阮 鵬，陳究成，徐寧迎，章曉偉，劉雅莉

(1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.浙江省畜牧技術(shù)推廣總站)

試驗(yàn)研究

基于簡化基因組測序嘉興黑豬的遺傳多樣性分析

阮 鵬1，陳究成1，徐寧迎1，章曉偉2，劉雅莉2

(1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.浙江省畜牧技術(shù)推廣總站)

試驗(yàn)評估采集嘉興黑豬血樣89例，其中公豬21例，母豬68例，利用GGRS簡化基因組文庫技術(shù)，共檢測出SNP位點(diǎn)108603個(gè)，經(jīng)過濾篩選后共獲位點(diǎn)48408個(gè)，具有多態(tài)性的位點(diǎn)占比為0.99，通過計(jì)算得到AR為1.9，HE為0.324，群體內(nèi)的平均遺傳距離為0.136±0.01。

基因組測序；遺傳多樣性；嘉興黑豬

嘉興黑豬是我國著名的地方優(yōu)良豬種，系太湖豬品種的一個(gè)主要類群[1-2]。根據(jù)浙江省畜牧技術(shù)推廣總站2015年對地方品種保種效果進(jìn)行監(jiān)測的要求，筆者利用GGRS簡化基因組文庫技術(shù)對嘉興黑豬的群體遺傳現(xiàn)狀進(jìn)行了評估，采集嘉興黑豬血樣89例，其中公豬21例，母豬68例，采用第二代測序技術(shù)并經(jīng)過篩選后，共選出SNP位點(diǎn)48408個(gè)，具有多態(tài)性位點(diǎn)占比為0.99。通過計(jì)算得到AR為1.9，HE為0.324，群體內(nèi)的平均遺傳距離為0.136±0.01。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)采集嘉興黑豬血樣89例(三代以內(nèi)沒有血緣關(guān)系)作為供試材料，其中公豬21例，母豬68例，裝入盛有乙醇的1.5 mL離心管中，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用杭州某生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA。DNA濃度測定儀測定濃度大于50 ng/μL，OD值在1.8～2.0之間，電泳條帶完整為合格DNA，存于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組文庫建立 選擇限制性內(nèi)切酶AvaII進(jìn)行酶切，設(shè)計(jì)barcoding-adapter，PCR擴(kuò)增后選擇片段范圍為300～400 bp進(jìn)行割膠回收。回收的PCR產(chǎn)物由上海晶能公司進(jìn)行高通量測序，測序平臺(tái)為Hisq2000[3-4]。

1.2.3 SNP篩選 應(yīng)用BWA和SamTools軟件對高通量結(jié)果進(jìn)行匹配和SNP篩選，參考基因組SSC10.2從GenBank上下載。利用iBLUP軟件對基因型進(jìn)行填補(bǔ)，再用R3.3.3軟件對SNP進(jìn)行過濾，過濾條件為：Call rate>0.30, MAF>0.05, HWE>10-6[5-6]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用R3.3.3軟件對篩選獲得的SNP位點(diǎn)計(jì)算嘉興黑豬群體的多態(tài)性比例(PN)，期望雜合度(HE)，基因豐度(AR)。應(yīng)用Mega 6.01 計(jì)算個(gè)體之間的遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA以及酶切產(chǎn)物 基因組DNA電泳結(jié)果顯示，基因組DNA條帶清晰可見，且無拖尾，說明基因組DNA提取質(zhì)量良好，無降解、無RNA污染。對300～400片段處進(jìn)行割膠回收。

2.2 SNP篩選結(jié)果 經(jīng)過SNP過濾篩選，共選出SNP位點(diǎn)48408個(gè)，SNP位點(diǎn)在染色體上的分布詳見圖1，其中2號(hào)染色體上SNP位點(diǎn)最多，存在SNP位點(diǎn)5057個(gè)，16號(hào)和18號(hào)染色體上找到的SNP位點(diǎn)最少，分別為1334個(gè)和1365個(gè)。篩選獲得的SNP位點(diǎn)在各個(gè)染色體上分布均勻，可以滿足分析。

圖1 SNP位點(diǎn)在染色體上分布

2.3 群體多樣性分析 在初始得到的108603個(gè)SNP位點(diǎn)中，滿足最小等位基因頻率(MAF)>0.05的位點(diǎn)50951個(gè)，占46.9%。具有多態(tài)性的位點(diǎn)50944個(gè)，占99%，經(jīng)HWE>10-6的標(biāo)準(zhǔn)篩除2536個(gè)SNP，最終得到48408個(gè)SNP。通過計(jì)算得到AR為1.99，HE為0.324(表1)。

表1 嘉興黑豬群體多樣性參數(shù)

2.4 遺傳距離分析 遺傳距離由IBS計(jì)算所得。公式如下：

Dst=1-A

其中，IBS1和IBS2指同一座位下具有相同基因型的等位基因數(shù)。計(jì)算得到嘉興黑豬群體內(nèi)的平均遺傳距離為0.136±0.01。

3 小結(jié)與討論

3.1 GGRS簡化基因組檢測核苷酸變異 本試驗(yàn)利用GGRS簡化基因組文庫技術(shù)，共檢測出SNP位點(diǎn)108603個(gè)，經(jīng)最小等位基因頻率(MAF<0.05)過濾57652個(gè)SNP位點(diǎn)，對剩余的50951個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)，認(rèn)為P-value<10-6位點(diǎn)沒有處于平衡狀態(tài)予以過濾，過濾后總共得到位點(diǎn)48408個(gè)，其中2號(hào)染色體上個(gè)數(shù)最多為5057個(gè)，16號(hào)染色體上個(gè)數(shù)最少為1334個(gè)，在染色體上總體分布均勻，平均SNP密度為0.49個(gè)/10 kb?？紤]到中國地方豬種的連鎖不平衡區(qū)間大概為10 kb，因此本次SNP檢出密度可完全滿足地方豬種的標(biāo)記要求，為揭示這些地方豬種種質(zhì)特性的分子遺傳基礎(chǔ)提供了基礎(chǔ)。

3.2 嘉興黑豬遺傳多樣性分析 試驗(yàn)結(jié)果表明，嘉興黑豬的遺傳多樣性水平中PN較其他中國地方豬種高，但HE稍低。中國地方豬種的平均距離為0.166，嘉興黑豬的平均遺傳距離則為0.136±0.01，距離平均水平有一定距離，可能與其保種等具體措施有關(guān)。

[1]中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所.中國豬品種志[M].上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986.

[2]國家畜禽遺傳資源委員會(huì)組.中國畜禽遺傳資源志[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，2011.

[3]Yang S L,Wang Z G, Liu B,et al. Genetic variation and relationships of eighteen Chinese indigenous pig breeds[J]. Genetics Selection Evolution,2003,35(6):657-671.

[4]Ai H S, Huang L S,Ren J. Genetic diversity, linkage disequilibrium and selection signatures in Chinese and western pigs revealed by genome-wide SNP markers[J]. Plos One,2013,8(2):11.

[5]Heaton M P, Harhay G P,Bennett G L,et al. Selection and use of SNP markers for animal identification and paternity analysis in US beef cattle [J].Mammalian Genome,2002,13(5):272-281.

[6]Gibbs R A,Taylor J F, Van Tassell C P, et al. Genome-wide survey of SNP variation uncovers the genetic structure of cattle breeds[J]. Science, 2009,324(5926):528-532.

農(nóng)業(yè)部等聯(lián)合發(fā)布《共同推進(jìn)“一帶一路”建設(shè)農(nóng)業(yè)合作的愿景與行動(dòng)》

最近，農(nóng)業(yè)部、發(fā)改委、商務(wù)部、外交部等四部委聯(lián)合發(fā)布《共同推進(jìn)“一帶一路”建設(shè)農(nóng)業(yè)合作的愿景與行動(dòng)》。文件指出，在“一帶一路”倡議下，農(nóng)業(yè)國際合作成為沿線國家和地區(qū)共建利益共同體和命運(yùn)共同體的最佳結(jié)合點(diǎn)之一。

《愿景與行動(dòng)》指出，農(nóng)業(yè)發(fā)展是“一帶一路”沿線國家和地區(qū)國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要基礎(chǔ)，沿線大部分國家和地區(qū)對解決饑餓和貧困問題、保障糧食安全與營養(yǎng)的愿望強(qiáng)烈，開展農(nóng)業(yè)合作是沿線國家和地區(qū)的共同訴求。

《愿景與行動(dòng)》提出，未來中外著重在以下方面加強(qiáng)合作，包括構(gòu)建農(nóng)業(yè)政策對話平臺(tái)、強(qiáng)化農(nóng)業(yè)科技交流合作、優(yōu)化農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易合作、拓展農(nóng)業(yè)投資合作、加強(qiáng)能力建設(shè)與民間交流。

《浙牧》訊

2017-05-17

國家科技支撐計(jì)劃(No. 2015BAD03B01)

S828.2

A

1005-7307(2017)04-0001-002