藍(lán)日國，張書晴，張金秋，苗晉鋒，通信作者

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國家獸醫(yī)疫苗工程技術(shù)研究中心，南京 210014）

豬流行性腹瀉病毒YL112株的M基因序列分析及其在Vero細(xì)胞的傳代適應(yīng)性研究

藍(lán)日國1，張書晴1，張金秋2，苗晉鋒1，通信作者

（1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國家獸醫(yī)疫苗工程技術(shù)研究中心，南京 210014）

為了解PEDV YL112株與其他不同來源PEDV毒株之間在分子生物學(xué)上的差異，對(duì)PEDV YL112株的M基因進(jìn)行了擴(kuò)增和序列分析。結(jié)果表明：PEDV YL112株與參考株的M基因核苷酸同源性在97.9%～99.8%之間，顯示出高度保守性。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，PEDV YL112株與經(jīng)典株CV777的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與我國地方流行毒株HLJBY分離株以及HN-XYYYP-2007的親緣關(guān)系較近。為進(jìn)一步了解該毒株的復(fù)制特征，采用Vero 細(xì)胞對(duì)PEDV YL112株進(jìn)行體外細(xì)胞傳代適應(yīng)性研究。結(jié)果表明：經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)后，PEDV YL112株對(duì)Vero細(xì)胞的適應(yīng)性顯著增強(qiáng)，其滴度從第5代的 104.8TCID50/0.1mL 提高至第 40 代的 107.6TCID50/0.1mL。本研究對(duì)于分析PEDV的遺傳變異規(guī)律、了解病毒的致病特征及開發(fā)新型疫苗等均具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。

PEDV YL112株；M基因；序列分析；Vero細(xì)胞；適應(yīng)性

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、水樣腹瀉、脫水和仔豬的高死亡率為特征[1-2]。各個(gè)階段的豬群都會(huì)發(fā)病，尤其是10日齡以內(nèi)的仔豬，死亡率高達(dá)100%。近年來，PED在我國呈高發(fā)趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。

PEDV屬于尼多病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coraonavirus），是具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長約28 knt，主要編碼纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）、囊膜蛋白（E）和核衣殼蛋白（N）等[5]。其中 M蛋白在病毒的組裝和出芽過程中起著關(guān)鍵的作用，它不僅與E蛋白一起完成病毒囊膜的組裝過程，還可以指導(dǎo)S蛋白[6-7]和核衣殼[8]形成具有出芽能力的病毒顆粒。機(jī)體在M蛋白刺激下會(huì)產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IFN-α和調(diào)控病毒的表達(dá)。因此，M蛋白可用于研制PEDV的基因工程疫苗[9-11]。

雖然PEDV只有一個(gè)血清型，但各毒株的基因組之間卻存在差異[12]。近年來，對(duì)我國流行的PEDV毒株出現(xiàn)變異的報(bào)道不斷增多[13-14]。本研究采用生物信息學(xué)軟件對(duì)PEDV YL112株的M基因進(jìn)行分析，并與GenBank登錄的PEDV參考序列進(jìn)行核苷酸同源性比較，然后構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以闡明PEDV YL112株的M基因與參考毒株的M基因之間在分子生物學(xué)水平上的差異，并采用Vero細(xì)胞對(duì)PEDV YL112株進(jìn)行體外適應(yīng)性培養(yǎng)，為今后開展 PEDV的流行病學(xué)研究、病原學(xué)研究及疫苗的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒和細(xì)胞

PEDV YL112株由廣西麗原生物股份有限公司于2009年11月至2010年3月期間，分離自廣西玉林市某疑似感染PEDV的豬場。Vero細(xì)胞由廣西麗原生物股份有限公司研發(fā)部提供，經(jīng)檢測無外源病毒或支原體污染。

1.2 試劑

胰酶、胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基均購自Gibco公司；病毒核酸提取試劑盒（TaKaRaMini BESTViralRNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒【PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）】均購自寶生物（大連）工程有限公司；PCR酶FastStart Universal SYBR Green Master （ROX）（Cat.No.04 913 850 001）購自Roche公司；無水乙醇、瓊脂糖、DL2000 DNAMarker等購自南京壽德試驗(yàn)器材有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen公司。

1.3 引物

根據(jù)GenBank報(bào)告的PEDV M 基因序列（登錄號(hào) DQ072726），利用 Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)引物，用于擴(kuò)增PEDV的全長M 基因（854 bp），引物序列如下：

上游引物P1：5′-ACACCTATAGGGCGCCTG TA-3′；

下游引物P2：5′-AACCCTAAGAGGGGCATA GA-3′。

引物由上海英駿生物工程有限公司合成。

1.4 PEDV YL112株 M基因的擴(kuò)增

取200 μL細(xì)胞毒，用TaKaRa核酸提取試劑盒提取病毒RNA，溶于30 μL的RNase Free dH2O中，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ缓蟀凑誘aKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：37 ℃作用15 min，85 ℃作用5 s，暫存4 ℃，完成后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｏ乱徊竭M(jìn)行M基因的PCR擴(kuò)增，在25 μL反應(yīng)體系中加入1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，相應(yīng)的上、下游引物各10 pmol，Mix12.5 μL，滅菌三蒸水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物（擴(kuò)增長度 854 bp）于 2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)下觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果后，按照Axygen公司的凝膠回收試劑盒說明回收PCR產(chǎn)物后，送往上海華大基因測序。

1.5 PEDV YL112株M基因遺傳進(jìn)化分析

用DNAStar軟件將PEDV YL112株M基因測序結(jié)果與GenBank登錄的PEDV不同毒株的M基因序列進(jìn)行核苷酸同源性分析，并應(yīng)用生物信息學(xué)軟件MEGA 7. 0繪制系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ方法，比對(duì)值為1 000次重復(fù)）。參考毒株見表1。

表1 PEDV參考毒株

1.6 Vero細(xì)胞染色體的制備及核型分析

將Vero細(xì)胞用含10% FBS的DMEM進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，并記錄每代Vero細(xì)胞長成致密的單層所需的時(shí)間。向處于對(duì)數(shù)生長期的Vero細(xì)胞中加入適量的秋水仙素使其終濃度為0.1 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)5～6 h后，消化、離心并棄上清。于離心管中加入7 mL 0.075 mol/L的氯化鉀溶液，低滲處理細(xì)胞30 min后，向其中加入少量新鮮配制的固定液（V甲醇:V冰醋酸＝3:1），輕輕混勻后置于37 ℃水浴10 min，1 000 r/min離心10 min，棄上清。沿管壁緩慢加入上述固定液8 mL，輕輕混勻后于37 ℃水浴20 min，1 000 r/min離心10 min，棄上清，重復(fù)該步驟3次。第3次棄上清后于離心管中加入0.5 mL固定液，輕輕重懸細(xì)胞。用該細(xì)胞懸液向已預(yù)冷的載玻片上滴片（2～3滴/片），姬姆薩染液染色5～10 min后，用細(xì)水沖去多余染料。于油鏡下觀察細(xì)胞染色體核型，并記錄其染色體的數(shù)量。

1.7 PEDV YL112株的體外細(xì)胞適應(yīng)性傳代

將 PEDV YL112毒株用含 10 μg/mL胰酶的DMEM作10-4稀釋，接種于正常生長的Vero細(xì)胞，每瓶1 mL，37 ℃、5% CO2條件下吸附1 h后，每個(gè)小方瓶補(bǔ)充4 mL含有10 μg/mL胰酶的DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，待細(xì)胞80%出現(xiàn)病變時(shí)收獲病毒，放置于-70 ℃保存，得第1代毒。同樣方法，將上述第1代毒在Vero細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)性傳代。收集各代次病毒，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 毒價(jià)測定

將常規(guī)培養(yǎng)的Vero細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞達(dá)到90%融合度時(shí)，棄去培養(yǎng)液，并用無菌PBS清洗細(xì)胞兩遍。然后將PEDV YL112病毒按 10倍比稀釋法用維持液（含有 10 μg/mL胰酶的DMEM）進(jìn)行梯度稀釋，10-1～10-8每個(gè)稀釋度分別接種于96孔板中的Vero細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種5孔，每孔100 μL，并設(shè)置5孔細(xì)胞對(duì)照。37 ℃、5% CO2條件下吸附1 h后，加入維持液至200 μL，置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。逐日觀察，記錄結(jié)果。從原代起，每隔5代進(jìn)行一次病毒含量測定。按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

2 結(jié)果

2.1 PEDV YL112株細(xì)胞毒M基因的擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果出現(xiàn)長度約850 bp的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。

圖1 PEDV YL112株M基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 PEDV YL112株M基因的遺傳進(jìn)化分析

測序結(jié)果顯示，PEDV YL112株M基因序列長度為854 bp，無插入或缺失。運(yùn)用DNAStar軟件將該序列與GenBank登錄的PEDV不同毒株的M基因進(jìn)行核苷酸同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn) PEDV YL112株與各參考株的 M基因核苷酸同源性在97.9%～99.8%之間。用Mega5.0繪制M基因系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖2所示。

圖2 PEDV YL112株M基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

分析發(fā)現(xiàn)，包括PEDV YL112株在內(nèi)的21株P(guān)EDV毒株明顯分成了兩個(gè)群，其中一群是以經(jīng)典毒株CV777為代表的早期流行毒株，2010年前分離的所有參考毒株均屬于該群；另外一群均為2010年以后出現(xiàn)的中國地方流行毒株。從進(jìn)化樹中可以看出，PEDV YL112株是早期流行毒株群成員之一，但其在群內(nèi)與經(jīng)典毒株CV777的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與我國地方流行毒株 HLJBY以及HN-XYYYP-2007的親緣關(guān)系較近（圖2）。

2.3 Vero細(xì)胞染色體特征及數(shù)目

仔細(xì)觀察吉姆薩染色后的Vero細(xì)胞染色體標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)所用的Vero細(xì)胞染色體數(shù)目眾多，且大小差異較大（圖3）。在顯微鏡下記錄一個(gè)完整細(xì)胞的染色體數(shù)目，約為 59～60條，即 2n＝59～60，與預(yù)期結(jié)果一致。

圖3 Vero細(xì)胞核型分析（100×）

2.4 PEDV YL112株的體外細(xì)胞傳代適應(yīng)性

由毒價(jià)測定結(jié)果可知（表2），隨著 PEDV YL112株連續(xù)傳代次數(shù)增加，病毒滴度也逐漸提高，從第5代的 104.8TCID50/0.1mL 提高至第35代的107.6TCID50/0.1mL。繼續(xù)傳代至40代，病毒滴度基本穩(wěn)定在較高水平（107.6TCID50/0.1mL），沒有進(jìn)一步的顯著提升。

表2 PEDV YL112株各代次毒價(jià)測定情況

3 討論

PEDV疫苗很早就應(yīng)用于豬流行性腹瀉的防控，但該病依舊在免疫豬群發(fā)生。尤其是2010年以來，我國多個(gè)省份相繼出現(xiàn)PED的爆發(fā)，導(dǎo)致大量新生仔豬發(fā)病死亡，嚴(yán)重影響了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。該病的再次流行引起了人們的廣泛關(guān)注。

2009年11月至2010年3月期間，廣西玉林市某豬場疑似感染PEDV。本研究首先對(duì)分離于該地區(qū)的PEDV YL112株進(jìn)行了M基因的核苷酸同源性分析，發(fā)現(xiàn)該毒株與各參考毒株M基因之間的核苷酸同源性在97.9%～99.8%之間，顯示出M基因在PEDV毒株進(jìn)化過程中具有高度的保守性。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，PEDV YL112株與經(jīng)典疫苗株CV777的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與我國地方流行毒株HLJBY及HN-XYYYP-2007的親緣關(guān)系較近。從時(shí)間維度來看，2010年以前中國流行的PEDV毒株大都與經(jīng)典毒株CV777相似性較高，而2010年以來，PEDV中國流行毒株開始出現(xiàn)變異現(xiàn)象[15]，PEDV YL112株正好處于過渡階段，與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果一致（圖2）。該結(jié)果表明廣西地區(qū)當(dāng)時(shí)出現(xiàn)的流行株與早期使用的疫苗株相比已發(fā)生變異，這與臨床上常規(guī)疫苗免疫預(yù)防效果差的現(xiàn)象相符[16]。這也提示要進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)PEDV的分子流行病學(xué)調(diào)查和病原生態(tài)學(xué)研究，為制定合理的免疫預(yù)防策略提供及時(shí)有效的數(shù)據(jù)參考。

PEDV的體外細(xì)胞適應(yīng)一直是制約病原研究及疫苗開發(fā)的瓶頸。目前，普遍認(rèn)為添加了胰酶的Vero細(xì)胞可以用于PEDV的分離培養(yǎng)[17-18]。為進(jìn)一步了解PEDV YL112株的復(fù)制特征，本研究采用Vero 細(xì)胞對(duì)該毒株進(jìn)行體外適應(yīng)性傳代。試驗(yàn)用于培養(yǎng)病毒的Vero細(xì)胞形態(tài)正常，生長狀況良好，細(xì)胞核型正確，符合病毒培養(yǎng)的需要。通過對(duì)病毒連續(xù)傳代，發(fā)現(xiàn)隨著代次的增加，病毒的滴度也逐漸提高，最后達(dá)到了107.6TCID50/0.1mL，并且維持在較高水平，表明該毒株高度適應(yīng)了Vero細(xì)胞培養(yǎng)。這對(duì)于進(jìn)一步了解該毒株的致病性、免疫原性及后續(xù)的疫苗研究均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究對(duì)PEDV YL112株進(jìn)行了M基因的擴(kuò)增和序列分析，對(duì)該毒株在PEDV國內(nèi)流行毒株遺傳進(jìn)化上的地位有了初步的認(rèn)識(shí)。同時(shí)，將PEDV YL112株在Vero細(xì)胞上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使毒株高度適應(yīng)了 Vero細(xì)胞，成功獲得高滴度的PEDV細(xì)胞毒株，為下一步進(jìn)行 PEDV的致病性研究及疫苗開發(fā)提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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責(zé)任編輯：宗淑萍

Sequence Analysis of the M gene of Porcine Epidemic Diarrhea VirusYL112 Strain and Its Adaptation to Vero Cells

LAN Ri-guo1, ZHANG Shu-qing1, ZHANG Jin-qiu2, MIAO Jin-feng1,CorrespondingAuthor
(1. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2.National Research Center for Veterinary Vaccine Engineering and Technology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China)

To analyze the genetic variation between PEDV YL112 strain and other isolates, the M gene of PEDV YL112 strain was amplified and sequenced. The M gene of PEDV YL112 strain shared 97.9%-99.8% homology with PEDV reference strains.Phylogenetic analysis indicated that PEDV YL112 strain was genetically close to isolates HLJBY and HN-XYYYP-2007 rather than the classic strain CV777. Furthermore, adaptation of PEDV YL112 to Vero cells was conducted and its titer significantly increased from 104.8TCID50/0.1mL to 107.6TCID50/0.1mL by cellular adaptation. These results may contribute to further study on the genetic evolution, viral virulence and new vaccines of PEDV.

PEDV YL112; M gene; sequence analysis; Vero cells; adaptation

S858.28

：A

2017-03-29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“線粒體MAVS 蛋白在抗H3N2亞型豬流感病毒感染過程中的作用”（31201873）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“肌醇磷脂-Ca2+-NFAT途徑在?；撬峋徑馊榉挎溓蚓腥局械淖饔谩保?1672515）

藍(lán)日國（1993-），男，廣西梧州人，本科在讀，主要從事動(dòng)物健康調(diào)控的研究。

苗晉鋒（1976-），男，河南新鄉(xiāng)人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物健康調(diào)控的研究。E-mail：mjf171647@126.com。

1008-5394（2017）02-0034-05