王亞楠,王曉斐,牛琳琳,雷 壯,張海棠,王自良,*

(1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.動(dòng)物病毒病防控與藥殘分析河南省高校重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,河南新鄉(xiāng) 453003;3.河南科技學(xué)院新科學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

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食品中黃曲霉毒素總量免疫分析方法研究進(jìn)展

王亞楠1,2,王曉斐3,牛琳琳1,2,雷 壯1,2,張海棠1,2,王自良1,2,*

(1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.動(dòng)物病毒病防控與藥殘分析河南省高校重點(diǎn)學(xué)科開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,河南新鄉(xiāng) 453003;3.河南科技學(xué)院新科學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

黃曲霉毒素(aflatoxins,AFs)污染食品的廣泛性、嚴(yán)重性和危害性倍受食品行業(yè)的關(guān)注,單一黃曲霉毒素檢測(cè)已不能滿足行業(yè)的需求。針對(duì)食品黃曲霉毒素總量檢測(cè)目前普遍采用理化分析方法,相比之下由于免疫分析技術(shù)具有高特異性、高靈敏性、簡(jiǎn)便性等技術(shù)優(yōu)勢(shì),已成為今后的發(fā)展方向和重要的研究課題。本文就食品黃曲霉毒素總量免疫分析技術(shù)的研究進(jìn)展作簡(jiǎn)要綜述,旨在為食品AFs總量免疫分析提供新的方法和思路。

食品，黃曲霉毒素總量，免疫分析，研究進(jìn)展

黃曲霉毒素(aflatoxins,AFs)是由黃曲霉(Aspergillusflavu)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)經(jīng)過(guò)聚酮途徑所產(chǎn)生的含有二呋喃環(huán)和氧雜萘鄰?fù)Y(jié)構(gòu)相似的一組有毒次生代謝產(chǎn)物,目前已發(fā)現(xiàn)AFs有20種,自然條件下產(chǎn)生的AFs主要包括B1、B2、G1、G24種[1]。AFs對(duì)人體健康具有致癌性、致突變性、致畸性和致免疫抑制性等毒性作用,尤其是AFB1毒性最強(qiáng),污染廣泛,比例較高(1/2以上),世界上大多數(shù)國(guó)家對(duì)食品中AFB1殘留限量標(biāo)準(zhǔn)都做出了明確的規(guī)定[2]。但隨著人們對(duì)食品安全問(wèn)題的日益關(guān)注,對(duì)AFs毒性研究的不斷深入,檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步,為解決多種毒素污染同時(shí)存在且具有毒性疊加效應(yīng)及在在檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方面的相應(yīng)缺失,制訂AFs總量(B1+B2+G1+G2)限量標(biāo)準(zhǔn)及相應(yīng)檢測(cè)方法已成為發(fā)展趨勢(shì)[3]。針對(duì)這一新的限量要求及在食品國(guó)際貿(mào)易中的作用,世界上許多國(guó)家都展開(kāi)了AFs總量標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)方法的研究,至2013年已有91個(gè)國(guó)家采用了AFs總量限量標(biāo)準(zhǔn),如國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)、美國(guó)食品與藥物監(jiān)督管理局(FDA)等規(guī)定食品中AFs總量限量標(biāo)準(zhǔn)為15 μg/kg,日本規(guī)定食品中AFs總量限量標(biāo)準(zhǔn)為10 μg/kg,歐盟(EC)規(guī)定食品及食品的組分中AFs總量限量標(biāo)準(zhǔn)為4 μg/kg,我國(guó)現(xiàn)行的《GB 2761-2011 食品中真菌毒素限量》標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格規(guī)定了AFB1的限量標(biāo)準(zhǔn),尚未涉及AFs總量限量要求,但在《GB/T 5009.23-2006 食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了AFs總量限量檢測(cè)方法[4]。

食品中AFs總量分析方法主要有理化分析和免疫分析兩種,目前各國(guó)主要采用的理化分析方法有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC/MS)[6]、時(shí)間分辨熒光分析法(Time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA)[7]等。但由于受儀器設(shè)備、技術(shù)人員、樣品處理、操作場(chǎng)地、經(jīng)濟(jì)成本等方面的制約,這些理化分析方法的應(yīng)用受到了限制[8]。免疫分析方法由于具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便、樣品篩檢量大、可現(xiàn)場(chǎng)操作等優(yōu)勢(shì),已成為AFs總量檢測(cè)研究的熱點(diǎn)課題[9],并在AFs總量快速檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。本文就AFs總量免疫分析方法中人工抗原合成及抗體特性、免疫分析方法建立及優(yōu)缺點(diǎn)、存在問(wèn)題與展望等作一綜述,旨在為AFs總量免疫分析方法的發(fā)展提供借鑒。

表1 B族AFs抗原合成及抗體特性Table 1 Antigen synthesis and antibody characterization of B group aflatoxins

1 AFs人工抗原合成及抗體特性

高質(zhì)量的抗體是建立免疫分析方法的核心試劑,就目前的研究進(jìn)展而言,實(shí)現(xiàn)AFs總量免疫分析的途徑有兩條,一是分別制備B族AFs和G族AFs靈敏度高、特異性強(qiáng)的單一抗體,之后混合使用的混合通用抗體;二是制備能夠同時(shí)識(shí)別AFB1、AFB2、AFG1、AFG2靈敏度高、識(shí)別譜廣的單一通用抗體,這是最為理想的技術(shù)方法。由于AFs是小分子化合物,不具有免疫原性,無(wú)法直接誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體,無(wú)論采取哪種途徑都必須通過(guò)AFs分子改造與大分子蛋白質(zhì)載體結(jié)合成為人工抗原,借助T細(xì)胞表位來(lái)間接誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖及分化,制備合格抗體[10]。

1.1 AFs混合通用抗體制備

1.1.1 B族AFs靈敏、特異性抗體制備 B族AFs屬多環(huán)不飽和雙呋喃香豆素內(nèi)酯類化合物,含有一個(gè)與基本毒性有關(guān)的雙呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)和致癌性有關(guān)的氧雜萘鄰?fù)Y(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1),根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)上存在的活性基團(tuán)和活性位點(diǎn),B族AFs抗原合成方法主要有肟化活潑酯法、氨甲基化法、混合酸酐法、半縮醛法、環(huán)氧化物法、烯醇醚衍生物法等。以AFB1和載體蛋白牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)為例,B族AFs抗原合成及抗體特性見(jiàn)表1。

圖1 AFB1和AFB2分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of AFB1 and AFB2

續(xù)表

對(duì)上述B族AF半抗原分子設(shè)計(jì)、抗原合成方法及所產(chǎn)生抗體特性進(jìn)行綜合分析,作者認(rèn)為,肟化活潑酯法效果最優(yōu),選擇AFB1的2位羰基為活性位點(diǎn),通過(guò)肟化引入活性基團(tuán)羧基,以單酰胺鍵為間隔臂合成抗原,該方法操作步驟簡(jiǎn)單,反應(yīng)條件溫和,產(chǎn)物產(chǎn)率較高;同時(shí),所產(chǎn)生抗體具有效價(jià)高(免疫動(dòng)物易產(chǎn)生抗體)、敏感(IC50為0.066 μg/kg)、特異(100%識(shí)別AFB1)、廣譜(同時(shí)100%識(shí)別AFB2)等特性。其次是混合酸酐法和半縮醛法,均是選擇AFB2a的3位羥基為活性位點(diǎn),分別以單酰胺鍵(混合酸酐法)、希夫氏堿(半縮醛法)為間隔臂合成抗原,兩種方法易于操作,抗體特異性較好,但抗體敏感性、廣譜性需要進(jìn)一步提高。其他方法所制備的抗體具有較大缺陷,已很少采用。

1.1.2 G族AFs靈敏、特異性抗體制備 G族AFs與B族AFs結(jié)構(gòu)相似,都含有雙呋喃環(huán)和氧雜萘鄰?fù)?不同的是B族AFs連接戊酮,而G族AFs連接六元內(nèi)酯(見(jiàn)圖2),B族AFs抗原制備可通過(guò)1、2位點(diǎn)進(jìn)行,但G族AFs的1、2位點(diǎn)非常穩(wěn)定,難以實(shí)現(xiàn)與載體蛋白偶聯(lián),G族AFs抗原合成方法主要有半縮醛法、烯醇醚衍生物法和環(huán)氧化物法等。以AFG1和BSA為例,G族AFs抗原合成及抗體特性見(jiàn)表2。

圖2 AFG1和AFG2分子結(jié)構(gòu)式Fig.2 Molecular structure of AFG1 and AFG2

由于對(duì)G族AF半抗原分子設(shè)計(jì)、抗原合成方法及所產(chǎn)生抗體特性研究起步較晚,綜合分析上述三種方法,作者認(rèn)為,半縮醛法效果最優(yōu),將AFG1酸化形成AFG2a,利用AFG2a的3位羥基活性基團(tuán),以希夫氏堿為間隔臂合成抗原,所產(chǎn)生抗體具有效價(jià)高、敏感性好、特異性強(qiáng)和識(shí)別譜廣的特性。環(huán)氧化物法和烯醇醚衍生物法均存在敏感性較差的缺陷,很少應(yīng)用。

表2 G族AFs抗原合成及抗體特性Table 2 Antigen synthesis and antibody characterization of G group aflatoxin

1.2 AFs單一通用抗體制備

根據(jù)目前的研究結(jié)果,均是選擇AFB1為反應(yīng)的起始原料,采用肟化活潑酯法制備AFs單一通用mAb。首先肟化法合成半抗原AFB1O,以甲醇水溶液為溶劑,以吡啶為催化劑,以羧甲基羥胺半鹽酸鹽(CMO)為半抗原肟化劑,在加熱回流條件下,AFB1的羰基與CMO的氨基縮合形成N-O-甲基羧酸(-COOH),使AFB1肟化為AFB1O;其次活潑酯法合成人工抗原,使用雙功能偶聯(lián)劑1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)在水溶液中或使用N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)在有機(jī)溶液中將AFB1O中的-COOH與載體蛋白的-NH2以單酰胺鍵(-CONH-)的形式實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。用人工抗原免疫Balb/C小鼠,通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)篩選雜交瘤細(xì)胞株,體內(nèi)誘生腹水法制備mAb。Chu等[23]于1977年建立該方法,AFB1O的產(chǎn)率為73%～83%,之后Kolosova等[24]和Cervino等[25]對(duì)該方法進(jìn)行了完善,AFB1O的產(chǎn)率提高到90%以上,雖然獲得了抗AFB1高效價(jià)、敏感、特異的抗體,但與AFB2、AFG1、AFG2的CR較低,不能用于建立AFs總量免疫分析方法。Zhang等[26]采用該方法,篩選出1D3、4F12、1C11、10G4和4F3共5株雜交瘤細(xì)胞株,均可用于AFs總量檢測(cè),其中1C11效果最好,1C11所分泌的mAb對(duì)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的IC50分別為1.2、1.3、2.2和18.0 pg/mg,CR分別為100%、92.3%、54.5和6.7%。Li等[27]采用該方法篩選出雜交瘤細(xì)胞株10C9,所分泌的mAb對(duì)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的IC50分別為2.09、2.23、2.19和3.21 μg/kg,CR分別為100%、93.6%、95.4和65.2%。Kim等[28]采用該方法篩選出雜交瘤細(xì)胞株8H10,所分泌的mAb對(duì)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的IC50分別為4.36、7.22、6.61和29.41 μg/kg,CR分別為100%、60.47%、65.97和14.83%。

2 AFs總量免疫分析方法及其性能

目前已建立的AFs總量免疫分析方法有酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbant ssay,ELISA)、膠體金免疫層析法(gold immunochromatographic assay,GICA)、熒光免疫分析法(Fluorescence immunoassay,FIA)和免疫傳感器法(immunosensor,IS)等。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附法

ELISA檢測(cè)小分子半抗原的原理是:將抗原(或抗體)包被于酶標(biāo)板,同時(shí)加入抗體與待測(cè)半抗原(或酶標(biāo)半抗原與待測(cè)半抗原),抗原與待測(cè)半抗原(或酶標(biāo)半抗原與待測(cè)半抗原)共同競(jìng)爭(zhēng)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn),洗板后酶標(biāo)板上僅留下抗原與抗體(或酶標(biāo)半抗原與抗體)反應(yīng)結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物,復(fù)合物的量與待測(cè)半抗原的量呈負(fù)相關(guān),通過(guò)酶底物催化顯色,根據(jù)顏色的深淺有無(wú)對(duì)待測(cè)半抗原進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。分析方法包括間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(indirect competitive ELISA,icELISA)和直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(direct competitive ELISA,dcELISA)兩種技術(shù)模式。ELISA的優(yōu)點(diǎn)是快速方便、操作簡(jiǎn)單、成本較低、篩檢樣品量大。缺點(diǎn)是由于抗體與酶均屬生物活性物質(zhì),需要低溫保存,易受環(huán)境和反應(yīng)條件影響,穩(wěn)定性差;存在非特異性反應(yīng),檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)假陽(yáng)性問(wèn)題;樣品萃取需要脫脂、脫鹽、調(diào)節(jié)pH等,樣品前處理復(fù)雜[29]。Li等[27]用篩選出的10C9細(xì)胞株所分泌的mAb建立了AFs總量icELISA檢測(cè)方法,檢測(cè)范圍為2.1～3.2 μg/kg,添加回收率為87.5%～102.0%。Kim等[28]用篩選出的8H10細(xì)胞株所分泌的mAb建立了AFs總量dcELISA檢測(cè)方法,檢測(cè)范圍為0.2～25 μg/kg,添加回收率為79.18%～91.27%。計(jì)融等[30]用自制的AFs mAb研制出食品AFs總量快速檢測(cè)ELISA試劑盒,其對(duì)AFs B+G標(biāo)準(zhǔn)品的LOD為0.26 μg/kg,檢測(cè)范圍為0.26～20.00 μg/kg,對(duì)AFBl、AFB2、AFG1和AFG2的CR分別為100%、57.5%、104.0%和19.0%,對(duì)玉米3個(gè)加標(biāo)回收率分別為98.63%、94.56%和112.05%,對(duì)花生的3個(gè)加標(biāo)回收率分別為88.66%、87.50%和85.60%。目前,國(guó)內(nèi)外許多公司研發(fā)出商品化、標(biāo)準(zhǔn)化的AFs總量檢測(cè)ELISA試劑盒,在靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、適用性等方面均有良好的表現(xiàn),已成為AFs總量檢測(cè)的重要手段。如Zheng等[31]用新加坡Biomin公司的AFs總量ELISA試劑盒檢測(cè)玉米、高粱、小麥、大米、大豆、花生和棉籽等樣品,LOD為4.0 μg/kg,檢測(cè)范圍為4.0～40.0 μg/kg,試劑盒保存期為1年,其敏感度與HPLC相當(dāng)。Iqbal等[32]用美國(guó)Romer Labs科技公司的AFs總量ELISA試劑盒對(duì)120個(gè)糙米樣品進(jìn)行檢測(cè),并用TLC、HPLC和LC/MS-MS理化檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明,ELISA試劑盒的LOD為1.0 μg/kg,檢測(cè)范圍為1.0～40.0 μg/kg,加標(biāo)回收率范圍為83.2%～90.4%,實(shí)際檢出陽(yáng)性88個(gè),樣品AFs總量值1.24～11.68 μg/kg,檢測(cè)結(jié)果與TLC、HPLC和LC/MS-MS的檢測(cè)結(jié)果完全一致,檢測(cè)靈敏度ELISA試劑盒優(yōu)于TLC,但稍低于HPLC和LC/MS-MS。

2.2 膠體金免疫層析法

GICA檢測(cè)小分子半抗原的原理是:當(dāng)樣品中不含小分子半抗原時(shí),游離的金標(biāo)抗體與固定在膜上的半抗原結(jié)合形成紅色條帶,檢測(cè)結(jié)果呈陰性;當(dāng)樣品中含有小分子半抗原時(shí),其與游離的金標(biāo)抗體結(jié)合,抑制了金標(biāo)抗體與固定在膜上的半抗原結(jié)合,樣品中小分子半抗原的含量決定了膜上紅色條帶的深淺或有無(wú),檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。GICA的優(yōu)點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、可現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、篩檢樣品量大。缺點(diǎn)是只能定性或半定量檢測(cè),無(wú)法準(zhǔn)確定量;檢測(cè)靈敏度不及ELISA、HPLC和LC/MS-MS[33]。Anfossi等[34]利用自主研制的B族、G族混合單抗研制出AFs總量檢測(cè)試紙(Test strip),LOD為1.0 μg/kg,檢測(cè)范圍為1.0～40.0 μg/kg,用Test strip對(duì)25個(gè)玉米樣品進(jìn)行檢測(cè),并用HPLC進(jìn)行確證,檢測(cè)結(jié)果與HPLC完全相符,相關(guān)回歸方程為y=0.97x+0.07,變異系數(shù)(R2)為0.980。Zhang等[35]用自主制備的1C11雜交瘤所分泌的單一通用單抗研制出AFs總量Test strip,LOD為0.46 μg/kg,對(duì)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的LOD為0.03、0.06、0.12和0.25 μg/kg,用Test strip檢測(cè)花生樣品,對(duì)檢出的20個(gè)陽(yáng)性樣品分別測(cè)定AFs污染組分,并用HPLC進(jìn)行確證,結(jié)果表明,同時(shí)檢出AFBl、AFB2、AFG1和AFG2污染樣品0個(gè),同時(shí)檢出AFB1、AFB2和AFG1污染樣品3個(gè),同時(shí)檢出AFB1和AFB2污染樣品18個(gè),只檢出AFB1污染樣品1個(gè),只檢出AFB2污染樣品1個(gè),檢測(cè)與HPLC完全一致。徐振斌等[36]應(yīng)用美國(guó)clover icheck公司的AFs總量Test strip對(duì)市售96個(gè)玉米樣品進(jìn)行篩檢,檢出的5個(gè)陽(yáng)性樣品用HPLC確證,Test strip的LOD為1.0 μg/kg,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于15.2%,加標(biāo)回收率范圍為82.4%～95.8%,Test strip的檢測(cè)結(jié)果與HPLC的檢測(cè)結(jié)果完全一致。

2.3 熒光免疫分析法

FIA原理是基于熒光未標(biāo)記的抗原(Ag)和熒光標(biāo)記抗原(Ag-F)共同競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體(Ab)的有限位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)的免疫分析方法,目前已建立的用于AFs總量檢測(cè)的FIA主要包括熒光偏振免疫分析法(Fluorescence polarization immunoassay,FPIA)和時(shí)間分辨熒光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)兩種。

2.3.1 熒光偏振免疫分析法 FPIA檢測(cè)小分子半抗原的原理是:用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗原或抗體,抗原抗體進(jìn)行特異性結(jié)合反應(yīng)后,依據(jù)抗原抗體結(jié)合物熒光偏振程度的差異,用競(jìng)爭(zhēng)性方法測(cè)量待測(cè)樣品中小分子化合物的含量。分析方法包括置換(Single-Reagent FPIA)、停流FPIA(Stopped-Flow FPIA)和有機(jī)介質(zhì)FPIA(Organic Medium FPIA)三種技術(shù)模式。FPIA的優(yōu)點(diǎn)是高通量、速度快、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低、定量檢測(cè)和可大批量快速篩選樣本。缺點(diǎn)是由于存在基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致有假陽(yáng)性、由于需要專門(mén)熒光偏振設(shè)備導(dǎo)致儀器成本高、由于多采用杯式檢測(cè)裝置導(dǎo)致試劑用量大且檢測(cè)效率低[37]。Nasir等[38]用研制的AFs族特異性單抗建立FPIA,檢測(cè)谷物樣品包括玉米、高粱、花生油、花生醬中AFs總量殘留,并與HPLC比較確證,添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AFs混合物Bl/B2/Gl/G2按重量比為7/1/3/1,FPIA的LOD為1.0 μg/kg,檢測(cè)范圍為1.0～32.0 μg/kg,檢測(cè)結(jié)果與HPLC的檢測(cè)結(jié)果完全一致,R2為0.99,研究結(jié)論為FPIA可用于AFs總量檢測(cè)。Sheng等[39]用廣譜性較強(qiáng)的抗AFB1單抗建立FPLA,其對(duì)AFB1的IC50值為23.33 μg/kg,LOD為13.12 μg/kg,對(duì)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的CR分別為100%、65.7%、143%和23.5%,所建立的FPLA可用于AFs的總量檢測(cè)。

2.3.2 時(shí)間分辨熒光免疫分析法 TRFIA檢測(cè)小分子半抗原的原理是:使用鑭系元素(Eu、Tb、Sm、Dy等)長(zhǎng)效熒光標(biāo)記物,在關(guān)閉激發(fā)光后再測(cè)定熒光強(qiáng)度的分析方法。TRFIA的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、檢測(cè)線性范圍寬、重復(fù)性好、試劑保存時(shí)間長(zhǎng)、無(wú)污染危害等,TRFIA是目前公認(rèn)的最為敏感的免疫學(xué)分析方法。缺點(diǎn)是試劑純度要求較高、鑭系元素離子螯合物的合成難度較大、標(biāo)記多個(gè)靶標(biāo)物難度大進(jìn)而多元檢測(cè)受到局限等[40]。Degan等[41]最早研究報(bào)道,以Eu3+標(biāo)記廣譜性的AF B1多克隆抗體,建立TRFIA用于AFs總量檢測(cè),并與ELISA方法進(jìn)行了比較,對(duì)AFs總量的LOD為0.004 μg/kg,檢測(cè)范圍為0.004～4 μg/kg,其靈敏度高于ELISA。Wang等[42]用Eu3+納米球標(biāo)記廣譜性的AFs單抗,建立了用于AFs總量檢測(cè)的金納米TRFIA(Eu-Nano-TRFIA),該方法檢測(cè)AFs總量包括AFB1、AFB2、AFG1和AFG24種,檢測(cè)時(shí)間12 min,LOD為0.16 μg/kg,檢測(cè)范圍為0.16～30.0 μg/kg,加標(biāo)回收率為83.9%～113.9%,變異系數(shù)(CVs)為3.5%～8.8%,對(duì)397個(gè)飼料原料樣本進(jìn)行實(shí)際檢測(cè),陽(yáng)性檢出率為78.3%,陽(yáng)性樣本AFs總量濃度值為0.50～145.30 μg/kg,其中棉籽餅中AFs含量最高為18.48 μg/kg。該方法與HPLC、ELISA、GICA相比,具有靈敏、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn),LOD符合我國(guó)規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn),可較好滿足食品AF總量污染殘留檢測(cè)的需求。

2.4 免疫傳感器法

IS檢測(cè)小分子半抗原的原理是:IS由抗原或抗體與換能器組成,待測(cè)樣品中小分子半抗原與固化在傳感器表面的特異性抗體反應(yīng)形成抗原抗體結(jié)合物,結(jié)合物量的大小決定IS的電荷信號(hào),換能器根據(jù)電荷信號(hào)的強(qiáng)弱變化,達(dá)到檢測(cè)待檢半抗原的目的。IS根據(jù)傳感技術(shù)原理可分為光學(xué)免疫傳感器、電化學(xué)免疫傳感器、熱量免疫傳感器和質(zhì)量免疫傳感器4類[43],目前已建立了用于AFs檢測(cè)的光學(xué)免疫傳感器[44]和電化學(xué)免疫傳感器[45]。IS用于AFs總量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是攜帶方便、操作簡(jiǎn)單、成本較低、可自動(dòng)化檢測(cè)。其缺點(diǎn)是抗原抗體固化技術(shù)不夠成熟、靈敏度與精密度需要進(jìn)一步提高、難以實(shí)現(xiàn)多元檢測(cè)和難以實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)[46]。Kong等[47]用納米金研制出半定量和定量IS,實(shí)現(xiàn)了霉菌毒素的多元IS檢測(cè),可同時(shí)檢測(cè)霉菌毒素20種,其中選擇敏感、特異的AFs族廣譜性單抗,可同時(shí)檢測(cè)AFB1、AFB2、AFG1和AFG2,LOD為0.25 μg/kg,檢測(cè)范圍為0.25～4.0 μg/kg。

3 展望

在目前已發(fā)現(xiàn)的20種AFs中,自然條件下產(chǎn)生的AFs主要是B1、B2、G1、G24種,且這4種毒素殘留對(duì)人體健康的毒性往往具有協(xié)同和加性效應(yīng),實(shí)施AFs總量檢測(cè)已成為當(dāng)前食品質(zhì)量安全檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展的必然趨勢(shì),而特異性強(qiáng)、識(shí)別譜廣單一或混合通用抗體的制備和相應(yīng)靈敏度高、快速簡(jiǎn)便檢測(cè)方法的建立成為技術(shù)關(guān)鍵。在抗原合成及抗體制備方面,隨著免疫學(xué)、計(jì)算科學(xué)、量子化學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)等學(xué)科理論的發(fā)展,以及分子模擬技術(shù)、計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)分析技術(shù)等的應(yīng)用,以半抗原分子空間結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度、活性位點(diǎn)的選擇、活性基團(tuán)的引入和進(jìn)入間隔臂的長(zhǎng)度為主要研究?jī)?nèi)容的半抗原分子設(shè)計(jì)與抗原合成理論逐漸豐富與完善,對(duì)于提高半抗原分子設(shè)計(jì)與抗原合成的合理性、時(shí)效性和預(yù)見(jiàn)性提供了可供借鑒的理論與方法[48-50]。Kim等[28]通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助技術(shù),制備出了特異性強(qiáng)、識(shí)別譜廣的AF 單一通用抗體,以ELISA技術(shù)模式實(shí)現(xiàn)了AF的總量檢測(cè)。周茜等[51]借助分子模擬技術(shù),成功制備了G族AF mAb,對(duì)AFG1、AFG2的IC50分別為17.18、19.75 ng/mL,建立了以G族AF ELISA檢測(cè)方法。在免疫快速檢測(cè)方法的選擇與建立方面,隨著抗體標(biāo)記技術(shù)如酶標(biāo)記、納米金標(biāo)記、熒光標(biāo)記、量子點(diǎn)標(biāo)記等的逐步完善和新的標(biāo)記技術(shù)如鑭系元素標(biāo)記等的不斷出現(xiàn),免疫檢測(cè)方法正向靈敏、快速、準(zhǔn)確、高效、操作簡(jiǎn)單的方向發(fā)展,將在AFs總量檢測(cè)中發(fā)揮重要作用,對(duì)于推動(dòng)我國(guó)食品安全免疫檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展具有積極意義。

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Advance in immunoassay of total aflatoxins in food

WANG Ya-nan1,2,WANG Xiao-fei3,NIU Lin-lin1,2,LEI Zhuang1,2,ZHANG Hai-tang1,2,WANG Zi-liang1,2,*

(1.The Animal Science and Technology College,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China;2.Animal Viral Disease Control and Residual Analysis Henan HigherEducation Key Discipline Open Laboratory,Xinxiang 453003,China;3.School of Xinke,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

Aflatoxins(AFs)contamination of food was widespread,serious and harmful to the food industry concern and a single aflatoxin detection had been unable to meet the needs of the food industry. For the detection of total aflatoxins in food commonly used physical and chemical analysis method,compared with the immunoassay with high specificity,high sensitivity,simplicity and other technical advantages,immunoassay had become the future direction of development and an important research topic. In this paper,the research progress of the total aflatoxins detection with immunoassay were reviewed and the aim was to provide new methods and ideas for the immunoassay of total aflatoxins in food.

food;total aflatoxins;immunoassay;research progress

2017-02-14

王亞楠(1989-), 女, 碩士研究生, 研究方向：食品安全免疫檢測(cè),E-mail:792176339@qq.com。

*通訊作者:王自良(1966-),男,博士,教授,研究方向：免疫學(xué)與抗體工程,E-mail:wangziliang66@126.com。

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAD13B05)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)13-0344-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.13.065