譚韡++于紅剛++羅和生++周巍

[摘要] 目的 探討慢病毒載體靶向攜帶Akt1基因短發(fā)夾RNA（Akt1-shRNA）對胃癌細胞SGC-7901凋亡和增殖的影響。 方法 構建表達Akt1-shRNA的慢病毒載體，轉染293T細胞后獲得Akt1-shRNA的慢病毒顆粒，病毒感染胃癌SGC-7901細胞（SGC-LV-shAkt1）為實驗組細胞，SGC7901細胞和轉染慢病毒空載體SGC7901細胞（SGC-LV-shCON）為對照組細胞。Real-Time PCR檢測Akt1 mRNA表達水平，Western blot檢測胃癌細胞Akt1、phospho-Akt（ser473）和bcl-2蛋白表達水平，然后流式雙染法、生長速率等方法檢測Akt1 shRNA對SGC-7901細胞凋亡及增殖能力的影響。 結果 成功構建Akt1基因RNAi的慢病毒載體LV-shAkt1，病毒滴度為5×108 TU/mL。SGC-7901細胞轉染后，實驗組（SGC-LV-shAkt1）Akt1 mRNA 和Akt1、p-Akt、bcl-2蛋白表達水平較對照組（SGC-7901、SGC-LV-shCON）降低（P < 0.01）；（38.7±3.5）%的實驗組細胞凋亡（P < 0.05）。SGC-LV-shAkt1細胞生長曲線平緩，生長速度較另兩種細胞（SGC-7901、SGC- LV-shCON）明顯降低。 結論 靶向Akt1的RNAi 能有效抑制胃癌細胞SGC-7901的生長，誘導胃癌細胞凋亡，其機制可能與抑制PI3K/Akt信號通路，下調抗凋亡蛋白bcl-2有關。

[關鍵詞] Akt1；慢病毒載體；胃癌；凋亡

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（b）-0023-05

Department of Gastroenterology， Renmin Hospital of Wuhan University Hubei Key Laboratory of Digestive System Disease， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To investigate the apoptosis and proliferation effect of lentiviral vectors shRNA for Akt1 to human gastric carcinoma SGC-7901 cells. Methods The lentiviral vectors Akt1-shRNA were constructed， lentivirus Akt1-shRNA was transfected into human gastric carcinoma SGC-7901 cells， the SGC-7901 cell strained with Akt1 gene silencing perpetually （SGC-LV-shCON） was as conrol group cell and amplified （SGC LV-shAkt1） was as experiment group cell. Effect of Akt1 on SGC-7901 cells were measured by RT-PCR， Western-blot， flow cytometry of annexin V-FITC/PI， tumor growth curve. Results Akt1 RNAi lentiviral vectors LV-shAkt1 was established successfully， virus titer was 5×108 TU/mL. After SGC-7901 cell transfection， the expression of Akt1 mRNA in experiment group （SGC- LV-shAkt1） was weaker than that in the control group （SGC-7901， SGC- LV-shCON）， and Akt1， p-Akt and bcl-2 protein expressions in experiment group was inhabited （P < 0.01）， （38.7±3.5）% cell in experiment group happened apotosis （P < 0.05）. The cell growth curve of SGC-LV-shAkt1 cell was gentle， compared with SGC-7901 cell or SGC- LV-shCON cell， the growth was lower. Conclusion The lentiviral vectors mediated shRNA for Akt1 can significantly inhibit the expression of Akt1 gene in vitro and markedly inhibit SGC-7901 cell growth and induce the apoptosis of gastric carcinoma cell.The mechanism may be down-regulation of PI3K/Akt signal pathway and anti-apoptosis protein bcl-2 expression.

[Key words] Akt1； Lentiviral vector； Gastric carcinoma； Apotosis

Akt，又稱蛋白激酶B （protein kinase B，PKB） ，是1種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。目前發(fā)現至少存在3種Akt家族成員：Aktl/PKBα、Akt2/PKBβ、Akt3/PKBγ[1]。許多文獻報道，Akt與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切[2-3]。慢病毒載體靶向介導的RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種高效的基因沉默技術，能特異性阻斷哺乳動物細胞中靶基因的表達[4]。本研究通過構建Akt1靶向短發(fā)夾RNA（shRNA）真核表達載體，阻斷胃癌細胞Akt1的表達，觀察轉染后胃癌細胞增殖和凋亡的變化，為其在臨床上的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人胃癌細胞SGC-7901購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。轉染試劑Lipofectamine 2000，Trizol試劑和兔抗人Akt1、phospho-Akt（ser473）購自Invitrogen公司。鼠抗人bcl-2抗體購自Sigma公司、actin抗體和ECL發(fā)光劑購自美國Santa Cruz公司。RT-PCR試劑盒來自TOYOBO公司，引物由上海Invitrogen公司設計合成。Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒及磷酸化蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

慢病毒載體系統(tǒng)：慢病毒載體系統(tǒng)由pGCL-GFP 載體、pHelper1.0（gag/pol 元件）載體、Helper2.0（VSVG 元件）載體3種質粒組成，其中pGCSIL-GFP 載體含有能持續(xù)表達shRNA 的元件，同時能表達綠色熒光蛋白GFP；pHelper1.0 和pHelper2.0含有病毒包裝所必須的元件（上海吉凱基因化學技術公司）。

1.2 方法

1.2.1 人胃癌細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，常規(guī)培養(yǎng)，細胞為單層貼壁生長，待貼壁細胞融合達70%～80%時以胰酶消化傳代。

1.2.2 慢病毒靶向Akt1 shRNA表達載體構建 根據短發(fā)夾RNA設計原則和Genebank中報道的Akt1核苷酸序列（N0.NM005163），設計合成3對針對Akt1基因siRNA的寡核苷酸序列，經分別構建質粒，轉染293T細胞（慢病毒的包裝細胞），據其對Akt1的抑制率，確定有效的靶序列：5'-GGCCAAGTCCTTGCTTTCA-3'。據此設計出針對靶序列的兩條互補DNA序列，具體序列如下：5'-CCGGGAGGCCAAGTCCTTGCTTTC？鄄ATTCAAGAGATGAAAGCAAGGACTTGGCCTCTTTTT？鄄G-3'；5'-AATTCAAAAAGAGGCCAAGTCCTTGCTTT？鄄CATCTCTTGAATGAAAGCAAGGACTTGGCCTC-3'，上述每條鏈序列即為21 nt有效靶序列，插入pGCSIL-GFP再同步合成另一長21 nt與人類基因組無關堿基序列，并插入相同載體作為陰性對照。將其轉化DH5α大腸埃希菌，挑取重組陽性克隆進行PCR 及測序鑒定。PCR鑒定陽性克隆的上游引物序列為：5'-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3'，下游引物：5'-GTA？鄄ATACGGTTATCCACGCG-3'。合成成功的以上重組載體與pHelper1.0載體、pHelper2.0載體包裝質粒共轉染293T細胞，收集轉染后48 h的293T細胞培養(yǎng)上清液體，經濃縮獲得有活性的慢病毒顆粒載體（Akt1-RNAi-LV、NC-LV），過濾濃縮、測定病毒滴度，測得病毒滴度為5×108 TU/mL，并獲得SGC-7901的MOI值（SGC-7901 MOI值是10）后-80℃保存。

1.2.3 載體病毒感染人胃癌細胞 收集SGC-7901細胞，制備成單細胞懸液，計數，接種至24孔板中。根據病毒滴度和SGC-7901的MOI值取對照慢病毒（NC-LV）和干擾慢病毒（Akt1-RNAi-LV）載體，感染靶細胞。感染12 h后，去除含病毒載體的培養(yǎng)液，洗滌后，加入新鮮含血清RPMI 1640繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察細胞綠色熒光產生，獲得成功轉染Akt1-RNAi-LV和NC-LV的胃癌細胞，分別命名為SGC-LV-shAkt1（S-LV-A）和SGC-LV-shCON（S-LV-C）細胞，供進一步實驗。

1.2.4 Real-Time PCR 檢測轉染前后Akt1 mRNA的表達：用0.25%胰蛋白酶消化并收集培養(yǎng)S-LV-A、S-LV-C和SGC-7901細胞，制成細胞懸液并計算細胞數，每個樣本收集等量細胞（3.0×106），用Trizol法提取上述3種細胞的總RNA。然后用RT-PCR 試劑盒鑒定轉染Akt1 的細胞克隆是否低表達。Akt1上游引物5'-GAGCGGGAGGAGTGGACAA-3'；下游引物5'-GGGACAGGTGGAAGAACAGC-3'，actin上游引物5'-CGAGCGGGAAATCGTG-CGT-GACATTAAGGAGA-3'，下游引物5'-CGTCATCTCCTGCTTGCTGATCCACA？鄄TCTG-3'。actin作為內參照。PCR反應條件為：94℃4 min變性，循環(huán)條件為94℃ 30 s，57.7℃（Akt1）40 s（β-actin 62.3℃），72 ℃ 40 s ，30次循環(huán)，72℃延伸5 min。7500 Real-Time PCR System儀器反應，反應結束后，由7500 Real-Time PCR軟件自動記錄熒光曲線并分析計算出Ct值。建立actin作為內對照，檢測被測樣品RNA的完整性和可靠性。結果的計算：ΔΔCt=（樣品Ct均值-內參照Ct均值）-（對照樣品Ct均值-對照內參照Ct均值），然后取2-ΔΔCt即代表被檢樣品初始Akt1 mRNA的含量。

1.2.5 Western blot印跡檢測Akt1、p-Akt和bcl-2蛋白表達 用0.25%胰蛋白酶消化S-LV-A、S-LV-C和SGC-7901細胞，制成細胞懸液并計算細胞數，每個樣本收集等量細胞（5.0×106），加入細胞裂解液，提取蛋白質，以10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白電泳轉移到硝酸纖維素膜（NC）上，硝酸纖維膜加入10 %脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗工作液（兔抗人Akt1、p-Akt、bcl-2、β-actin單克隆抗體，工作濃度為1∶1000；兔抗人bcl-2單克隆抗體，工作濃度為1∶400），4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶3000稀釋）孵育1 h，應用增強的化學發(fā)光法顯影，暗室曝光于X線膠片上，定影顯影，以actin作為內參照。

1.2.6 流式雙染法檢測上述三種細胞凋亡情況 按試劑盒說明書進行操作，分別取S-LV-A、S-LV-C和SGC-7901細胞，0.25%胰酶消化，收集1×107個細胞，冷PBS緩沖液洗2次，重懸于1×結合緩沖液，調整細胞密度為1×107/mL。取100 μL細胞懸液至流式專用試管中，再加400 μL 1×結合緩沖液，再依次加入5 μL AnnexinV-F ITC標記液和10 μL PI標記液，混勻，室溫避光孵育15 min后，上流式細胞儀檢測，用MULTICYLE 110 DNA專用分析軟件分析獲得數據。

1.2.7 生長速率檢測 上述3種細胞經0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液后，接種于6孔板，每種細胞接種7孔，每孔1×104個細胞，每日取1孔細胞進行計數，繪制細胞生長曲線。

1.2.8 細胞克隆實驗檢測細胞的增殖能力 上述3種細胞經0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液后，調整細胞密度為5×103/mL，接種至6孔板，10 d后，棄去培養(yǎng)液，固定、染色拍照，倒置顯微鏡下計數，大于50個細胞集落為1個克隆，根據公式計算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆數/5000×100%

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0對數據進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒靶向攜帶Akt1 shRNA在SGC-7901細胞轉染效率的測定

熒光顯微鏡下觀察SGC-7901細胞轉染慢病毒載體情況：轉染后先在白光下觀察細胞形態(tài)，了解細胞數目。再在同一視野下選用藍光觀察轉染細胞內綠色熒光蛋白的情況以評估轉染效率。成功轉染慢病毒靶向攜帶Akt1 shRNA的SGC-7901細胞可表達綠色熒光蛋白，在病毒（MOI=10）轉染48 h后，慢病毒靶向攜帶Akt1 shRNA的轉染效率可達到90%以上。見圖1。

2.2 Real-Time PCR 檢測Akt1 mRNA 表達水平

實驗組（S-LV-A細胞）和對照組（S-LV-C和SGC-7901細胞）三種細胞中Akt1 mRNA的相對表達定量分別是（20.33±3.2）%、（45.97±3.7）%、（49.77±4.1）%，實驗組與對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。對照組內差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖2。

2.3 Akt1基因沉默后對SGC-7901生長和凋亡的影響

2.3.1 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡 實驗組的凋亡率達到（38.7±3.5）%，而對照組的兩種細胞凋亡率低（1.3±0.8）%、（2.1±0.6）%，實驗組與對照組比較，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。見圖3。

2.3.2 Akt1基因沉默后對SGC-7901細胞生長速率的影響 三組細胞的生長曲線詳見圖4。實驗組細胞生長曲線較為平緩，生長速度較對照組兩種細胞降低。三組細胞接種6孔板10 d后，計算克隆形成率。結果表明：實驗組比對照組兩種細胞的克隆形成能力明顯降低，根據公式計算克隆形成率分別為5.5%、27.1%和26.4%，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖 5。

2.4 Western blot印跡檢測Akt1、p-Akt和bcl-2蛋白表達水平

三組細胞（SGC-7901、S-LV-C和S-LV-A細胞）Akt1、phospho-Akt（p-Akt）和bcl-2蛋白表達水平在對照組（SGC-7901和S-LV-C細胞）中差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），而在實驗組（S-LV-A細胞）中表達水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖6。

3 討論

胃癌是常見的惡性腫瘤，位于全球癌癥相關死亡原因的第2位[5]，胃癌的發(fā)生發(fā)展與細胞內信號通路的異?；罨嘘P。在許多細胞內信號通路中PI3K/Akt信號傳導通路的激活已被認為是腫瘤細胞抗凋亡的主要機制之一[6]。PI3K主要是通過其3位羥基磷酸化產物PIP3轉移蛋白激酶B（Akt）到細胞膜上，并改變Akt的構象使之能被3′-磷脂酰肌醇依賴蛋白激酶1/2（PDK1/2）所磷酸化（p-Akt）和激活，從而傳遞抗凋亡和增殖信號[7]。因此，可以通過抑制Akt基因表達達到抑制腫瘤生長的目的[8]。

Akt，又稱蛋白激酶B[9]，該激酶蛋白由3個高度保守區(qū)組成：末端pleckstrin同源區(qū)（PH），中央激酶催化區(qū)（CAT）和包含一個疏水調節(jié)結構的C末端擴展區(qū)（EXT）。Akt主要有三種亞型：Akt1，Akt2，Akt3。在這三種亞型之間，PH區(qū)序列有約80%一致性，CAT區(qū)序列有約90%一致性，EXT區(qū)約為70%，而PH區(qū)和CAT區(qū)之間的連接區(qū)（LINK）則呈低保守性，三種亞型之間僅僅有17%～46%一致性[9]。由于缺乏特異性的阻斷劑，我們還無法了解Akt1、2、3三個亞型中的每個亞型準確作用。

RNA干擾（RNAi）是一種新的基因阻斷方法[10]，其作用機制是將與mRNA序列同源互補一些短片斷的雙鏈RNA（shRNA、siRNA）導入細胞，從而使特定的mRNA發(fā)生降解，導致其基因沉默。RNAi抑制基因表達具有高效﹑特異和級聯式放大效應，因而它更適合惡性腫瘤的研究和基因治療。

慢病毒載體是一種新近開發(fā)的、極具應用前景的基因轉移系統(tǒng)。利用慢病毒構建的shRNA載體，可以更高效地轉染傳統(tǒng)試劑難于轉染的細胞系如原代細胞、懸浮細胞和處于非分裂狀態(tài)的細胞，并且在轉染后整合到受轉染細胞基因組，從而長時間穩(wěn)定地抑制特定基因的表達[11]。

本研究通過成功構建靶向人Akt1基因的shRNA 及其慢病毒表達載體，確定最適合的SGC-7901慢病毒MOI值并轉染SGC-7901細胞。其最大特點是可穩(wěn)定整合于靶細胞的基因組，治療基因表達時間長[10]。本研究表明，轉染后S-LV-A細胞的Akt1 mRNA和蛋白的表達量較轉染S-LV-C細胞和未轉染細胞明顯減少，而S-LV-C和SGC-7901細胞Akt1 mRNA和蛋白的表達量比較無明顯變化，說明表達載體具有特異性沉默Akt1基因的作用。該載體轉染SGC-7901細胞后，細胞生長顯著受到抑制，并出現明顯的凋亡改變[凋亡率為（38.7±3.5）%]，說明阻斷Akt基因的亞型Akt1有促凋亡作用，進一步證實了shRNA對靶基因的抑制作用。同時本研究發(fā)現慢病毒靶向攜帶shRNA轉染SGC-7901細胞后，活性形式的Akt即磷酸化Akt（phospho-Akt）蛋白和bcl-2蛋白表達明顯減少，提示SGC-7901細胞存在PI3K/Akt信號途徑的異常活化，抑制該通路可以誘導細胞出現明顯凋亡。其機制與沉默Akt1基因后，PI3K依賴性的磷酸化Akt（p-Akt）表達下調，抑制其下游bcl-2家族成員bcl-2表達，誘導線粒體調亡通路激活有關[12-15]。

本實驗利用RNAi技術，有效敲低胃癌細胞Akt1的表達，發(fā)現其可抑制胃癌細胞生長，誘導細胞發(fā)生凋亡，其機制與抑制PI3K/Akt通路活化，激活線粒體凋亡通路有關。Akt1基因是比較理想的腫瘤生物治療的靶點，為胃癌的基因治療提供了新的思路。

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（收稿日期：2017-03-10 本文編輯：蘇 暢）