李昌正楊桂智顏思珊李銳蘭天，

鞘氨醇激酶（SphK1）基因敲除小鼠的飼養(yǎng)繁育及基因鑒定

李昌正1楊桂智1顏思珊2李銳2蘭天1，2

目的 通過對鞘氨醇激酶（SphK1）基因敲除小鼠的繁殖和鑒定，以提供SphK1缺失對各種疾病的影響的相關(guān)理想動物模型。方法將從美國國立健康研究院（National Institute of Health，NIH）處引進的SphK1敲除雜合子小鼠進行交配，獲得子代小鼠后，提取小鼠尾部的DNA，用瓊脂糖電泳等方法檢測及驗證子代小鼠基因型。結(jié)果 獲得純合子子代小鼠。結(jié)論 SphK1基因敲除小鼠的鑒定獲得成功。

SphK1；基因敲除小鼠；動物模型

鞘氨醇激酶（Sphingosine kinase，SphK）作為催化1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine 1-phosphate，S1P）[1-3]生成的關(guān)鍵限速酶，具有SphK1和SphK2兩個亞型，雖然二者結(jié)構(gòu)域上高度保守，但他們在亞細胞定位、酶催化特性和組織表達譜上均有顯著不同；其中SphK1可以促進細胞增殖和抑制凋亡[4-5]。近來研究表明：SphK信號通路與多種人類疾病[6-9]密切相關(guān)。由于基因工程小鼠具備在動物整體水平上模擬特定基因在體內(nèi)的功能等一系列優(yōu)點，因此本實驗室在前期各項科學研究的基礎(chǔ)上，引進了SphK1基因敲除雜合子小鼠，同時成功對SphK1小鼠進行了繁殖和鑒定，進一步研究SphK1在各類疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SphK1基因敲除小鼠從美國國立健康研究院（National Institute of Health，NIH）引進，其品系背景為C57BL/6J，雌性小鼠與雄性小鼠各2只，基因型為SphK1雜合子（ SphK1+/-）。

1.2 主要試劑

基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；2×Taq PCR Master Mix購自Thermo；DL1000 bp DNA marker購自takara；瓊脂糖粉購自生工生物工程（上海）股份有限公司；蘇木素，伊紅購自北京鼎國生物科技有限公司。

1.3 基因敲除小鼠的飼養(yǎng)和繁殖

將小鼠在SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度穩(wěn)定在22～26℃，濕度50%～65%。飼養(yǎng)過程中，需每日觀察小鼠的生長發(fā)育及是否受孕狀況，并將小鼠分娩時間具體記錄。小鼠的繁殖具體操作為：將6～8周齡的小鼠以雌性小鼠2只和雄性小鼠1只的比例同籠合養(yǎng)，并定期給予滅菌葵花籽補充營養(yǎng)。雌性小鼠的妊娠期為19～21 d，哺乳期為18～21 d，哺乳期滿的子代鼠要和母鼠分開，雌性小鼠與雄性小鼠分籠飼養(yǎng)。

1.4 瓊脂糖電泳及基因型鑒定

圖1 子代SphK1小鼠PCR鑒定結(jié)果

從4℃冰箱中取出PCR產(chǎn)物，取5 μl在3% 瓊脂糖凝膠上進行電泳分析，產(chǎn)物大小為350 bp為純合子小鼠；大小在300 bp為野生型小鼠；2條電泳條帶均存在的為雜合子小鼠。PCR反應(yīng)引物由上海生工公司合成。引物1∶ TGTCACCCATGAACCTGCTGT CCCTGCACA 位于替換的基因片段，用于檢測突變型；引物2∶AGAAGGCACTGGCTCCTCCAG AGGAACAAG位于SphK1基因敲除區(qū)域，用于檢測野生型；引物3∶ TCGTGCTTTACGGTATCGCCG CTCCCGATT 則作為通用引物。PCR反應(yīng)程序為∶ 預(yù)變性94℃，7 min；變性94℃，1 min；退火65℃，1 min；延伸72℃，1 min；反應(yīng)35個循環(huán)，4℃保存。

1.5 Western Blot驗證SphK1基因敲除效果

把組織剪切成細小的碎片，按照每20 mg組織加入400 μl裂解液的比例加入裂解混合液（RIPA 和蛋白酶抑制劑PMSF），液氮研磨。吸取研磨液置于1.5 ml的EP管中，離心（4℃，12 000 rpm /min，20 min） 吸取上清。BCA法定量后的蛋白樣品經(jīng)十二烷基磺酸鈉（SDS） ——聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。PVDF膜用5% 脫脂奶粉搖床封閉1 h，1×TBST洗膜3次/10 min，SphK1抗體4 ℃孵育過夜，次日用1×TBST洗膜3次/10 min，辣根過氧化物標記抗兔來源的二抗室溫孵育1～2 h，1×TBST洗膜3次/10 min，化學發(fā)光顯色，以凝膠成像系統(tǒng)拍片。

2 結(jié)果

2.1 部分小鼠基因型鑒定結(jié)果

3%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，SphK1雜合子的PCR擴增產(chǎn)物的大小為300 bp與350 bp， SphK1-/-的PCR擴增產(chǎn)物的大小為300 bp（如圖1）。

2.2 SphK1-/-純合子與WT小鼠中SphK1蛋白表達量的比較

Western Blot實驗結(jié)果顯示（如圖2），SphK1小鼠與WT小鼠相比，SphK1蛋白的表達量明顯下調(diào)且趨近于不表達。

圖2 SphK1-/-純合子與WT小鼠中SphK1蛋白的表達

3 討論

基因敲除是通過特定的途徑使特定的基因失活或缺失的一種新型分子生物學技術(shù)。該技術(shù)采用基因結(jié)構(gòu)或功能缺失的小鼠來研究相應(yīng)基因及相關(guān)疾病，能降低甚至排除其他內(nèi)源性基因的干擾，實驗結(jié)果可信度高。

為能更好的研究SphK1在各種疾病發(fā)生發(fā)展中的作用及其相關(guān)分子機制，我們在SphK1基因敲除小鼠成功引進后，成功進行了SphK1小鼠的一系列繁殖與鑒定，由于雜合子小鼠與純合子小鼠相比，其表型較不明顯，不利于后續(xù)的研究，因此本研究希望通過繁殖獲得大量SphK1敲除小鼠，以獲得盡可能多的純合子小鼠。同時，由于引進SphK1敲除小鼠為雜合子，根據(jù)孟德爾遺傳定律，其子代可能出現(xiàn)3種基因型，即純合子（ SphK1-/-） 、雜合子（ SphK1+/-）、野生型（ SphK1+/+） ，其比例接近1：2：1，故必須對它們進行基因型鑒定；其中，繁殖子代的純合子可以用作實驗組，野生型可以用作對照組，為后續(xù)的研究提供了理想可靠的動物模型。

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Reproduction and Genotype Identification of Sphingosine Kinase 1 (SphK1) Knockout Mice

LI Changzheng1YANG Guizhi1YAN Sishan2LI Rui2LAN Tian1,21 School of Basic Courses, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou Guangdong 510006, China; 2 College of Pharmacy

Objective To provide an ideal animal model for the effect of SphK1 deletion on various diseases by the propagation and identification of sphingosine kinase (SphK1) knockout mice. Methods Heterozygote mice from NIH were bred and reproduced. Genome DNA was extracted from the murine tail and identified by agarose gel electrophoresis. Results SphK1 genotypes of the offspring mice included homozygous( SphK1-/-). Conclusion SphK1 knockout mice are successful reproduced.

SphK1; gene knockout mouse; animal model

Q343．1

A

1674-9316（2017）14-0131-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．14．073

廣東省自然科學基金重點項目（2016A030311014）

1廣東藥科大學基礎(chǔ)學院，廣東 廣州 510006；2藥學院通信作者：蘭天