牛羊布魯氏菌天然半抗原瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的建立與應(yīng)用

摘 要：【目的】建立并優(yōu)化布魯氏菌天然半抗原瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（Native hapten agar gel immuno-diffusion test，NH-AGID），檢測(cè)臨床樣品。

【方法】建立NH-AGID方法，評(píng)價(jià)方法特異性、敏感性及重復(fù)性；檢測(cè)免疫地區(qū)2 287份、非免疫地區(qū)252份牛、羊血清。

【結(jié)果】建立了NH-AGID方法，檢測(cè)穩(wěn)定，重復(fù)性好，具有較高的特異性；對(duì)自然感染陽(yáng)性動(dòng)物檢測(cè)敏感性低于80%，對(duì)排菌動(dòng)物的檢測(cè)敏感性高于90%，檢出布病陽(yáng)性抗體的閾值高于RBT。免疫地區(qū)血清NH抗體平均檢出率17.8%，LPS抗體平均檢出率52.3%；非免疫地區(qū)血清NH抗體平均檢出率40.9%，LPS抗體平均檢出率54.8%。

【結(jié)論】應(yīng)用NH-AGID方法可鑒別區(qū)分免疫地區(qū)牛、羊布病感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物。檢出NH抗體動(dòng)物處于布魯氏菌活動(dòng)期或排菌期為布病感染動(dòng)物，應(yīng)及時(shí)剔除出群。

關(guān)鍵詞：布魯氏菌病；半抗原-瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)；診斷

中圖分類號(hào)：S855 ""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ""文章編號(hào)：1001-4330（2024）08-2063-08

收稿日期（Received）：2024-01-18

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)（2022B03013-1）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2020AB015）

作者簡(jiǎn)介：劉麗婭（1984-），女，安徽阜陽(yáng)人，副研究員，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物疫病防控，（Ｅ-mail）286238083@qq.com

通訊作者：易新萍（1970-），女，湖北公安人，研究員，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物疫病防控，（E-mail）821489803@qq.com

李巖（1966-），男，山東人，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物疫病預(yù)防控制，（E-mail）bt4641862@ 163.com

0 引 言

【研究意義】布魯氏菌病Brucellosis（簡(jiǎn)稱布病）是人畜共患?。?］。自2000年以來，我國(guó)布病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且上升速度很快［2］。該病影響畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展［3］。疫苗免疫是防控布病的重要手段［4］，雖然牲畜免疫后可產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)效果，但也存在感染風(fēng)險(xiǎn)，以及免疫后無法區(qū)分免疫抗體和自然感染抗體，干擾血清檢測(cè)等缺陷［5-6］。建立并優(yōu)化布病鑒別診斷的方法，對(duì)準(zhǔn)確早期鑒別及診斷牛、羊該病有實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前我國(guó)尚無對(duì)疫苗免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物進(jìn)行有效鑒別診斷的血清學(xué)方法［7］。有研究采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行初篩，再通過NH-AGID確診，區(qū)分了布魯氏菌疫苗Rev.1株免疫抗體和感染抗體［8］，也可應(yīng)用NH-AGID對(duì)布病自然感染牛和免疫S19株疫苗牛進(jìn)行鑒別診斷［9］。還有使用NH-AGID方法對(duì)血清檢測(cè)陽(yáng)性動(dòng)物區(qū)分自然感染抗體和疫苗抗體，實(shí)現(xiàn)了布病的凈化［10］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)牛羊布魯氏菌天然半抗原瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的建立與應(yīng)用文獻(xiàn)研究較少，需研究鑒別診斷布病疫苗免疫背景下區(qū)分自然感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物的NH-AGID方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立布魯氏菌NH-AGID試驗(yàn)方法，優(yōu)化檢測(cè)條件，并應(yīng)用建立的方法檢測(cè)不同免疫背景和自然感染的牛、羊血清樣本，為畜間布病鑒別診斷提供可選擇的方法及相關(guān)研究臨床檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑

布病虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）抗原購(gòu)自青島立見生物科技有限公司；2×PCRmix、無水乙醇、硼酸、氯化鉀、NaOH、瓊脂糖購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。引物合成自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 NH和LPS抗原

由青島瑞爾唯特生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.3 血清樣品

1.1.3.1 布病陽(yáng)性血清

在無布病疫苗接種史的羊群采集布病陽(yáng)性血清共6份：RBT、SAT 和CFT檢測(cè)均為陽(yáng)性，其中牛、羊強(qiáng)陽(yáng)性血清各1份、中陽(yáng)性各1份、弱陽(yáng)性血清各1份；布病PCR診斷陽(yáng)性、RBT診斷陽(yáng)性牛、羊血清各24份；經(jīng)RBT、SAT 檢測(cè)均為陽(yáng)性的無布病疫苗接種史牛、羊血清各50份。

1.1.3.2 布病陰性血清

采集自無布病疫苗接種史的牛群和羊群，經(jīng)RBT、SAT和CFT檢測(cè)均為陰性的牛、羊血清各20份。

1.1.3.3 其他陽(yáng)性血清

口蹄疫O型抗體陽(yáng)性血清、A型抗體陽(yáng)性血清、牛支原體抗體陽(yáng)性血清、牛分枝桿菌抗體陽(yáng)性血清、大腸桿菌抗體陽(yáng)性血清均為新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)所保存血清。

1.1.3.4 臨床樣品

收集布病疫苗免疫后一年內(nèi)經(jīng)RBT、SAT檢測(cè)均為陽(yáng)性的血清共2 287份，其中布魯氏菌A19-ΔVirB12疫苗免疫牛血清342份、A19疫苗免疫牛血清1 688份、M5株疫苗免疫羊血清257份；非免疫地區(qū)經(jīng)RBT、SAT檢測(cè)均為陽(yáng)性的血清共252份，其中牛血清55份、羊血清197份。

1.2 方 法

1.2.1 診斷抗原的制備

參照WOAH陸生動(dòng)物疾病診斷和疫苗手冊(cè)在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室條件下，將培養(yǎng)的羊種布魯氏菌16M菌液進(jìn)行滅活；12 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清后將沉淀物加ddH2O重懸，12 000 r/min、4℃離心10 min，洗滌2次；按1∶4體積比加ddH2O重懸沉淀物，121℃高壓30 min后12 000 r/min 4℃離心20 min，取上清加入3倍體積無水乙醇，4℃攪拌過夜；15 000 r/min、4℃離心20 min，取沉淀物用適量雙蒸水重懸，透析12 h、凍干、稱重，重量應(yīng)不低于5 mg，所得產(chǎn)物為NH和LPS抗原混合物，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 瓊脂平板的制備

配制硼酸緩沖液：分別稱取硼酸6.2 g、氯化鉀7.25 g，加入ddH2O 800 mL，攪拌至藥品完全溶化。用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至8.3后，定容至1 000 mL。每100 mL硼酸緩沖液中加入不同濃度的瓊脂糖，水浴加熱至完全溶解。在直徑為60 mm的一次性平皿中加入5 mL瓊脂溶液，凝固后用孔徑4 mm、孔距3 mm的7孔梅花型打孔器打孔，加熱封底。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 操作及判定

中心孔加抗原，側(cè)面孔加被檢血清。LPS沉淀線靠近中心抗原孔端，出現(xiàn)LPS沉淀線判定為免疫動(dòng)物；NH沉淀線靠近側(cè)面加樣孔端，同時(shí)出現(xiàn)NH、LPS兩條沉淀線或只出現(xiàn)NH沉淀線均判定為感染動(dòng)物。圖1

1.2.4 條件優(yōu)化

1.2.4.1 NH和LPS混合抗原濃度

將NH和LPS抗原混合物用ddH2O分別稀釋至0.5、1.0、1.5、2.0、 2.5和3.0 mg/mL等6個(gè)不同濃度，取15 μL加入中央孔，周邊6個(gè)孔各加入15 μL羊布病陽(yáng)性血清（2份強(qiáng)陽(yáng)性、2份中陽(yáng)性、2份弱陽(yáng)性），放置濕盒中，連續(xù)觀察，記錄結(jié)果。

1.2.4.2 瓊脂濃度

依次配制0.6%、1.0%、1.2%、1.5%、1.7%和2.0%等6種不同濃度的瓊脂平板，中央孔加入15 μL最佳濃度抗原，周邊6個(gè)孔各加入15 μL羊布病陽(yáng)性血清，放置濕盒中，連續(xù)觀察記錄。

1.2.4.3 孵育溫度和孵育時(shí)間

瓊脂平板中央孔加入15 μL最佳濃度抗原，周邊6個(gè)孔各加入15 μL陽(yáng)性血清。將平板置于濕盒中，分別放在18、22、25、30和37℃ 5個(gè)溫度條件下，孵育4、8、16及24 h，連續(xù)觀察記錄。

1.2.5 敏感性檢測(cè)

1.2.5.1 與RBT方法敏感性比對(duì)

將布病強(qiáng)陽(yáng)性血清1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128和1∶256倍稀釋后，應(yīng)用建立的NH-AGID方法和RBT方法同時(shí)檢測(cè)，比較NH-AGID方法與RBT方法的敏感性差異。

1.2.5.2 自然感染血清

檢測(cè)50份自然感染牛、50份自然感染羊血清樣品，評(píng)價(jià)該方法對(duì)自然感染血清檢測(cè)敏感性。

1.2.5.3 病原學(xué)陽(yáng)性樣品

檢測(cè)25份布病PCR診斷陽(yáng)性牛血清、25份布病PCR診斷陽(yáng)性羊血清樣品，評(píng)價(jià)該方法檢測(cè)NH抗原的敏感性。

1.2.6 特異性

應(yīng)用建立的NH-AGID方法檢測(cè)口蹄疫O型抗體陽(yáng)性血清、A型抗體陽(yáng)性血清、牛支原體抗體陽(yáng)性血清、牛分枝桿菌抗體陽(yáng)性血清、大腸桿菌抗體陽(yáng)性血清和布病陰性血清，評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法的特異性。

1.2.7 重復(fù)性

按照優(yōu)化后的NH-AGID最佳抗原濃度和瓊脂濃度，制備3批檢測(cè)平板，分別檢測(cè)布病陽(yáng)性血清和布病陰性血清，評(píng)價(jià)方法的重復(fù)性。

1.2.8 臨床血清樣品

應(yīng)用建立的NH-AGID方法檢測(cè)收集自免疫地區(qū)和非免疫地區(qū)的2 539份牛、羊陽(yáng)性血清進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)條件優(yōu)化

2.1.1 最佳抗原濃度

研究表明，當(dāng)混合抗原濃度為1.0和1.5 mg/mL時(shí)，布病強(qiáng)陽(yáng)、中陽(yáng)、弱陽(yáng)性血清均能形成NH沉淀線和LPS沉淀線，選定最佳抗原濃度為1.0 mg/mL。表1

2.1.2 最佳瓊脂濃度

研究表明，當(dāng)瓊脂平板濃度為1.2%時(shí)，布病強(qiáng)陽(yáng)、中陽(yáng)、弱陽(yáng)性血清均能夠形成NH沉淀線和LPS沉淀線，并且此時(shí)弱陽(yáng)性血清出現(xiàn)的NH沉淀線最清晰。選定瓊脂糖平板最佳濃度為1.2%。表2

2.1.3 最佳孵育溫度和孵育時(shí)間

研究表明，在22、25和30℃條件孵育4 h時(shí)強(qiáng)陽(yáng)血清出現(xiàn)NH抗原沉淀帶；8 h時(shí)中等陽(yáng)性血清出現(xiàn)NH抗原沉淀帶；16 h時(shí)出現(xiàn)LPS抗原沉淀帶，且弱陽(yáng)性血清出現(xiàn)NH抗原沉淀帶；24 h以上弱陽(yáng)性NH沉淀帶最為完整、清晰。最終選定最佳孵育溫度為（25±3）℃，最佳孵育時(shí)間為24 h。表3

2.2 敏感性檢測(cè)

2.2.1 應(yīng)用NH-AGID方法

研究表明，布病強(qiáng)陽(yáng)性血清在1∶64稀釋時(shí)檢測(cè)為陽(yáng)性。RBT檢測(cè)敏感性高于NH-AGID方法。表4

2.2.2 布病自然感染陽(yáng)性動(dòng)物對(duì)應(yīng)血清NH-AGID方法檢測(cè)

研究表明，牛、羊血清NH和LPS沉淀線檢出率均在80%以下，牛、羊LPS沉淀線檢出率分別為88%、94%。NH-AGID方法對(duì)自然感染動(dòng)物檢測(cè)敏感性為72%。表5

2.2.3 布病PCR診斷陽(yáng)性動(dòng)物對(duì)應(yīng)血清NH-AGID方法檢測(cè)

研究表明，牛、羊血清NH和LPS沉淀線檢出率均在90%以上，LPS沉淀線檢出率為100%。表明NH-AGID方法對(duì)PCR陽(yáng)性動(dòng)物檢測(cè)敏感性為93.8%。表6

2.3 特異性及重復(fù)性檢測(cè)

研究表明，對(duì)口蹄疫O型抗體陽(yáng)性血清、A型抗體陽(yáng)性血清、牛支原體抗體陽(yáng)性血清、牛分枝桿菌抗體陽(yáng)性血清、大腸桿菌抗體陽(yáng)性血清和布病陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，均未檢測(cè)到NH沉淀線和LPS沉淀線。

應(yīng)用3批布魯氏菌NH半抗原瓊脂擴(kuò)散檢測(cè)平板，分別進(jìn)行敏感性和特異性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果符合率在97%以上。表7

2.4 臨床樣品檢測(cè)

2.4.1 布病不同疫苗免疫后血清檢測(cè)

研究表明，A19-VirB12株免疫牛NH抗體檢出率為5.6%，LPS抗體檢出率為78.7%；A19株免疫牛NH抗體檢出率為18.5%，LPS抗體檢出率為46.4%；M5株免疫羊NH抗體檢出率為28.8%，LPS抗體檢出率為55.3%。免疫地區(qū)血清NH抗體平均檢出率為17.8%，LPS抗體平均檢出率為52.3%。表8

2.4.2 布病自然感染血清

研究表明，牛血清LPS抗體檢出率為60%，NH抗體檢出率為34.5%；羊血清LPS抗體檢出率為53.3%，NH抗體檢出率為42.6%。非免疫地區(qū)血清NH抗體平均檢出率為40.9%，LPS抗體平均檢出率為54.8%。表9

3 討 論

3.1

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)又稱為雙向雙擴(kuò)散試驗(yàn)，原理是通過抗原、抗體在瓊脂凝膠中由近及遠(yuǎn)不斷地自由擴(kuò)散形成濃度梯度，在適當(dāng)比例處相遇形成沉淀線，以此來對(duì)抗體或抗原進(jìn)行鑒定、區(qū)分的一種試驗(yàn)方法［11］。NH-AGID是基于光滑型布魯氏菌表面天然半抗原（NH）和脂多糖（S-LPS）的免疫原性差異所建立的瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)方法，可對(duì)布病免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物進(jìn)行鑒別診斷。LPS抗原免疫原性強(qiáng)，無論是自然菌還是疫苗菌均能刺激機(jī)體產(chǎn)生LPS抗體［12］；NH抗原免疫原性弱［13-15］，只有在布魯氏菌感染，尤其是活動(dòng)期、排菌期，持續(xù)強(qiáng)烈刺激機(jī)體才能產(chǎn)生NH抗體［16］。檢測(cè)時(shí)根據(jù)形成不同的沉淀線對(duì)免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物進(jìn)行鑒別區(qū)分。

3.2

試驗(yàn)結(jié)果表明，NH-AGID方法檢測(cè)穩(wěn)定，重復(fù)性好，與其他5種疫病陽(yáng)性血清無非特異性反應(yīng)，布病陰性血清檢測(cè)也均為陰性，檢測(cè)特異性較高。但該方法的檢測(cè)敏感性低于RBT，對(duì)布病自然感染牛、羊血清NH抗體的檢出率低于80%，與楊珍等［17］研究結(jié)果一致，NH-AGID方法具有較好的特異性，但敏感性略低。因NH抗體的出現(xiàn)與布魯氏菌排出情況有關(guān)［18］，試驗(yàn)表明該方法對(duì)排菌動(dòng)物的檢測(cè)敏感性高于90%，進(jìn)一步驗(yàn)證了NH抗體的出現(xiàn)與布魯氏菌排出情況的密切相關(guān)性。

3.3

試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫地區(qū)M5株疫苗免疫羊血清NH抗體檢出率最高，達(dá)28.8%，可能和M5疫苗是我國(guó)目前使用疫苗中毒力最強(qiáng)的毒株，易引起動(dòng)物機(jī)體毒力過高有關(guān)［19］。A19-VirB12株標(biāo)記疫苗缺失了VirB12毒力基因，免疫保護(hù)力與親本株A19無顯著差異，但毒力減弱［20-21］。應(yīng)用NH-AGID方法檢測(cè)A19-VirB12株免疫牛血清效果較為理想，NH抗體檢出率為5.6%，LPS抗體檢出率為78.7%。免疫地區(qū)血清NH抗體平均檢出率達(dá)17.8%。

4 結(jié) 論

建立NH-AGID方法檢測(cè)穩(wěn)定，重復(fù)性好，具有較高的特異性。在免疫地區(qū)可應(yīng)用NH-AGID方法鑒別區(qū)分牛、羊布病感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物。先用常規(guī)布病血清學(xué)方法進(jìn)行初篩，初篩陽(yáng)性血清再用NH-AGID方法進(jìn)行鑒別診斷。

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Establishment and application of natural hapten agar diffusion

test for brucella

LIU Liya1， YAN Wenliang2， CAO Rui3， YE Feng1， MA Xiaojing1， GU Wenxi1， ZHAO Jiangshan4，

ZHANG Zirong5， SONG Jie6， LI Yan2， YI Xinping1

（1.Xinjiang Key Laboratory of Animal Infectious Diseases， Institute of Veterinary Medicine， Xinjang Academy of Animal Sciences， Urumqi 830011，China; 2. The General Station of Animal Husbandry and Veterinary of Xinjiang Production and Construction Corps， Urumqi 830021， China ;3.Qingdao Real Bio-Technology Co.， Ltd， Qingdao Shandong 266000， China ;4. Centre for Disease Control and Prevention of Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830000，China; 5. Animal Husbandry and Veterinary Work Station of the Sixth Division， Xinjiang Production and Construction Corps， Wujiaqu Xinjiang 831304，China;6.Xinjiang Tianrun Dairy limited Co.，Ltd， Urumqi 830000， China）

Abstract：【Objective】 To establish and optimize the natural hapten agar gel immuno-diffusion test （NH-AGID） for Brucella abortus in clinical samples.

【Methods】 The NH-AGID method was established to evaluate the specificity， sensitivity and reproducibility of the method; 2，287 bovine and sheep sera from immunized areas and 252 from non-immunized areas were tested.

【Results】 The NH-AGID method with stable and reproducible assay and high specificity was successfully established; The sensitivity of the assay for naturally infected positive animals was lower than 80%; The sensitivity of the assay for releasing animals was higher than 90%; The threshold for detecting bruclosis-positive antibodies was higher than RBT. The average detection rate of serum NH antibodies in immunized areas was 17.8%， and the average detection rate of LPS antibodies was 52.3%; the average detection rate of serum NH antibodies in non-immunized areas was 40.9%， and the average detection rate of LPS antibodies was 54.8%.

【Conclusion】 The NH-AGID method can be applied to identify and distinguish bovine and sheep brucellosis-infected animals from immunized animals in immunized areas. Animals detected with NH antibodies in the active or excretory phase of Brucella abortus are brucellosis-infected animals and should be removed from the herd in time.

Key words：brucellosis; native hapten-agar gel immuno diffusion; diagnosis

Fund projects：Key Ramp;D Special Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region" （2022B03013-1） ;The Project of Tackling Hard-Nut Problems in Science and Technology of XPCC （2020AB015）

Correspondence author：YI Xinping（1970-）， female， from Gongan， Hubei， PhD， researcher， research direction： animal disease prevention and control research， （E-mail）821489803@qq.com

LI Yan（1966-）， male， from Shandong， researcher，Master's supervisor， research direction： animal disease prevention and control， （E-mail）bt4641862@ 163.com