李榮妮, 王 勤, 李新海, 鄧學(xué)梅, 吳常信

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 北京 100193)

“動(dòng)物遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)”教學(xué)中分子遺傳實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)舉例

李榮妮, 王 勤, 李新海, 鄧學(xué)梅, 吳常信

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 北京 100193)

利用實(shí)驗(yàn)室保存的果蠅特定突變品系,設(shè)計(jì)了從基因組的提取到基因分型的系列實(shí)驗(yàn)教學(xué)。針對(duì)果蠅體色突變的2個(gè)基因,建立基因擴(kuò)增、酶切、凝膠檢測(cè)方法,判定2個(gè)體色突變的基因型,利用基因型回推被檢果蠅的親本組合。實(shí)驗(yàn)對(duì)學(xué)生進(jìn)行分子遺傳實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基本訓(xùn)練,同時(shí),讓學(xué)生從分子層面理解等位基因相互作用和基因間的相互作用關(guān)系,并加深學(xué)生對(duì)表型選擇與基因型選擇的差別的理解。

動(dòng)物遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)； DNA提取； PCR-RFLP； 基因型判定； 親本分析

果蠅是經(jīng)典模式動(dòng)物,在遺傳學(xué)研究中具有重要意義。摩爾根以果蠅為實(shí)驗(yàn)材料,揭示了著名的連鎖遺傳規(guī)律,并根據(jù)研究結(jié)果創(chuàng)立了基因論[1]?！皠?dòng)物遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)”教學(xué)中也使用果蠅作為實(shí)驗(yàn)材料,對(duì)大學(xué)生進(jìn)行遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的訓(xùn)練和遺傳學(xué)理論的實(shí)踐。畜牧業(yè)中通過基因檢測(cè)促進(jìn)育種發(fā)展的實(shí)例很多,如雞綠殼蛋基因檢測(cè)[2]、雞矮小基因(dw)檢測(cè)[3]均提高了純系選育的速度,豬氟烷敏感基因檢測(cè)[4]加快了疾病凈化的進(jìn)程。教學(xué)中通過分子手段檢測(cè)動(dòng)物基因型,讓學(xué)生實(shí)際領(lǐng)會(huì)分子標(biāo)記在動(dòng)物育種和疾病檢測(cè)方面有重要作用。實(shí)驗(yàn)教學(xué)中也有畜禽功能基因檢測(cè)的備選實(shí)驗(yàn),但是,在實(shí)際采樣過程中,樣品的收集經(jīng)常會(huì)遇到困難,比如,豬氟烷敏感基因檢測(cè)雖然實(shí)踐意義很大,但是,隨著這一疾病的凈化,攜帶致病基因的豬越來越少,不能滿足常年教學(xué)的需要。用果蠅篩選克隆突變基因,建立突變品系,可以長(zhǎng)期保留實(shí)驗(yàn)材料,并可通過雜交創(chuàng)立各種基因型的組合,非常適合教學(xué)的需要。因此,在本實(shí)驗(yàn)室保存的果蠅黑檀體突變(e4)和黃體突變(y1)基礎(chǔ)上,建立了2個(gè)突變品系,在教學(xué)中將2個(gè)突變品系與不同的品系進(jìn)行雜交,產(chǎn)生不同基因型的后代,這些雜交后代就成為了實(shí)驗(yàn)教學(xué)的素材。

1 實(shí)驗(yàn)原理和實(shí)驗(yàn)教學(xué)材料準(zhǔn)備

1.1 實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)原理和思路

實(shí)驗(yàn)選擇2種體色突變的果蠅——黑檀體e4和黃體y1為教學(xué)實(shí)驗(yàn)材料。經(jīng)鑒定,e4是由于位于3號(hào)染色體上的黑檀體基因外顯子1缺失448bp堿基造成的突變[5],該突變導(dǎo)致黑色素大量合成,使果蠅外表呈現(xiàn)黑檀體色[6-8]；y1是由于位于X染色體上的黃體基因起始密碼子ATG突變?yōu)镃TG[9],而導(dǎo)致黑色素不能正常合成,突變呈淺黃色[6,10]。

根據(jù)e4突變位點(diǎn)特征設(shè)計(jì)了合適引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)凝膠檢測(cè)后,e4純合個(gè)體可得到174bp產(chǎn)物,而正常野生型可得到622bp產(chǎn)物,雜合體可得到2個(gè)產(chǎn)物174bp和622bp。因而可直接從凝膠電泳條帶區(qū)分e4純合體、雜合體和野生型,其凝膠電泳結(jié)果見圖1。

圖1 黑檀體(e4)、野生型及其雜合子電泳圖

根據(jù)y1突變特征設(shè)計(jì)引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增可得到含突變點(diǎn)的396bp片段,在突變點(diǎn)有Alw44Ⅰ限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn),可被酶切成300bp和96bp2個(gè)片段,野生型因無酶切識(shí)別位點(diǎn)而不能被切開,仍為396bp,而雜合子產(chǎn)物經(jīng)酶切后一條片段可被切開,另一條不能切開,從而呈現(xiàn)3條帶396bp、300bp和96bp,進(jìn)而可根據(jù)凝膠電泳條帶判別y1純合子、雜合子和野生型。其凝膠電泳結(jié)果見圖2。

圖2 黃體(y1)、野生型及其雜合子電泳圖

經(jīng)過雜交,可獲得黑檀體雜合子、黃體雜合子,結(jié)合純合子和野生型等各種基因型組合,對(duì)學(xué)生進(jìn)行分組,引導(dǎo)學(xué)生檢測(cè)果蠅的基因型,根據(jù)基因型、表型和性別等特征在幾種可能的雜交組合中推斷其親本的來源。培養(yǎng)和鍛煉學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作和理論推導(dǎo)能力。

1.2 實(shí)驗(yàn)教學(xué)材料——果蠅品系的準(zhǔn)備

取y1♂與e4♀雜交,則F1♂外表為黃體,基因型(+e;y-)標(biāo)記為A；F1♀外表為野生型,基因型(+e;y+),標(biāo)記為B。正常野生型++♀,基因型為(++;++),標(biāo)記為C；y1♂,基因型為(++; y-),標(biāo)記為D；e4♀基因型為(ee; ++),標(biāo)記為E。整個(gè)實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)組合分為3組：A和D為第一組,2種果蠅外表完全相同,基因型不同；B和C為第二組，2種果蠅外表完全相同,基因型也不同；B和E為第三組,2種果蠅外表不相同,基因型也不同。學(xué)生2人為一組,可從上面3組果蠅中隨機(jī)選擇一組,每人分別檢測(cè)其中一種果蠅。

其中y1、e4和++,3個(gè)品系均由我校動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院動(dòng)物遺傳資源與分子育種實(shí)驗(yàn)室的果蠅保種室長(zhǎng)期保存。

1.3 試劑和儀器準(zhǔn)備

本實(shí)驗(yàn)教學(xué)采用無機(jī)試劑高鹽法提取果蠅基因組DNA[11]。實(shí)驗(yàn)前需配置試劑如下[12]：

(1) BufferA: 100 mM(mmol/L)Tris-Cl(ph7.5)(溶于水后用HCl調(diào)pH值)、100 mM EDTA、100 mM NaCl、0.5% SDS,混合后室溫保存；

(2) BufferB:200 ml 5 M乙酸鉀、500 ml 6 M 氯化鋰,混合后4 ℃保存；

(3) 異丙醇；

(4) 70%乙醇；

(5) ddH2O。

PCR擴(kuò)增需要試劑為2×Taq PCR Mix,酶切需要Alw44Ⅰ限制性內(nèi)切酶。

所需儀器為干式恒溫器、漩渦混勻儀、離心機(jī)、PCR儀、電子天平、凝膠和成像系列儀器、移液器、PCR管等。

以上果蠅材料和試劑均需實(shí)驗(yàn)教學(xué)課前準(zhǔn)備充足。

2 實(shí)驗(yàn)教學(xué)流程和步驟

教學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí),學(xué)生2人為一組,隨機(jī)從上面所準(zhǔn)備的3組果蠅中取一組,每組果蠅有2種,每種5只。2人共同觀察所取果蠅的表型和性別,每人分別檢測(cè)其中一種的e4和y1基因型。檢測(cè)流程為：提取基因組DNA→凝膠檢測(cè)基因組質(zhì)量→e4基因片段和y1基因片段擴(kuò)增→凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物→酶切y1的PCR產(chǎn)物→凝膠檢測(cè)酶切結(jié)果→膠圖分析出果蠅基因型→推斷所得果蠅的親本雜交方式→提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

2.1 果蠅基因組的提取

提取果蠅DNA,需要每個(gè)學(xué)生獨(dú)立操作,操作步驟如下[12]：

(1) 5只果蠅裝入1.5 mL離心管中,放于冰上直接使用；

(2) 向裝有果蠅的離心管中,分別加入BufferA50 μL,用燒熔閉合的1 mL槍頭或者小型研磨棒搗碎,再加入BufferA150 μL；

(3) 用混合儀混合樣品10 s,然后置于干式恒溫器中或者水浴65 ℃ 40 min,每10 min混合搖勻；

(4) 每管加400 ul BufferB,輕輕混勻后,冰浴30 min；

(5) 室溫下12 000 r/min離心15 min,吸取上清液約350 ul于另一組新的已標(biāo)號(hào)的1.5 ml離心管中；如需要可重復(fù)操作12 000 rpm離心和吸取上清液；

(6) 每管各加300 ul異丙醇充分混勻,室溫下12 000 r/min離心15 min；

(7) 棄上清,70%乙醇洗滌沉淀,室溫下風(fēng)干1 min；

(8) 風(fēng)干后的樣品加入25 μL ddH2O溶解(用槍頭反復(fù)吹打數(shù)次)；

(9) 溶解完全后放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 目的片段的擴(kuò)增和酶切

e4片段和y1片段PCR反應(yīng)體系相同,但引物不同。e4片段所用引物為：上游引物5’-TATCCACCACCGAACTGTAT-3’,下游引物5’-GGGCACATTATCGTACAA-3’； y1片段所用引物為：上游引物5’-TGATTACCCGAACACTGAAC-3’,下游引物5’-TCGCTCCTGAAGTTTGTAAG-3’。其反應(yīng)體系如表1,其中模板DNA是上面所提取的果蠅基因組DNA。

表1 PCR反應(yīng)體系

這一步操作可分組進(jìn)行,選擇4人一組,每人分別計(jì)算4人所需PCR體系成分加入量,從中選2人配制4人所需PCR預(yù)混體系,1人配制e4體系,1人配制 y1體系,另2人仔細(xì)觀察以防配制過程出錯(cuò)。最后每人分別移取自己所需PCR體系量19 ul后,分別加入自己所提取得果蠅DNA模板1 ul,混勻。全班一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增,程序如表2和表3。

表2 e4片段PCR反應(yīng)程序

表3 y1片段PCR反應(yīng)程序

PCR完成后,每個(gè)學(xué)生可直接取y1片段PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切,酶切體系如表4。體系的配置也可分組進(jìn)行,計(jì)算好所需配制總量,每組選一人配制,大家一起觀察,以防配制出錯(cuò)。最后每人分別移取自己所需酶切體系量5 ul后,分別加入自己上一步所得的y1片段PCR產(chǎn)物10 ul,混勻。將混勻好的酶切PCR體系放于恒溫37 ℃反應(yīng)4 h即可。

表4 y1片段PCR酶切體系

2.3 凝膠檢測(cè)

基因組DNA凝膠檢測(cè)和PCR產(chǎn)物凝膠檢測(cè)需要凝膠濃度1%,電壓120 V,25 min即可,而酶切產(chǎn)物需要2%,電壓120 V,25 min,經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)操作可以得到膠圖。黑檀體不同基因型和黃體不同基因型膠圖見圖1和圖2。

可8人一組,選3人進(jìn)行瓊脂糖凝膠配制,其他人計(jì)算所需瓊脂糖量和TBE緩沖液量,并仔細(xì)觀察操作是否正確。凝膠配制好后,每個(gè)人分別有序地將自己上一步所得PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物加入膠孔中,體驗(yàn)點(diǎn)樣操作過程。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析和提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告

實(shí)驗(yàn)操作結(jié)束后,每個(gè)學(xué)生根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得膠圖分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,判斷自己所提取DNA質(zhì)量、PCR效果以及酶切效果,進(jìn)而分析自己所得果蠅的基因型。根據(jù)同組2個(gè)人的基因型對(duì)比判斷各自的果蠅來自哪種親本雜交模式。例如,第一組(A和D),2位學(xué)生拿到的果蠅都是黃體雄蠅,若經(jīng)基因型鑒定基因型是e4雜合子和y1純合子,可推定其是y1♂與e4♀雜交所得的F1雄蠅；若基因型是e位點(diǎn)野生型和y位點(diǎn)y1純合子,則可推定為來自y1純繁的雄蠅。實(shí)驗(yàn)操作過程結(jié)束后,完成實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析和親本雜交模式分析,撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

4 結(jié)語

該實(shí)驗(yàn)包括果蠅DNA提取、PCR、酶切、電泳等實(shí)驗(yàn)操作,學(xué)生可以掌握單分子標(biāo)記鑒定的技術(shù)過程,經(jīng)過表型觀察與基因型鑒定的對(duì)比,可以將實(shí)際操作的結(jié)果與遺傳學(xué)理論相結(jié)合,理解基因型和表型的關(guān)系。最后學(xué)生根據(jù)基因型推斷果蠅的親本組合,使學(xué)生加深對(duì)遺傳學(xué)的分子本質(zhì)的理解,進(jìn)而讓學(xué)生領(lǐng)會(huì)到分子選育與表型選育的差別。因此,這一組實(shí)驗(yàn)是分子基本操作技術(shù)和遺傳分子基礎(chǔ)理論相結(jié)合的教學(xué)。

每年實(shí)驗(yàn)教學(xué)中,每個(gè)學(xué)生基本均能成功提取出果蠅基因組,成功擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物和得到正確酶切產(chǎn)物,并正確進(jìn)行基因分型。通過該教學(xué)實(shí)驗(yàn)的訓(xùn)練,使學(xué)生掌握基本的生物分子技術(shù)操作,并使學(xué)生打開了通過生物分子技術(shù)來研究并驗(yàn)證動(dòng)物遺傳規(guī)律的思路,同時(shí),也培養(yǎng)了學(xué)生科學(xué)的態(tài)度和團(tuán)隊(duì)精神,提高了其分析問題和解決問題的能力,為完成學(xué)生專業(yè)實(shí)驗(yàn)課程和從事科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)工作打下良好基礎(chǔ),總體實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果比較顯著。

將科研工作中不同階段的成果轉(zhuǎn)化成學(xué)生簡(jiǎn)單易懂、容易操作的教學(xué)實(shí)驗(yàn),要求教師在科研中注意積累教學(xué)資源,把科研的結(jié)果經(jīng)過精心的再設(shè)計(jì),才能轉(zhuǎn)變成集知識(shí)性與趣味性為一體的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容[13-14]。該實(shí)驗(yàn)是科研成果轉(zhuǎn)化為實(shí)驗(yàn)教學(xué)的一個(gè)案例,只需要離心機(jī)、PCR儀和電泳設(shè)備即可開展實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前培育出外表相同而基因型不同的果蠅品系,是整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)比較巧妙和用心之處。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)過多年的探索研究和實(shí)踐,取得了不錯(cuò)的教學(xué)效果。

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Example of molecular genetic experimental design in teaching of Animal Genetics Experiment

Li Rongni, Wang Qin, Li Xinhai, Deng Xuemei, Wu Changxin

(College of Animal Science and Technology,China Agricultural University,Beijing 100193,China)

Based on the specific mutation lines of fruit flies preserved in the laboratory,a series of experiments from genomic extraction to genotyping are designed. Aiming at the two genes of fruit flies with the body color mutation,the methods of gene amplification,enzyme digestion and gel detection are used to determine the two genotypes of the body color mutation,and the genotype is used to push back the parent combination of the tested fruit flies. This experiment is helpful for the students to receive the basic training of the molecular genetic experimental technology,understand the interaction between alleles and gene interaction at the molecular level as well and deepen their understanding of differences between phenotypic selection and genotypic selection.

animal genetics experiment; DNA extraction; PCR-RFLP; determination of genotype； parent analysis

10.16791/j.cnki.sjg.2017.07.054

2017-01-09

2017-03-02

“動(dòng)物遺傳學(xué)”國家精品資源共享課項(xiàng)目

李榮妮(1988—),女,河南沈丘,碩士,科研教學(xué)助理,主要從事以果蠅和小型魚為模式動(dòng)物的遺傳育種和教學(xué)研究

E-mail：172077851@qq.com

鄧學(xué)梅(1971—),女,吉林四平,博士,教授,主要從事畜禽功能基因組研究和育種工作.

E-mail：deng@cau.edu.cn

G642.423

A

1002-4956(2017)07-0207-04