魏 杰，王 洪，于鵬麗，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

DB11/T828.3-2011中12號染色體標(biāo)記篩選及適用性評價研究

魏 杰，王 洪，于鵬麗，岳秉飛*

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

目的 對北京小型豬遺傳質(zhì)量控制地方標(biāo)準(zhǔn)DB11/T828.3-2011中空缺的12號染色體標(biāo)記進(jìn)行篩選，并通過比較不同標(biāo)記對同種群的遺傳評價對地標(biāo)的適用性進(jìn)行分析。方法 結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，選取12號染色體上的4對微衛(wèi)星標(biāo)記，利用2個中國農(nóng)大小型豬群體進(jìn)行篩選；選取高度多態(tài)的12號染色體標(biāo)記合并標(biāo)準(zhǔn)方法的18對染色體標(biāo)記，形成全染色體法，通過不同方法對同批次群體的遺傳質(zhì)量評價進(jìn)行比較分析。所得結(jié)果均使用Popgen32軟件處理分析。結(jié)果 篩選到的4對12號染色體標(biāo)記PIC值均大于0.5，為高度多態(tài)；現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)在染色體覆蓋率、擴(kuò)增穩(wěn)定性、結(jié)果評價三項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果分別為94.7%、96.0%、農(nóng)大I系不合格而農(nóng)大III系合格，增加12號染色體后評價的三項(xiàng)指標(biāo)的結(jié)果分別為100%、96.6%和兩群體均合格。結(jié)論 本研究篩選的4對12號染色體標(biāo)記具有高度多態(tài)性，為完善DB11/T828.3-2011提供數(shù)據(jù)支撐。

DB11/T828.3-2011；12號染色體；多態(tài)性；適用性；遺傳質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)用小型豬由于體型小、易飼育、生理解剖與人高度相似等特性，其研發(fā)與應(yīng)用已受到廣泛關(guān)注[1-3]。特別是隨著器官移植與人源化研究的不斷深入，小型豬資源更成為了人類健康的希望之光[4,5]。

我國小型豬資源豐富。長期以來，人們對不同品種品系小型豬在種資資源、遺傳結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性及應(yīng)用進(jìn)行了相關(guān)研究，但對資源的標(biāo)準(zhǔn)化尤其是遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究尚在起步[6]。實(shí)驗(yàn)動物的遺傳質(zhì)量對醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究的準(zhǔn)確性、重復(fù)性及科學(xué)性有著至關(guān)重要的影響，而遺傳質(zhì)量監(jiān)測又是評價和保證動物資源質(zhì)量的必要措施?；诖耍本┑貐^(qū)在2011年出臺了實(shí)驗(yàn)用小型豬遺傳質(zhì)量控制地方標(biāo)準(zhǔn)(北京市地方標(biāo)準(zhǔn)公告2011年標(biāo)字第7號，總第109號)，并在2012年正式實(shí)施[7]。

在標(biāo)準(zhǔn)的研究過程中，研究樣本來自廣西巴馬小型豬、貴州小型豬、藏香豬和長春“軍牧1號”；而作為北京地標(biāo)，對于北京地區(qū)的小型豬遺傳質(zhì)量監(jiān)測是否適用尚有待研究[6,8]。2013年，中國食品藥品檢定研究院應(yīng)用DB11/T828.3-2011號標(biāo)準(zhǔn)對房山小型豬群體進(jìn)行檢測時，發(fā)現(xiàn)了該地標(biāo)中存在著12號染色體標(biāo)記缺失等問題，而因此導(dǎo)致的對遺傳概貌反映不夠全面，是否影響遺傳質(zhì)量評價也未可知[8]。為此，本研究利用北京地區(qū)兩個農(nóng)大小型豬群體進(jìn)行12號染色體微衛(wèi)星標(biāo)記篩選，并通過篩選到的高度多態(tài)位點(diǎn)與原標(biāo)準(zhǔn)中的25對微衛(wèi)星標(biāo)記形成全染色體標(biāo)記法，比較其與標(biāo)準(zhǔn)方法在質(zhì)量評價中的應(yīng)用，為地標(biāo)的不斷完善和小型豬的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程提供技術(shù)資料。

1 材料和方法

1.1 樣本

按照DB11/T828.3-2011的要求，取封閉繁育4代以上、不同窩別的農(nóng)大I系和農(nóng)大III系小型豬樣本，每品系15頭，雌7頭雄8頭。樣品由北京市琉璃河科興實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖中心提供【SCXK(京)2012-0005】。

1.2 樣本DNA的制備[8]

用改良酚-氯仿抽提法從血樣中提取基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用紫外分光光度計(jì)測定DNA的濃度及純度，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物[7]

本研究所用25對引物均按照北京市地方標(biāo)準(zhǔn)對封閉群實(shí)驗(yàn)用小型豬的規(guī)定，序列詳見DB11/T828.3-2011附錄B。12號染色體的4對引物標(biāo)記S1060、SW168、SW467、SW2494，序列詳見美國農(nóng)業(yè)部官網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(http://www.marc.usda.gov/genome)。所有引物均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 主要試劑儀器、PCR擴(kuò)增程序及結(jié)果處理均同已發(fā)文獻(xiàn)[9]

1.5 結(jié)果評價

12號染色體標(biāo)記篩選中，當(dāng)標(biāo)記的平均多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)大于0.25，即中度多態(tài)，可作為備選標(biāo)記與原標(biāo)準(zhǔn)方法形成新的全染色體標(biāo)記檢測法。否則需要重新篩選，直到篩選到中度多態(tài)以上的標(biāo)記。

DB11/T828.3-2011中的25對微衛(wèi)星標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)方法。利用標(biāo)準(zhǔn)方法和全染色體標(biāo)記法共同評價相同群體，通過兩者在遺傳質(zhì)量評價中的差異比較分析標(biāo)準(zhǔn)方法的適用性。其中，對群體遺傳質(zhì)量的評價，仍參照平均雜合度及卡方檢驗(yàn)指標(biāo)[7]。即當(dāng)平均雜合度在0.5 ～ 0.7，且期望雜合度與觀測雜合度經(jīng)卡方檢驗(yàn)無明顯差異，可判定為為合格的封閉群實(shí)驗(yàn)用小型豬群體，否則判為不合格。

2 結(jié)果

2.1 12號染色體微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選

利用農(nóng)大I系、農(nóng)大III系小型豬群體的DNA進(jìn)行標(biāo)記篩選，通過等位基因頻率計(jì)算PIC數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，4對標(biāo)記均有PIC>0.25。結(jié)果詳見表1。

2.2 全染色體標(biāo)記法的建立及對兩群體小型豬的遺傳質(zhì)量評價

新篩選到的4對12號染色體標(biāo)記均為高度多態(tài)位點(diǎn)，合并地標(biāo)中其余18對染色體的25對標(biāo)記，共29對微衛(wèi)星標(biāo)記形成覆蓋19對染色體的全染色體法。利用新建方法對農(nóng)大I系、農(nóng)大III系小型豬群體進(jìn)行測定，兩群體的平均雜合度分別為0.6062和0.6821，卡方檢驗(yàn)P值分別為0.1390和0.7339(均大于0.05)。即通過全染色體標(biāo)記法檢測，兩群體均為合格的封閉群小型豬群體。具體遺傳參數(shù)詳見表2、表3。

表1 12號染色體微衛(wèi)星位點(diǎn)PIC數(shù)據(jù)表Tab.1 Polymorphism information content (PIC) of microsatellite loci in chromosome 12

表2 農(nóng)大I系小型豬群體遺傳參數(shù)表(全染色體法)Tab.2 Genetic parameters of China Agricultural University miniature pig I (whole chromosome method)

表3 農(nóng)大III系小型豬群體遺傳參數(shù)表(全染色體法)Tab.3 Genetic parameters of the China Agricultural University miniature pig III (whole chromosome method)

表4 標(biāo)準(zhǔn)方法與全染色體法的比較Tab.4 Comparison of the standard method with whole chromosome method

2.3 標(biāo)準(zhǔn)方法對相同兩群體的遺傳質(zhì)量評價及與全染色體法的比較[9]

利用標(biāo)準(zhǔn)方法的25對標(biāo)記對農(nóng)大I系、農(nóng)大III系相同群體樣本進(jìn)行測定結(jié)果已另文發(fā)表。測定結(jié)果為：兩群體的平均雜合度分別為0.6759和0.6779，卡方檢驗(yàn)P值分別為0.0022和0.7054。農(nóng)大I系小型豬群體的觀測雜合度與期望雜合度存在差異(P< 0.05)即通過標(biāo)準(zhǔn)法檢測，農(nóng)大III系小型豬群體可判定為合格的封閉群小型豬群體，農(nóng)大I系不能判定為合格的封閉群小型豬群體。對兩種方法進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)兩者在染色體覆蓋率、擴(kuò)增穩(wěn)定性及結(jié)果評價上均存在差異，結(jié)果詳見表4。

3 討論與建議

3.1 篩選標(biāo)記的多態(tài)性

多態(tài)信息含量(PIC)是用以反應(yīng)基因座位多態(tài)性的指標(biāo)[10]，用來評價標(biāo)記位點(diǎn)是否可提供足夠的遺傳信息。當(dāng)PIC>0.25時，為中度多態(tài)，可提供較為合理的遺傳信息；PIC>0.5時，可提供高度豐富的遺傳信息；而PIC<0.25時，則提供的遺傳信息較差。因此在標(biāo)記的篩選中，需要通過PIC值選擇中高度多態(tài)性標(biāo)記，從而提供足夠的遺傳信息。

本研究中，從數(shù)據(jù)庫中選擇的4對位點(diǎn)標(biāo)記在國外豬種的研究中表現(xiàn)為中高度多態(tài)，而對于北京地區(qū)的小型豬是否適用需要通過研究驗(yàn)證。為降低標(biāo)記在地區(qū)間存在差異的影響與可能，初步選擇4對標(biāo)記進(jìn)行研究。結(jié)果4對標(biāo)記在農(nóng)大小型豬兩個群體中均表現(xiàn)為高度多態(tài)，可以用于遺傳質(zhì)量評價。

3.2 對DB11/T828.3-2011技術(shù)方法的適用性評價與建議

DB11/T828.3-2011是國內(nèi)第一部有具體技術(shù)方法的小型豬遺傳質(zhì)量控制地方標(biāo)準(zhǔn)；同時作為北京地區(qū)第一批實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)，彌補(bǔ)了因無國家標(biāo)準(zhǔn)而無法在北京地區(qū)開展實(shí)驗(yàn)用小型豬行政許可管理的空白。

地標(biāo)中的25對微衛(wèi)星標(biāo)記分布于19對染色體中的18對上(缺少12號染色體標(biāo)記)，基礎(chǔ)的染色體覆蓋率為94.74%(18/19)，反映的遺傳概貌不夠全面。因此在質(zhì)量評價中就可能存在不夠全面客觀的情況。通過研究也發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)方法和全染色體法在質(zhì)量評價上出現(xiàn)了差異，標(biāo)準(zhǔn)修訂時應(yīng)考慮增加12號染色體標(biāo)記。在擴(kuò)增穩(wěn)定性上，兩種方法均存在15號染色體標(biāo)記未能穩(wěn)定擴(kuò)增，應(yīng)當(dāng)通過進(jìn)一步研究確定是否為品系特征，加強(qiáng)位點(diǎn)標(biāo)記方法的研究，進(jìn)一步完善標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)方法，使其反映的結(jié)果更為科學(xué)，從而實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)對資源應(yīng)用的保障作用。

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Screening of the makers of chromosome 12 and evaluate the applicability ofBeijing local standard DB11/T828.3-2011

WEI Jie， WANG Hong， YU Peng-li， YUE Bing-fei*

(National Institutes for Food And Drug Control, Beijing 100050, China)

Objective To screen the markers of chromosome 12, which is vacant in the Beijing local standard DB11/T828.3-2011 for genetic quality control of miniature pigs in Beijing, and to study the applicability of the local standard by comparison of two different methods for evaluation of the genetic quality of the same population. Methods According to the literature, we selected four pairs of microsatellite markers of chromosome 12 and studied the polymorphism through monitoring the genetic quality of two populations of China Agricultural University miniature pigs. We screened the highly polymorphic markers of chromosome 12, combined them with the microsatellite primers of the standard 18 pairs of chromosomes to establish the whole chromosome method. We compared and analyzed the applicability of the local standard DB11/T828.3-2011 through monitoring the genetic quality of the same population of miniature pigs with different method. The data were processed and analyzed using software Popgen32. Results All the screened four pairs of microsatellite markers of chromosome 12 were highly polymorphic (PIC>0.5). The local standard showed a chromosome coverage of 94.7%, stability of amplification of 96.0%, and certified that the China Agricultural University miniature pig III was qualified, while the China Agricultural University miniature pig I was not qualified. When the markers of chromosome 12 were added, the whole chromosome method showed result of 100% chromosome coverage and 96.6% amplification stability, both of the two populations of pigs were certified as qualified. Conclusions The four screened markers of chromosome 12 are all highly polymorphic, and provide a support for supplement of the local standard DB11/T828.3-2011.

Local standard DB11/T828.3-2011; Chromosome 12; Polymorphism; Applicability; Genetic quality

中國食品藥品檢定研究院中青年基金(2014C4)。

魏杰(1982-)，女，助理研究員，碩士。研究方向：免疫遺傳檢測。Email: jane3040320@163.com

岳秉飛(1960-)，男，研究員，博士。研究方向：動物遺傳學(xué)。Email: y6784@126.com

研究報(bào)告

R-33

A

1671-7856(2017) 07-0059-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.07.011

2016-12-30