張會(huì)娜，張蔚然，王軼敏，劉新峰，郭宏，丁向彬

（天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津300384）

microRNA-143對(duì)小鼠失神經(jīng)肌肉萎縮中肌纖維的影響

張會(huì)娜，張蔚然，王軼敏，劉新峰，郭宏，丁向彬通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津300384）

為研究 microRNA-143（miR-143）對(duì)小鼠失神經(jīng)肌肉萎縮中肌纖維的影響，通過(guò)對(duì)小鼠進(jìn)行坐骨神經(jīng)切斷術(shù)，構(gòu)建小鼠腓腸肌失神經(jīng)萎縮模型，并注射miR-143模擬物或miR-143抑制劑，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-143的表達(dá)量，比較肌肉濕重和肌纖維直徑，研究miR-143對(duì)小鼠失神經(jīng)腓腸肌的調(diào)控作用。結(jié)果顯示：注射 miR-143模擬物的小鼠，其肌纖維直徑明顯低于對(duì)照組，而注射 miR-143抑制劑的小鼠，其失神經(jīng)腓腸肌組織肌纖維的直徑明顯高于對(duì)照組。結(jié)果說(shuō)明，miR-143對(duì)小鼠失神經(jīng)腓腸肌肌肉萎縮的修復(fù)起著一定調(diào)節(jié)作用。

microRNA-143；小鼠；失神經(jīng)；肌肉萎縮；肌纖維；腓腸肌

骨骼肌是周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的靶器官，周?chē)窠?jīng)具有支配肌肉運(yùn)動(dòng)收縮的功能，一方面相應(yīng)神經(jīng)元具有營(yíng)養(yǎng)相應(yīng)骨骼肌的功能，另一方面相應(yīng)的神經(jīng)元又需要依靠骨骼肌為其提供必需營(yíng)養(yǎng)因子。因此，肌肉的生長(zhǎng)、發(fā)育及正常的功能維持都有依賴于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的支配和調(diào)節(jié)。周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)受到損傷后，因神經(jīng)元不再通過(guò)軸漿運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)給相應(yīng)骨骼肌纖維，從而使骨骼肌失去神經(jīng)的支配作用，失去運(yùn)動(dòng)收縮功能，逐漸發(fā)生萎縮[1]。神經(jīng)的再生速度緩慢，而骨骼肌再生依賴于支配它的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維的存在，所以失神經(jīng)肌肉的再生比較困難，因此，如何延緩和防止失神經(jīng)后肌肉萎縮，并盡量保持肌肉正常功能成為目前研究的難題。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度為22 nt、可以抑制mRNA翻譯的非編碼小分子RNA，具有重要的生物學(xué)功能[2]。其作為一類(lèi)重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，在細(xì)胞分裂、增殖、分化和死亡過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[3-4]。有研究顯示，骨骼肌特異性 miRNA（miR-1、miR-133、miR-206等）與失神經(jīng)后骨骼肌萎縮的調(diào)控密切相關(guān)[5]。大鼠失神經(jīng)后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，miR-1和 miR-133的表達(dá)先下降，之后逐漸升高[6]。miRNA在神經(jīng)損傷修復(fù)過(guò)程中起著重要作用。有報(bào)道稱(chēng)，切斷鼠脊神經(jīng)后，miR-21表達(dá)水平升高，而miR-21可促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)[7]，表明某些miRNA可能對(duì)神經(jīng)損傷具有修復(fù)作用。也有研究表明，在注射細(xì)胞毒素造成的肌肉損傷模型中，注射miR- 675-3p和miR-675-5p可促進(jìn)肌損傷的修復(fù)[8]。以上研究結(jié)果表明，一些miRNA在肌肉損傷的修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了一定調(diào)節(jié)作用。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，miR-143對(duì)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的體外增殖分化過(guò)程具有調(diào)控作用，但miR-143在體內(nèi)對(duì)肌損傷修復(fù)是否具有一定的調(diào)節(jié)作用還不清楚，因此，本研究通過(guò)構(gòu)建小鼠腓腸肌失神經(jīng)萎縮模型，進(jìn)一步研究miR-143在體內(nèi)對(duì)小鼠失神經(jīng)肌肉萎縮中肌纖維的影響，以期為臨床治療失神經(jīng)萎縮提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

健康的清潔級(jí)小鼠購(gòu)自天津市奧易得實(shí)驗(yàn)用品有限公司。

1.2 試劑

All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit（AOMD-Q020）購(gòu)自GeneCopoeia；miR-143模擬物、miR-143抑制劑均購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；Opti-MEM? Medium（31985-070）、TRIzol（15596-108）購(gòu)自Life Technologies Corporation。

1.3 儀器

Light Cycler? 96實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（LightCycler 96）購(gòu)自瑞士Roche公司；Leica切片機(jī)（RM2235）購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

2 方法

2.1 小鼠腓腸肌失神經(jīng)萎縮模型的建立及 miR-143處理

2.1.1 試驗(yàn)分組

健康小鼠18只，清潔級(jí)，體重（30±1）g，均為6周齡，隨機(jī)分為3組，每組6只小鼠，分組情況如下：

第1組小鼠用來(lái)建立失神經(jīng)腓腸肌萎縮模型，手術(shù)后不注射任何試劑。第2、3組小鼠進(jìn)行失神經(jīng)后的miR-143表達(dá)干預(yù)試驗(yàn)，小鼠右后肢作為注射miR-143模擬物和抑制劑側(cè)，第2組右后肢注射混有miR-143模擬物的opti-MEM培養(yǎng)基，第 3組右后肢注射混有 miR-143抑制劑的opti-MEM培養(yǎng)基，兩組小鼠左后肢為對(duì)照，注射等量 opti-MEM培養(yǎng)基；小鼠飼養(yǎng)時(shí)保證充足飼料，每天換水，每周更換清潔的墊料。術(shù)前禁食12 h。

2.1.2 小鼠腓腸肌失神經(jīng)萎縮模型的建立及 miR-143處理

首先對(duì)小鼠進(jìn)行消毒，然后腹腔注射5%的水合氯醛200 mg/kg，待小鼠麻醉后將其固定在手術(shù)臺(tái)上，在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行操作。第1組小鼠從右后肢大腿背側(cè)部平行于股骨切口，鈍性分離股二頭肌與股外側(cè)肌，進(jìn)行坐骨神經(jīng)探查術(shù)，暴露坐骨神經(jīng)，切除距離梨狀肌下緣長(zhǎng)約3～5 mm的坐骨神經(jīng)，兩斷端翻轉(zhuǎn) 180°，防止斷端發(fā)生接觸，然后按照常規(guī)外科手術(shù)進(jìn)行分層縫合，左后肢進(jìn)行坐骨神經(jīng)探查術(shù)后不做手術(shù)處理，建立小鼠失神經(jīng)腓腸肌萎縮模型。另外 2組小鼠均根據(jù)第 1組的方法切斷兩側(cè)后肢坐骨神經(jīng)，失神經(jīng)手術(shù)后對(duì)小鼠的創(chuàng)口進(jìn)行消毒，2組左后肢均注射100 μL opti-MEM培養(yǎng)基。第2組右后肢注射混有10 nmol miR-143模擬物的100 μL Opti-MEM培養(yǎng)基；第3組右后肢注射混有10 nmol miR-143抑制劑的100 μL Opti-MEM培養(yǎng)基；分3次在術(shù)后1、5、9 d進(jìn)行注射。

2.2 小鼠腓腸肌標(biāo)本的提取及RNA提取

在術(shù)后14 d將試驗(yàn)小鼠進(jìn)行斷頸處死，將其雙側(cè)后肢皮膚切開(kāi)暴露皮下組織，剝離腓腸肌肌膜，取出小鼠完整腓腸肌，然后迅速用電子天平稱(chēng)重，再將腓腸肌分成2份，一份用于組織切片染色，另一份用于RNA提取。

RNA提取時(shí)，事先準(zhǔn)備好用液氮預(yù)冷的研缽，然后將取下的腓腸肌快速轉(zhuǎn)移至研缽中，用研杵快速研磨肌肉組織，邊研磨邊加入適量液氮，直至研磨成粉末狀，加入1 mL Trizol Reagent，使粉末被覆蓋，之后繼續(xù)研磨至結(jié)晶狀，將得到的RNA樣品室溫靜置，直至樣品完全融化，然后將樣品轉(zhuǎn)移至EP管中，進(jìn)行總RNA提取，所有操作按照Invitrogen Trizol說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-143在腓腸肌組織中的表達(dá)變化

提取的RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得第一鏈cDNA后，采用Light Cycler?96進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)miR-143的表達(dá)量變化，引物序列見(jiàn)表 1。反應(yīng)體系：10 μL2×All-in-OneTM qPCR Mix（SYBR Green fluorescence），2 μL基因特異性的 miRNAs qRT-PCR Primer（2 μmol/L），2 μL Universal Adaptor PCR Primer（2 μmol/L），2 μL First-strand cDNA（5倍稀釋?zhuān)?，?ddH2O（RNase/Dnase free）至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，10 min；95 ℃，10 s；60 ℃，20 s；72 ℃，15 s，40個(gè)循環(huán)。5.8 s rRNA作為定量PCR內(nèi)參?；蛳鄬?duì)表達(dá)量采用比較Ct值的方法進(jìn)行分析。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)引物序列

2.4 石蠟切片制作及HE染色

2.4.1 固定、水洗

將采集的腓腸肌放入足量的 4%多聚甲醛溶液中固定24 h，保證組織的完整性，水洗過(guò)夜。

2.4.2 脫水、透明

將組織塊標(biāo)記并依次放入 70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇中15 min，進(jìn)行脫水，然后迅速將組織塊取出放入二甲苯中，進(jìn)行透明處理。

2.4.3 浸蠟、包埋

將透明后的組織塊放入融化的石蠟中，充分浸蠟2 h，將浸蠟后的組織塊置于包埋盒中，將融化的石蠟注入包埋盒中，待石蠟完全凝固，對(duì)蠟塊進(jìn)行修整。

2.4.4 切片、展片

將蠟塊固定在金屬持蠟器上，切片機(jī)的厚度調(diào)至6 μm。選擇腓腸肌肌腹部的位置進(jìn)行連續(xù)切片，速度要均勻，力度要相同；將切好的蠟片輕輕平鋪在45 ℃的水面上，待蠟片充分展平后，將蠟片撈到載玻片的中部，瀝去水分，置于60 ℃的烤片機(jī)上烘烤2 h。

2.4.5 HE染色

將載玻片放入二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）中各3 min透明，然后迅速取出并依次放入無(wú)水乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中各30 s進(jìn)行梯度復(fù)水，之后用蒸餾水沖洗3 min；蘇木素液染色10 min，流水清洗，然后用1%的鹽酸乙醇分化液分色3 s，PBS緩沖液清洗10 min，伊紅水溶液染色10 min，蒸餾水清洗；置于95%乙醇（Ⅰ）、95%乙醇（Ⅱ）中各2 s，無(wú)水乙醇（Ⅰ）、無(wú)水乙醇（Ⅱ）中各30 s梯度脫水，最后置于二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）中各30 s透明，中性樹(shù)膠封片。

2.5 肌肉相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

腓腸肌濕重：將腓腸肌取下后立即用電子分析天平稱(chēng)量肌肉濕重。

形態(tài)觀察：將試驗(yàn)組與對(duì)照組 HE染色的切片分別置于顯微鏡下觀察，觀察不同處理下肌纖維形態(tài)和肌纖維直徑等之間是否存在差異。

腓腸肌肌纖維直徑的測(cè)量：使用 OLYMPUS CellSens Standard 1.6圖像采集系統(tǒng)隨機(jī)測(cè)量試驗(yàn)組與對(duì)照組經(jīng)HE染色后，在5個(gè)不同視野中共60根肌纖維的直徑，計(jì)算平均值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)資料分析以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，通過(guò)t檢驗(yàn)比較試驗(yàn)組與對(duì)照組的試驗(yàn)差異，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 失神經(jīng)對(duì)小鼠模型腓腸肌的影響

手術(shù)切除坐骨神經(jīng)建立小鼠失神經(jīng)腓腸肌萎縮模型，術(shù)后觀察發(fā)現(xiàn)，切除坐骨神經(jīng)相應(yīng)側(cè)的后肢喪失運(yùn)動(dòng)能力，呈跛行狀。miR-143表達(dá)量及肌肉濕重和肌纖維直徑檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。與對(duì)照組相比，miR-143在失神經(jīng)小鼠組織中的表達(dá)量極顯著下降（P＜0.01）；失神經(jīng)腓腸肌濕重極顯著降低（P＜0.01）；失神經(jīng)腓腸肌與對(duì)照組相比，腓腸肌組織顏色較暗，肌纖維明顯萎縮，肌纖維直徑極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。結(jié)果表明，隨著坐骨神經(jīng)的切斷，小鼠腓腸肌出現(xiàn)了明顯萎縮。

3.2 miR-143對(duì)小鼠失神經(jīng)肌肉萎縮中肌纖維的影響

試驗(yàn)結(jié)果如圖2。雙側(cè)坐骨神經(jīng)均被切斷，注射了miR-143模擬物的小鼠腓腸肌中miR-143的表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），肌肉濕重略低于對(duì)照組，但差異不顯著，失神經(jīng)部位肌纖維直徑極顯著低于對(duì)照組。而注射了miR-143抑制劑的小鼠腓腸肌中miR-143的表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；其肌肉濕重略高于對(duì)照組，失神經(jīng)部位肌纖維直徑極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。結(jié)果表明，體內(nèi)抑制 miR-143的表達(dá)可以減緩失神經(jīng)肌肉的萎縮過(guò)程。

圖1 失神經(jīng)小鼠模型腓腸肌miR-143表達(dá)及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

圖2 miR-143模擬物和miR-143抑制劑注射對(duì)失神經(jīng)小鼠模型腓腸肌的影響

4 討論

失神經(jīng)肌肉萎縮是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，神經(jīng)受到損傷后會(huì)有多種蛋白和基因的表達(dá)發(fā)生改變。周?chē)窠?jīng)損傷后，骨骼肌會(huì)出現(xiàn)肌肉質(zhì)量下降、肌纖維直徑減小等變化，發(fā)生萎縮[9-10]，進(jìn)而喪失運(yùn)動(dòng)能力。體內(nèi)蛋白質(zhì)合成和降解通路的平衡對(duì)肌肉質(zhì)量有著至關(guān)重要的影響，若打破蛋白質(zhì)合成與降解通路之間的平衡，則會(huì)導(dǎo)致肌肉的增生或萎縮[11-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，周?chē)窠?jīng)損傷導(dǎo)致骨骼肌廢用后，肌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成通路遭到抑制，而降解通路被激活，通路之間的平衡遭到破壞，加速了肌肉中蛋白質(zhì)的降解。研究表明，泛素化蛋白酶水解系統(tǒng)為影響蛋白質(zhì)降解通路的主要因素，而激活泛素化蛋白酶水解系統(tǒng)會(huì)引起肌肉蛋白加速降解，這也是肌肉質(zhì)量快速丟失的重要原因[14-15]。本試驗(yàn)構(gòu)建了小鼠腓腸肌失神經(jīng)萎縮模型，將試驗(yàn)組小鼠坐骨神經(jīng)切斷，結(jié)果顯示，14 d后，失神經(jīng)后的小鼠腓腸肌濕重明顯發(fā)生了改變，肌肉濕重及肌纖維直徑極顯著地低于正常水平，也證實(shí)了以上觀點(diǎn)。

骨骼肌失神經(jīng)性萎縮是因?yàn)榧∪馐ド窠?jīng)支配后，神經(jīng)元無(wú)法為骨骼肌提供營(yíng)養(yǎng)因子，導(dǎo)致骨骼肌廢用、萎縮，因此骨骼肌失神經(jīng)性萎縮也稱(chēng)為失營(yíng)養(yǎng)性萎縮或廢用性萎縮，只有使神經(jīng)重新獲得再支配能力，才能有效防止肌肉萎縮。miRNA作為一種非編碼RNA，在肌肉的發(fā)生、發(fā)育和損傷修復(fù)中都發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-351的表達(dá)可以促進(jìn)成肌前體細(xì)胞的凋亡，抑制增殖，過(guò)表達(dá)miR-351可以促進(jìn)肌前體細(xì)胞進(jìn)入分化狀態(tài)，抑制凋亡，說(shuō)明miR-351對(duì)肌細(xì)胞的增殖與分化發(fā)揮著重要作用[16]。此外，miRNAs可通過(guò)對(duì)靶基因的調(diào)控作用參與到特定的信號(hào)通路中，促進(jìn)受損神經(jīng)的修復(fù)與再生。例如，miR-206可通過(guò)對(duì) FGFBP1（FGF binding protein 1）蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，影響神經(jīng)肌肉接頭的神經(jīng)再支配[17]。在筆者之前的研究中，通過(guò)注射miR-139 inhibitors后能夠顯著增加失神經(jīng)肌肉萎縮部位的肌纖維直徑[18]。由此可見(jiàn)，miRNAs在成肌分化和神經(jīng)形成過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。而失神經(jīng)肌肉萎縮的修復(fù)與再生機(jī)制與神經(jīng)形成和肌細(xì)胞的自我更新有著密切的聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-143在失神經(jīng)腓腸肌中的表達(dá)量顯著低于正常水平，表明miR-143可能參與了小鼠失神經(jīng)肌萎縮的過(guò)程中的某些生物過(guò)程。在本試驗(yàn)中，通過(guò)構(gòu)建小鼠失神經(jīng)肌萎縮模型，切斷小鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)，在一側(cè)注射miR-143模擬物或 miR-143抑制劑，另一側(cè)作為對(duì)照，探究miR-143在體內(nèi)對(duì)失神經(jīng)肌萎縮組織的作用，試驗(yàn)結(jié)果表明，注射了miR-143模擬物的腓腸肌組織中miR-143的表達(dá)量顯著上升，肌纖維直徑較對(duì)照組顯著減小，而注射了miR-143抑制劑的腓腸肌組織中miR-143的表達(dá)量顯著下降，肌纖維直徑較對(duì)照組顯著增加，說(shuō)明抑制miR-143的表達(dá)能夠延緩失神經(jīng)支配腓腸肌的萎縮。綜上所述，本研究認(rèn)為，miR-143在體內(nèi)對(duì)肌肉的分化發(fā)育具有一定的調(diào)控作用，抑制miR-143表達(dá)可減緩由失神經(jīng)造成的肌肉萎縮，對(duì)肌損傷也有一定程度的修復(fù)作用。

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責(zé)任編輯：張愛(ài)婷

Effect of MicroRNA-143 on Myofiber of Denevated Muscle Atrophy in Mouse

ZHANG Hui-na, ZHANG Wei-ran, WANG Yi-min, LIU Xin-feng, GUO Hong, DING Xiang-binCorrespondingAuthor
（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

To investigate the effects of microRNA-143（miR-143）on denervated muscle atrophy in mouse，an amyotrophia mouse model of sciatic nerve resection was established, 10 nmol miR-143 mimics or 10 nmol miR-143 inhibitors were injected to denevated gastrocnemius. Then, the expression of miR-143 was detected by qRT-PCR, the wet weight of gastrocnemius and the cross section diameter of the muscle fibers were compared between the atrophying skeletal muscle and control. The results showed that the diameter of myofiber injected with miR-143 mimics was significantly lower than that of control group while the diameter of myofiber injected with miR-143 inhibitors was significantly higher than that of control group. The results suggested that miR-143 played a role in repairing denervated muscle atrophy.

microRNA-143; mouse; denevation; muscle atrophy; muscle fiber; gastrocnemius

P641.131；S152.72

：A

2017-03-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目“牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化相關(guān)miRNAs的鑒定和功能研究”（31201021）；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201510061006）；天津市“131”創(chuàng)新型人才培養(yǎng)工程第二層次人選資助項(xiàng)目（無(wú)編號(hào)）

張會(huì)娜（1991-），女，河南平頂山人，本科在讀，研究方向?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞工程。E-mail：977841573@qq.com。張蔚然（1992-），男，山東平度人，碩士在讀，研究方向?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞與轉(zhuǎn)基因工程。E-mail：zhangweiran1992@sina.com。張會(huì)娜和張蔚然對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)，為并列第一作者。

丁向彬（1978-），男，河南南陽(yáng)人，副教授，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物胚胎工程與繁殖生物技術(shù)。E-mail：xiangbinding@163.com。

1008-5394（2017）02-0039-05