轉 pGH基因豬與非轉基因豬成纖維細胞系的建立及鑒定

崔小榮，李曉玲，于光輝，魏成曉，趙玲玲，鞏建飛，張廷榮，孫金海

(青島農業(yè)大學動物科技學院，山東 青島 266109)

轉 pGH基因豬與非轉基因豬成纖維細胞系的建立及鑒定

崔小榮，李曉玲，于光輝，魏成曉，趙玲玲，鞏建飛，張廷榮，孫金海

(青島農業(yè)大學動物科技學院，山東 青島 266109)

本試驗采用組織塊貼壁法對初生仔豬的耳組織進行原代培養(yǎng)，成功分離出轉pGH基因豬與非轉基因豬成纖維細胞，并對細胞進行形態(tài)學觀察，凍存前和復蘇后細胞活力檢測，生長動力學分析，波形蛋白免疫組化，染色體計數(shù)以及微生物污染檢測等生物學特性分析。結果表明，原代細胞經(jīng)過胰蛋白酶消化和差速離心分離培養(yǎng)出成纖維細胞，7組細胞凍存前細胞活力均在為92%以上，凍存3個月后細胞復蘇活力仍在89%以上;細胞生長總趨勢呈“S”型，即經(jīng)歷了潛伏期、指數(shù)生長期和平臺期3個階段;細胞波形蛋白免疫組化在成纖維細胞中呈陽性反應;染色體計數(shù)結果表明，染色體數(shù)量穩(wěn)定;成纖維細胞的細菌、真菌、病毒和支原體檢測均為陰性。本試驗成功建立了轉pGH基因豬與非轉基因豬成纖維細胞系。

pGH基因;轉基因豬;成纖維細胞系;細胞培養(yǎng);生物學特性

豬生長激素(pGH)是由豬腦垂體前葉嗜酸性細胞分泌的單一肽鏈蛋白質類激素。生長激素生理作用廣泛，能夠影響幾乎所有的組織類型和細胞的生長分裂，可顯著影響動物的生長發(fā)育。pGH通過IGF－I的介導發(fā)揮作用，是調節(jié)肌肉形成的主要內分泌因子之一。因為生長激素在動物生長軸中的重要作用，使其一直是育種研究的熱點之一。1985年，科學家第1次將人的生長激素基因導入豬的受精卵獲得成功，轉基因豬與同窩非轉基因豬比較，生長速度和飼料利用效率顯著提高，胴體脂肪率也明顯下降［1］。國內外專家學者對pGH的應用效果進行了大量的試驗，證實注射生長激素能夠提高豬日增重、瘦肉率，降低脂肪含量。2010年，吳明明等成功構建了pGH基因真核表達載體，通過精子介導納米基因載體法成功制備轉pGH基因豬［2］，陽性率高達45．83%。蔣亞軍等對F0代轉基因豬進行熒光原位雜交確定了外源pGH基因已經(jīng)整合到染色體上，并且整合位點具有隨機性和差異性［3］。劉劍飛等利用SYBR Green I Real-time PCR法檢測F0代轉pGH基因母豬與非轉基因公豬配種所得的7頭轉pGH基因豬與9頭非轉基因豬3月齡生長激素的表達水平，結果顯示，F(xiàn)1代轉基因豬生長激素平均表達水平是同窩非轉基因豬的1．77倍［4］，證實了外源pGH基因在豬體內的穩(wěn)定傳代。此外，本實驗室對F1和F3代轉pGH基因豬分別進行生長性能測定，結果顯示，轉基因豬的生長、發(fā)育及胴體品質均優(yōu)于非轉基因豬［5－6］。姚延珠等采用相同的方法制備出轉pGH/IGF-1雙基因豬，陽性率為30.76%［7］。范巖巖等對轉pGH/IGF-1雙基因豬、轉pGH基因豬和非轉基因豬的生長性狀進行比較，結果顯示，轉雙基因豬個體均重比轉單基因豬的高2.83%，差異顯著(P＜0．05);轉雙基因豬比非轉基因豬高7．37%，差異顯著(P＜0．05)［8］。各項試驗結果均表明，pGH基因對豬的生長性狀具有顯著影響，轉入的pGH基因是優(yōu)良基因。為將該優(yōu)良資源從細胞水平上長期保存下來，并且為后序試驗研究提供易于保存和獲取的試驗材料，降低飼養(yǎng)成本，本試驗采用組織塊貼壁法培養(yǎng)轉pGH基因豬初生仔豬的耳組織，建立轉pGH基因豬成纖維細胞系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 轉pGH基因母豬與非轉基因公豬雜交后產仔7頭，采集初生仔豬耳組織帶回實驗室進行原代細胞培養(yǎng)。7頭仔豬中有4頭為轉pGH基因豬，3頭為非轉基因豬。4頭轉pGH基因豬為2頭公豬和2頭母豬，3頭非轉基因豬為2頭公豬和1頭母豬。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 DMEM，購自Hyclone公司;胰蛋白酶、L-Glutamine、標準胎牛血清，購自Transgen Biotech北京全式金生物技術有限公司; DPBS、二甲基亞砜(DMSO)、兔抗豬免疫血清、0.4%臺盼藍染液、非必需氨基酸、青鏈霉素和Giemsa，均購自Solarbio北京索萊寶科技有限公司;免疫組化試劑盒，購自Biotopped北京波奧拓科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng) 將采集的初生仔豬耳尖組織浸入含有雙抗的PBS中立刻帶回實驗室進行細胞分離，原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的方法采用馬康［9］等的方法。

1.2.2 細胞凍存與復蘇 細胞的凍存與復蘇方法采用李曉玲［10］等的方法。

1.2.3 細胞形態(tài)觀察 觀察原代細胞和傳代細胞的形態(tài)，包括細胞類型、形狀、大小、核質比例和核仁大小等。通過姬姆薩(Giemsa)染色，于顯微鏡下觀察染色后細胞形態(tài)。

1.2.4 細胞凍存前和復蘇后活力檢測 在凍存前和復蘇后分別取90μL細胞懸液加入10μL臺盼藍染色液染色后，用血球計數(shù)板記染成藍色的死細胞數(shù)和未染色的活細胞數(shù)，并計算活細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比。

1.2.5 生長曲線繪制 取24孔培養(yǎng)板，每孔接種1．0×104個細胞。將其置于恒溫培養(yǎng)箱(37．5℃，5．0%CO2)中進行培養(yǎng)。從接種時間算起，每24 h取3孔細胞進行細胞計數(shù)，求平均值，連續(xù)計數(shù)9 d，直至細胞密度降低為止。以培養(yǎng)時間為橫坐標，細胞密度為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.6 免疫組化鑒定 當培養(yǎng)皿中細胞生長密度達90%左右時，采用S-P法進行免疫組化，按照試劑盒的操作說明書進行試驗，DAB溶液顯色5～10 min，用蒸餾水沖洗終止顯色反應，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 成纖維細胞染色體制片 選擇80%～90%匯合的對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細胞，于4℃冰箱中放置6 h，消化細胞后常規(guī)方法進行染色體制片，具體步驟采用張德福［11］等的方法稍加改進。Giemsa染色后在顯微鏡下觀察并拍照。隨機選取100個鋪展完好的中期分裂相進行染色體計數(shù)。

1.2.8 微生物污染檢測 細菌檢測:將待檢細胞在無雙抗的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4 d，觀察培養(yǎng)液是否變渾濁或者變黃;真菌檢測:觀察培養(yǎng)液是否出現(xiàn)云霧狀，于顯微鏡觀察是否出現(xiàn)纖維狀菌絲體或密集孢子;病毒檢測:于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，觀察有無蝕斑、空斑等損傷情況;支原體檢測:Hoechst 33258 DNA熒光染色法染色后將玻片置于熒光顯微鏡下，觀察細胞的熒光分布狀態(tài)，判斷是否有支原體污染。

2 結果與分析

2.1 細胞形態(tài)觀察

2.1.1 細胞原代培養(yǎng)形態(tài)觀察 圖1A顯示為培養(yǎng)48 h后細胞形態(tài)，可觀察到組織塊附近有少量梭形、不規(guī)則三棱形的成纖維細胞游離生長，除此細胞外還有橢圓形或圓形的上皮樣細胞生長，沒有組織塊的區(qū)域細胞密度極低。圖1B顯示為培養(yǎng)至第7天時細胞形態(tài)，培養(yǎng)皿皿底長滿細胞，即可進行傳代培養(yǎng)。

圖1 原代細胞培養(yǎng) (×100)A:原代培養(yǎng)2 d后的細胞形態(tài);B:原代培養(yǎng)7 d后的細胞形態(tài)

2.1.2 細胞傳代培養(yǎng)形態(tài)觀察 當細胞匯合達90%左右時進行傳代，采用胰酶消化法和差速離心法可將成纖維細胞和上皮樣細胞及其他細胞分離開來，胰酶消化后的細胞形態(tài)如圖2 A所示。經(jīng)3～4代培養(yǎng)的細胞僅剩成纖維細胞，經(jīng)傳代后細胞生長速度加快，細胞形態(tài)沒有發(fā)生明顯的變化。傳代后的細胞形態(tài)如圖 2 B所示。

圖2 傳代后成纖維細胞形態(tài)(×100)A:胰酶消化后細胞形態(tài);B:傳代后細胞形態(tài)

2.1.3 染色后細胞形態(tài)觀察 經(jīng)Giemsa染色后觀察，細胞呈長梭形、不規(guī)則三角形或扁平狀星形，核較大，卵圓形，胞質較多，為典型的成纖維細胞形態(tài)。染色結果如中插彩版圖3所示。

2.2 細胞凍存前與復蘇后活力檢測結果 將凍存3個月的細胞復蘇，復蘇的細胞在6 h后大量貼壁，24 h后大部分細胞都已貼壁并呈梭形生長。培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，去除死細胞和未貼壁細胞，培養(yǎng)4～5 d細胞匯合至80%～90%，即可進行傳代。轉pGH基因豬與同期培養(yǎng)的非轉基因豬成纖維細胞復蘇后活力較凍存前細胞活力稍有下降，轉pGH基因豬與非轉基因豬凍存前細胞活力均在90%以上，復蘇后均在89%以上。凍存前和復蘇后的成纖維細胞均有較高的活力，說明本細胞的活性較好，并且凍存方法適宜。

2.3 生長曲線繪制 轉pGH基因豬與非轉基因豬成纖維細胞的生長曲線均呈“S”型，分為潛伏期、指數(shù)生長期和平臺期3個階段。細胞計數(shù)結果見表1，生長曲線如圖4所示。

2.4 免疫組化鑒定結果 細胞波形蛋白在成纖維細胞中呈陽性反應，如圖5所示，細胞漿內呈大量黃色顆粒狀沉淀，即可確認為成纖維細胞。

表1 轉pGH基因豬與非轉基因豬成纖維細胞計數(shù)結果

圖4 轉pGH基因豬與非轉基因豬成纖維細胞的生長曲線

2.5 染色體觀察結果 公豬和母豬成纖維細胞中期分裂相染色體如圖6、圖7所示，染色體形態(tài)正常，數(shù)目為2n=38。分別對所培養(yǎng)的7組成纖維細胞所制染色體玻片計數(shù)100個4～5代細胞的染色體數(shù)目，染色體眾數(shù)2n=38的細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比均在90%以上，均達到建立細胞系75%～80%的要求，所建細胞系為穩(wěn)定的二倍體細胞系。

圖5 成纖維細胞免疫組化鑒定結果(×100)

圖6 公豬成纖維細胞中期分裂相染色體(×1 000)

圖7 母豬成纖維細胞中期分裂相染色體(×1 000)

2.6 微生物污染檢測結果

2.6.1 細菌、真菌及病毒檢測結果 顯微鏡觀察工作液培養(yǎng)的細胞，未見細胞培養(yǎng)液變渾濁，也無絲狀物生長，顯微鏡下觀察無空斑、蝕斑現(xiàn)象，表明細菌、真菌及病毒檢測結果均呈陰性。

2.6.2 支原體檢測結果 Hoechst 33258熒光染料檢測，如中插彩版圖8所示細胞核呈藍色橢圓狀或圓狀，表明細胞內無支原體存在，結果呈陰性。

3 討論

3.1 成纖維細胞的培養(yǎng)和凍存 目前原代細胞培養(yǎng)主要有組織塊貼壁法和酶消化法2種。酶消化法是利用胰酶的消化作用使細胞從組織中游離，收集游離出的有活性的單個細胞或是細胞團接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)［13］。這種方法的優(yōu)點是接種后細胞生長較快，利于后續(xù)試驗，但是胰酶作用時間長易對細胞造成損傷，損傷后細胞不易貼壁，細胞活性下降，消化時間難把握，適用于胎兒組織的原代細胞培養(yǎng)。組織塊法是將所取得的動物組織，在無菌條件下剪碎、或機械分散成適當體積的組織塊，將組織塊接種到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，隨著時間的推移，細胞在組織塊周圍分裂增殖形成生長暈，最終匯合鋪滿整個皿底。此方法操作簡便，對動物損傷?。?1］，對組織和細胞損傷小，但組織來源的年齡大小、生理狀態(tài)對后續(xù)試驗影響較大，老病動物體的組織不適合細胞培養(yǎng)。本研究直接使用初生仔豬打耳號剪下的耳組織采用組織塊貼壁法進行細胞原代培養(yǎng)，試驗成本低，而且對動物的存活和正常生長沒有任何不良影響。

3.2 成纖維細胞的生物學特性 培養(yǎng)的細胞經(jīng)姬姆薩染色后呈長梭形、不規(guī)則三角形或扁平狀星形，可初步判斷所培養(yǎng)的細胞為成纖維細胞。波形蛋白是特異性存在于成纖維細胞中的中間絲纖維。純化后的細胞進行波形蛋白免疫組化試驗后發(fā)現(xiàn)細胞包漿中有大量黃色顆粒狀沉淀，可以確認所培養(yǎng)的細胞為成纖維細胞。細胞的生長符合細胞生長的一般規(guī)律，每一代的細胞生長過程有3個階段［13］，分為潛伏期(第1～2天)、指數(shù)生長期(第3～6天)和平臺期(第7天開始)3個階段。在潛伏期，由于細胞需適應環(huán)境并恢復損傷，細胞需重新貼壁生長，此階段沒有細胞增殖。潛伏期后進入細胞對數(shù)生長期，細胞大量分裂、增殖，逐漸鋪滿整個空間，隨著細胞密度的增大，營養(yǎng)物質逐漸減少，代謝物質逐漸增多，細胞生長變緩，進入停滯期。其生長特點與太湖豬成纖維細胞［14］和巴馬香豬成纖維細胞［15］基本一致。染色體的數(shù)目、形狀、結構為不同生物所特有，在生物的繁殖進化以及生物個體的生長發(fā)育中，保持相對的穩(wěn)定性，體外細胞培養(yǎng)，可用作細胞遺傳學方面的研究，以確定細胞供體的種屬、供體的性別等特征［16］。但是細胞在培養(yǎng)過程中，由于細胞生活環(huán)境的變化，染色體容易發(fā)生缺失、重組或斷裂，因此染色體形態(tài)觀察和數(shù)目統(tǒng)計是確定細胞建系是否成功的關鍵［17］。正常豬的染色體數(shù)目為2n=38，本試驗通過染色體制片后獲得分裂相良好的染色體玻片，在顯微鏡下觀察染色體的形態(tài)并對染色體進行計數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計，染色體的數(shù)目穩(wěn)定在2n=38，染色體數(shù)目正常的比例均在90%以上，達到建立細胞系的要求。

3.3 成纖維細胞的應用 王蓉蓉獲取北山羊肌肉組織成功建立成纖維細胞系的體外培養(yǎng)體系，北山羊為國家一級保護動物，成纖維細胞系的成功建立使得北山羊的遺傳資源從細胞水平上長期保存下來［18］。張明軍利用肝臟特異性啟動子α1人抗胰蛋白酶啟動子構建肝臟特異性表達豬源Cre重組酶表達載體，然后將其轉入小型豬胚胎成纖維細胞，得到肝臟特異性表達Cre重組酶轉基因豬成纖維細胞，為后續(xù)構建肝臟特異性表達Cre重組酶轉基因豬研究奠定了基礎［19］。De Haan等對谷胱甘肽過氧化酶基因敲除的小鼠成纖維細胞系進行建立，為進一步研究活性氧導致衰老的病理生理學研究奠定了基礎［20］。Amir等建立轉hFIX基因羊成纖維細胞系，通過體細胞核移植生產轉基因克隆羊，作為乳腺生物反應器生產凝血因子IX［21］。成纖維細胞已被廣泛用于生產體細胞克隆、轉基因誘導多功能性干細胞以及生理病理學研究。成纖維細胞系建立可以使優(yōu)良的遺傳資源從細胞水平上長期保存下來，為在細胞水平上研究轉基因豬的生理機理以及構建基因組文庫，基因遺傳多樣性研究等方面提供理想的生物學材料。

4 結論

本研究采用組織塊貼壁法，通過純化培養(yǎng)、細胞形態(tài)觀察、免疫組化、染色體分析、微生物污染檢測等方法確定成功建立轉pGH基因豬和非轉基因豬成纖維細胞系，經(jīng)凍融試驗檢測細胞系能夠穩(wěn)定傳代和保存，為轉基因豬的后續(xù)研究提供了基礎。

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The Establishment and Identification of Fibroblast Cell Lines with pGH Transgenic Pigs andnon-transgenic pigs

CUI Xiao-rong，LI Xiao-ling，YU Guang-hui，WEI Cheng-xiao，ZHAO Ling-ling，GONG Jian-fei，ZHANG Ting-rong，SUN Jin-hai
(College of Animal Science and Technology，Qingdao Agriculture University，Qingdao 266109，China)

In this study，we adopted the method ofexplants cell culture for the newborn piglets’ears to the primary culture，isolated pig fibroblasts cells from pGH transgenic pigs and non-transgenic pigs．Morphological observation，determination of viability before cryopreservation and after recovery，dynamic growth analysis，vimentin immunohistochemistry，chromosome counts and microbial contamination detection were all done to study the biological characteristics of the cell lines．The results showed that the fibroblasts were cultured and isolated successfully by trypsin digestion and differential centrifugation．The viability of seven cell lines was above 92%and 89%before cryopreservation and after recovery，respectively．The growth curves were sigmoid，and experienced the incubation period，exponential growth period and platform period．The vimentin immunohistochemistry was positive．The chromosome counting showed that the number of chromosomes was stable．The microbial contamination detection was negative．The results indicate that the fibroblast cell lines of pGH transgenic pigs and non－transgenic pigs are successfully established．

pGH gene;transgenic pigs;fibroblast cell line;cell culture;biological characteristics

s:SUN Jin-hai;ZHANG Ting-rong

S828

A

0529-6005(2017)06-0003-05

2017-02-09

國家轉基因生物新品種培育科技重大專項(2016ZX08006－003);山東省現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系生豬創(chuàng)新團隊建設項目(SDAIT－08－13)

崔小榮(1990-)，男，碩士生，主要從事分子遺傳與動物育種研究，E-mail:18765908861@163．com

孫金海，E-mail:sunjinhai00528@sina．com;張廷榮，E-mail:zhangtr2006@126．com