色體基組的成因如何, 它的形成具有什么特點等問題, 尚需深入研究解析, 這將有助于對小偃麥形成機理的深入理解, 對于小偃麥新物種的創(chuàng)制及其有效利用也具有指導(dǎo)意義。

本研究在6個八倍體小偃麥中都發(fā)現(xiàn)J-St易位染色體, 推測是由中間偃麥草不同染色體基組間發(fā)生易位重組所致, 但是這種重組是發(fā)生在中間偃麥草的進化過程中, 還是在八倍體小偃麥的形成過程中也需要進一步研究。

4 結(jié)論

供試的10個八倍體小偃麥為新的八倍體小偃麥類型, 染色體數(shù)目為2n = 56, PMC MI期的染色體構(gòu)型多為2n = 28II, 具有較高的細胞學(xué)穩(wěn)定性。它們含有的中間偃麥草染色體基組均來自中間偃麥草3個不同染色體基組的染色體構(gòu)成的混合染色體基組,且在6個八倍體小偃麥中發(fā)現(xiàn)J-St易位染色體。

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Cytological Identification and Chromosome Constitution Analyses of Ten Octoploid Trititrigia Accessions

QI Xiao-Lei1,2,**, BAO Yin-Guang1,**, LI Xing-Feng1, QIAN Zhao-Guo2, WANG Rui-Xia2, WU Ke2, and WANG Hong-Gang1,*

1College of Agronomy, Shandong Agricultural University / Tai’an Subcentre of National Wheat Improvement Centre / State Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an 271018, China;2Tai’an Academy of Agricultural Sciences, Tai’an 271000, China

Developing new octoploid Trititrigia is of great significance for using Thinopyrum intermedium to the genetic improvement of common wheat. Ten octoploid Trititrigia accessions, i.e., Shannong TE256, Shannong TE259, Shannong TE261, Shannong TE262, Shannong TE263, Shannong TE265, Shannong TE266, Shannong TE267-1, Shannong TE270, and Shannong TE274, were developed from the progenies of the cross between Thinopyrum intermedium and common wheat variety ‘Yannong 15’. In this study, cytological methods and genomic in situ hybridization (GISH) were employed to determine cytological stability and chromosome constitutions of the 10 octoploid Trititrigia accessions. Mitotic observation indicated that most plants of octoploid Trititrigia had 56 chromosomes and a few had 54 or 55 chromosomes. Chromosomes in most pollen mother cells of plants with 2n = 56 formed 28 bivalents, showing a high degree of cytogenetic stability, simultaneously, univalents, trivalents and tetravalents appeared occasionally at meiotic metaphase I. At meiosis anaphase I (PMC AI), most chromosomes segregated equally to the two poles except for several univalent chromosomes moving ahead in very few cells. Fourteen Th. intermedium chromosomeswere observed to be added to the whole set of common wheat chromosomes in each octoploid Trititrigia, and the alien chromosome constitutions of the 10 octoploid Trititrigia accessions were 2St+8JS+2J+2J-St, 2St+8JS+4J, 2St+8JS+2J+2J-St, 2St+8JS+2J+2J-St, 2St+8JS+2J+2J-St, 6St+4JS+2J+2J-St, 4St+6JS+2J+2J-St, 2St+8JS+4J, 2St+8JS+4J, and 4St+6JS+4J. These alien chromosome constitutions were different from those reported in octoploid Trititrigia, suggesting that the 10 octoploid Trititrigia accessions are novel materials and might be valuable in wheat breeding programs.

Th. intermedium; Octoploid Trititrigia; GISH; Chromosome constitution

(

): 2016-12-05; Accepted(接受日期): 2017-03-02; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-03-17.

10.3724/SP.J.1006.2017.00967

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0102004)和山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(SDAIT-04-021-12)資助。

This study was supported by the Key Project of the National Research and Development Program (2016YFD0102004) and the Modern Agricultural Technology System of Shandong Province (SDAIT-04-021-12).

*通訊作者(Corresponding author): 王洪剛, E-mail: hgwang@sdau.edu.cn, Tel: 0538-8242141

**同等貢獻(Contributed equally to this work).

聯(lián)系方式: E-mail: qixiaoleielica226@163.com

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170317.1937.002.html