郭菊玲++楊勇幫++趙玉梅

摘要：目的采用纖維素酶法及澄清工藝提取彝藥露水草中β-蛻皮激素。方法纖維素酶法：加入纖維素酶，從其影響因素pH值，酶加入量，酶解溫度及酶解時(shí)間入手，采用L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出最優(yōu)提取工藝流程；澄清工藝：加入不同類型及不同比例的澄清劑。結(jié)果pH值45，酶加入量9 mg，酶解溫度40℃，酶解時(shí)間30 min；殼聚糖澄清劑及ZTC1+1-Ⅱ型澄清劑A：B（2：8）澄清效果最佳。結(jié)論該工藝提取過程簡單、高效、節(jié)約成本，為改進(jìn)生產(chǎn)企業(yè)從露水草中提取β-蛻皮激素的提取工藝提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：β-蛻皮激素；提??；纖維素酶；澄清劑；峰面積；透光率；提取工藝

中圖分類號：R2842文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B文章編號：1007-2349（2017）07-0070-04

露水草（Cyanotis arachnoides CBClarke）又名珍珠露水草，雞冠參等，屬鴨跖草科藍(lán)耳草屬多年生草本植物，其根可以入藥，夏秋采集，洗凈，鮮用或曬干。露水草有祛風(fēng)活絡(luò)，利濕消腫，退虛弱等功效。用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腰腿痛，腎炎水腫，虛熱不退；外用治濕疹，腳癬，刀傷。隨著科學(xué)研究的進(jìn)步，近年來對露水草有效成分的研究也越來越深入，露水草中含有的β-蛻皮激素被廣泛用于養(yǎng)殖、保健、化妝品、醫(yī)藥行業(yè)[1]。

蛻皮激素作用于人體有促進(jìn)膠原蛋白合成、抗心律不齊、抗疲勞；促進(jìn)細(xì)胞生長、刺激真皮細(xì)胞分裂，排除體內(nèi)的膽固醇；降血脂，抑制血糖上升；通經(jīng)活絡(luò)，除濕鎮(zhèn)痛，等生理活性。是天然的抗癌制劑。露水草蛻皮激素自1976年問世以來，已研制不定期片劑、針劑、膏劑。民間用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，治療不同癥狀的風(fēng)濕及關(guān)節(jié)炎患者有較好療效，其有效成分20-羥基蛻皮甾酮經(jīng)臨床研究證明具有直接降血糖作用，對II型糖尿病總有效率84%，對改善糖尿病患者“三多一少”癥狀尤為明顯。

在運(yùn)動保健品方面，蛻皮激素具有顯著的通過增加氨基酸裝配成蛋白鏈，從而刺激肌肉細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)合成的能力，而且該能力回溯至蛋白質(zhì)生長的轉(zhuǎn)譯和遷移過程。蛻皮激素不僅有益于健康而且安全，其有助于穩(wěn)定在皮質(zhì)醇傷害時(shí)的細(xì)胞，使能量合成步驟正常化（ATP和肌氨酸）和改善肝功能從而使有機(jī)體能迅速地適應(yīng)環(huán)境和壓力變化。其安全性很高，經(jīng)超過50次的研究顯示蛻皮激素沒有副作用，沒有與荷爾蒙的相互作用，毒性水平也極低。當(dāng)1998年ICN生化實(shí)驗(yàn)室對其進(jìn)行測試時(shí)，數(shù)據(jù)顯示蛻皮激素要顯示出毒性必須達(dá)到6400 mg/kg的超高劑量。而且，在包含測試睪固酮，皮質(zhì)醇，胰島素，促皮質(zhì)素，生長激素和黃體生成激素的內(nèi)分泌測試中，沒有任何蛻皮激素對哺乳動物荷爾蒙系統(tǒng)作用的報(bào)道。

在蠶業(yè)養(yǎng)殖上，用于促使桑蠶齡期縮短，上簇整齊，促進(jìn)吐絲結(jié)繭；蛻皮激素是水生甲殼類——蝦、蟹類生長發(fā)育、脫殼變態(tài)所必須的物質(zhì)，是“脫殼素”的主要原料；該品適用于蝦、蟹等水產(chǎn)甲殼類及地憋蟲的人工養(yǎng)殖，添加該品后可使蝦、蟹順利脫殼，促進(jìn)蝦、蟹類脫殼的一致性，有效避免個(gè)體間的互相殘殺，顯著提高養(yǎng)殖成活率和商品規(guī)格。

在化妝品上，一般使用的是經(jīng)過特殊處理后的高純度的蛻皮激素也叫“蛻皮甾酮”，呈純白色結(jié)晶性粉末或無色的透明結(jié)晶體，成分單一，對皮膚無過敏反應(yīng)，具有很強(qiáng)的滲透性，在液態(tài)狀態(tài)下能快速被皮膚吸收；能增強(qiáng)細(xì)胞新陳代謝及活化的有效物質(zhì)，具有良好的去角質(zhì)、去斑增白作用，對面部黃褐斑、外傷性黑斑、雀斑、黑色素沉著等有很好的修復(fù)功效，另對粉刺亦有明顯效果。

可見β-蛻皮激素藥用價(jià)值極高，成為科學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，因此，從露水草中如何高效地提取β-蛻皮激素成為了研究的關(guān)鍵。

本實(shí)驗(yàn)為了探索從露水草中提取β-蛻皮激素的最佳工藝流程，試圖采用纖維素酶法[2]及澄清工藝進(jìn)行提取[3-6]。從影響酶解的因素：PH值、酶加入量、酶解時(shí)間及酶解溫度入手，通過實(shí)驗(yàn)得出一個(gè)最優(yōu)的提取工藝流程。

1材料和方法

11試驗(yàn)材料及試劑露水草干粉，β-蛻皮激素（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司 北京北化恒信生物技術(shù)有限公司20140722），纖維素酶（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司20150107 酶活力/（U/g>150000）），ZTC1+1-Ⅱ型澄清劑A組分（北京正天成澄清技術(shù)有限公司），ZTC1+1-Ⅱ型澄清劑B組分（北京正天成澄清技術(shù)有限公司），殼聚糖，冰醋酸，醋酸鈉，氫氧化鈉試液，70%乙醇，純化水，乙腈。

12儀器與設(shè)備電子天平（賽多利斯BSA224S-CW），電子天平（賽多利斯BP211D-OCE），三合一電極酸度計(jì)（ORION 3 STAR Thermo ELECTRON CORPORATION），超聲波清洗儀（CPXS800H-C 心能信超聲上海有限公司），高效液相色譜儀（安捷倫1260DAD），高速臺式離心機(jī)（TGL-10B 上海安亭科學(xué)儀器廠），紫外可見分光光度計(jì)（安捷倫Cary60），流水式粉碎機(jī)（YE3-1 永歷制藥機(jī)械有限公司），水浴振蕩器（SZX-B金壇市大地自動化儀器廠），數(shù)顯恒溫水浴鍋（XMTD 余姚市亞星儀器儀表有限公司）。

13纖維素酶法取露水草干粉各1 g，加入所設(shè)酶加入量，精密加所設(shè)pH值的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液25 mL，按所設(shè)溫度及所設(shè)浸漬時(shí)間處理樣品，再將各樣品超聲處理30 min，之后將各樣品進(jìn)行離心（3000 r 10 min）處理，精密量取上清液2 mL，水浴鍋上蒸干，用70%乙醇溶解，定容至50 mL，微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定，ZORBAX SB-C18柱（150mm×46 mm），流動相乙腈-水（17：83），柱溫30℃，流速10 mL/min，檢測波長240 nm。

14澄清工藝

141ZTC1+1-Ⅱ型澄清劑的配制A組分溶液：稱取10 gA組分細(xì)粉，先用少量水溶解，充分?jǐn)嚢璩珊隣?，再加水?00 mL，溶脹24 h以上，攪拌，制成1%的粘膠液。

B組分溶液：稱取10 gB組分細(xì)粉，先用少量1%醋酸溶液溶解，充分?jǐn)嚢璩珊隣?，再?%醋酸溶液至100 mL，溶脹24 h以上，攪拌，制成1%的粘膠液。

142殼聚糖澄清劑的配制稱取10 g殼聚糖細(xì)粉，先用少量1%醋酸溶液溶解，充分?jǐn)嚢璩珊隣?，再?%醋酸溶液至100 mL，溶脹24 h以上，攪拌，制成1%的粘膠液。

143試驗(yàn)方法分別稱取樣品8份，每份各10 g，精密加pH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液25 mL，48℃浸漬05 h，超聲處理30 min，1號樣品作為空白對照，2號樣品加入A組分1 mL，3號樣品加入B組分1 mL，4號樣品加入殼聚糖1 mL，5-9號樣品依次按AB組分溶液比例為2：8、4：6、5：5、6：4、8：2，分別先加入B組分溶液為：08 mL、06 mL、05 mL、04 mL、02 mL，振搖30 min，再加入A組分溶液為：02 mL、04 mL、05 mL、06 mL、08 mL，繼續(xù)振蕩15 h，過濾，采用紫外分光光度法測定。

2纖維素酶法影響因素分析及結(jié)論

21pH值的影響取露水草干粉各1 g，加入酶各6 mg，精密加25 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，pH值為35、40、45、50、55、60，48℃浸漬15 h，再將各樣品超聲處理30 min，之后將各樣品進(jìn)行離心（3000r 10 min）處理，精密量取上清液2 mL，水浴鍋上蒸干，用70%乙醇溶解，定容至50 mL，微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定[1]。測定結(jié)果見表1、圖1。

結(jié)果分析：由A1：A2=C1：C2得出峰面積與濃度成正比，根據(jù)上圖趨勢可以看出，控制變量條件下pH=5為最佳酶解pH值。

22酶加入量的影響取露水草干粉各1 g，酶加入量為4，6，9，15，18，20 mg，精密加pH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液25 mL，48℃浸漬15 h，再將各樣品超聲處理30 min，之后將各樣品進(jìn)行離心（3000 r 10 min）處理，精密量取上清液2 mL，水浴鍋上蒸干，用70%乙醇溶解，定容至50 mL，微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定。測定結(jié)果見表2、圖2。

結(jié)果分析：根據(jù)上圖趨勢可以看出，控制變量條件下18 mg為最佳酶加入量。

23酶解溫度的影響取露水草干粉各1 g，酶加入量為6 mg，精密加pH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液25 mL，分別設(shè)定溫度為20，30，40，50，60℃，浸漬15 h，再將各樣品超聲處理30 min，之后將各樣品進(jìn)行離心（3000 r 10 min）處理，精密量取上清液2 mL，水浴鍋上蒸干，用70%乙醇溶解，定容至50 mL，微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定。測定結(jié)果見表2、圖3。

結(jié)果分析：根據(jù)上圖趨勢可以看出，控制變量條件下，50℃為最佳酶解溫度。

24酶解時(shí)間的影響取露水草干粉各1 g，酶加入量為6mg，精密加PH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液25 mL，48℃浸漬05 h，10 h，15 h，20 h，25 h，30 h，再將各樣品超聲處理30 min，之后將各樣品進(jìn)行離心（3000 r 10 min）處理，精密量取上清液2 mL，水浴鍋上蒸干，用70%乙醇溶解，定容至50 mL，微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定。測定結(jié)果見表4、圖4。

結(jié)果分析：根據(jù)上圖趨勢可以看出，控制變量條件下，05 h為最佳酶解時(shí)間。

25正交試驗(yàn)當(dāng)影響一個(gè)實(shí)驗(yàn)的因素太多時(shí)，我們應(yīng)該考慮利用正交試驗(yàn)選擇一部分有代表性的點(diǎn)水平組合進(jìn)行試驗(yàn)，從而對諸多的影響因素進(jìn)行綜合分析，以便于考慮各個(gè)因素之間的相互關(guān)系。正交試驗(yàn)就是利用排列整齊的表——正交表來對試驗(yàn)進(jìn)行整體設(shè)計(jì)、綜合比較、統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)現(xiàn)通過少數(shù)的實(shí)驗(yàn)次數(shù)找到較好的生產(chǎn)條件，以達(dá)到最高生產(chǎn)工藝效果。正交表能夠在因素變化范圍內(nèi)均衡抽樣，使每次試驗(yàn)都具有較強(qiáng)的代表性，由于正交表具備均衡分散的特點(diǎn)，保證了全面實(shí)驗(yàn)的某些要求，這些試驗(yàn)往往能夠較好或更好的達(dá)到實(shí)驗(yàn)的目的。

本實(shí)驗(yàn)主要探究纖維素酶法提取露水草中β-蛻皮激素的四個(gè)參數(shù)：PH值（A），酶加入量（B），酶解溫度（C）及酶解時(shí)間（D）對提取率的影響。采用L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，力求找到纖維素酶法提取β-蛻皮激素的最佳工藝流程。本次試驗(yàn)采取β-蛻皮激素的峰面積為評價(jià)指標(biāo)來選擇最佳提取條件。正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。

結(jié)果分析：從正交試驗(yàn)極差分析可知，pH值，酶加入量，酶解溫度，酶解時(shí)間對β-蛻皮激素提取率的影響程度為：酶解溫度>酶解時(shí)間>pH值>酶加入量。最佳酶解條件為A1B3C2D1，即PH值為45，酶加入量為9 mg，酶解溫度為40℃，酶解時(shí)間為05 h。

3澄清劑的選擇

31高效液相色譜法測定分別稱取樣品8份，每份各10 g，精密加pH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液25 mL，48℃浸漬05 h，超聲處理30 min，1號樣品加入A組分1 mL，2號樣品加入B組分1 mL，3號樣品加入殼聚糖1 mL，4-8號樣品依次按A、B組分[7]溶液比例為2：8、4：6、5：5、6：4、8：2，分別先加入B組分溶液為：08、06、05、04、02 mL，振搖30 min，再加入A組分溶液為：02、04、05、06、08 mL，繼續(xù)振蕩15 h，離心（3000 r 10 min）處理，精密量取各樣品上層清液2 mL，水浴鍋上蒸干，用70%的乙醇溶解，定容至50 mL，微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定。測定結(jié)果見表6、圖5。

結(jié)果分析：通過比較使用不同組分澄清劑的各個(gè)樣品的峰面積，可以看出澄清劑的加入不影響其提取率。

32紫外可見分光光度法測定分別稱取樣品8份，每份各10 g，精密加PH為5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液25 mL，48℃浸漬05 h，超聲處理30 min，1號樣品作為空白對照，2號樣品加入A組分1 mL，3號樣品加入B組分1ml，4號樣品加入殼聚糖1 mL，5-9號樣品依次按AB組分溶液比例為2：8、4：6、5：5、6：4、8：2，分別先加入B組分溶液為：08、06、05、04、02 mL，振搖30 min，再加入A組分溶液為：02、04、05、06、08 mL，繼續(xù)振蕩15 h，過濾，采用紫外分光光度法測定。測定結(jié)果見表7、圖6。

結(jié)果分析：根據(jù)圖表可以看出殼聚糖及ZTC1+1-Ⅱ型澄清劑A：B（2：8）澄清效果最佳，而靜置時(shí)間對其澄清效果影響不明顯。

4小結(jié)

采用纖維素酶法及澄清工藝提取彝藥露水草中β-蛻皮激素實(shí)驗(yàn)中，通過L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出最優(yōu)提取工藝流程：pH值45，酶加入量9 mg，酶解溫度40℃，酶解時(shí)間05 h。通過加入不同類型及不同比例的澄清劑，分析結(jié)果得出殼聚糖澄清劑及ZTC1+1-Ⅱ型澄清劑A：B（2：8）澄清效果最佳，而靜置時(shí)間對澄清效果影響不明顯。

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