余燕?歐國(guó)燈?杜耀民?梁蔚陽(yáng)?鄧鋒

[摘要] 目的 通過(guò)對(duì)近年來(lái)華南地區(qū)早期自然流產(chǎn)孕婦的血清樣品的B19和Parv4感染狀況調(diào)查，分析華南地區(qū)人細(xì)小病毒感染與早期自然流產(chǎn)的關(guān)系。方法 選取門診確診的379例早期自然流產(chǎn)患者，采用q-PCR方法檢測(cè)B19和Parv4的感染狀況及病毒載量，以同期348例人工流產(chǎn)孕婦進(jìn)行對(duì)比，將相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 華南地區(qū)孕婦人群中B19感染率略高于已有調(diào)查地區(qū)，妊娠期前后B19和Parv4感染與妊娠不良結(jié)局有密切關(guān)系。結(jié)論P(yáng)arv4常與B19合并感染，B19指標(biāo)在很大程度上同時(shí)可以反映Parv4的風(fēng)險(xiǎn)。

[關(guān)鍵詞] 華南地區(qū)；細(xì)小病毒；q-PCR；早期流產(chǎn)

[中圖分類號(hào)] R714.21 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2017）10-07-04

Relationship between human parvovirus B19 and Parv4 infection and spontaneous abortion in Southern China

YU Yan1 OU Guodeng1 DU Yaomin2 LIANG Weiyang1 DENG Feng1

1.Guangdong Institute for Drug Control，Guangzhou 510180，China；2.Guangdong General Hospital，Guangzhou 510180，China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between infection and early spontaneous abortion in Southern China，to investigate the serum B19 and Parv4 infection in pregnant women with early spontaneous abortion in recent years. Methods 379 cases of patients with early abortion diagnosed in clinic were selected，The q-PCR method was used to detect infection and virus B19 and Parv4 load.At the same period， 348 cases of artificial abortion of pregnant women were selected as control.The relevant data was statistically analyzed. Results The prevalence of B19 infection in pregnant women in Southern China area is slightly higher than that in the investigated areas. Conclusion The B19 and Parv4 infection before and after pregnancy are closely related to the adverse pregnancy outcomes.Parv4 often associates with B19 infection. B19 indicators can largely reflect the risk of Parv4.

[Key words] Southern China；Parvovirus；q-PCR；Early abortion

以B19和Parv4為代表的人細(xì)小病毒感染與危害問(wèn)題已引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥和醫(yī)療行業(yè)高度關(guān)注。B19導(dǎo)致的疾病與很多因素有關(guān)，包括B19病毒的直接侵襲、機(jī)體免疫介導(dǎo)反應(yīng)、個(gè)體遺傳差異（如機(jī)體HLA、P血型等問(wèn)題）以及機(jī)體的免疫狀態(tài)等[1-4]。此外也有研究表明，B19的感染與肝腎、神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和多種血液疾病有一定關(guān)系[5-6]。據(jù)筆者前期研究的統(tǒng)計(jì)，約4%～ 5%的血液制品中可檢測(cè)出PARV4或其變種PARV5，在HCV、HBV感染者甚至部分健康獻(xiàn)血者血漿中（<2%）也可檢出。Parv4雖未證實(shí)存在直接致病性，但其潛在風(fēng)險(xiǎn)和間接危害不容忽視[7-11]。已有研究報(bào)道，B19可能與妊娠早期的自然流產(chǎn)有關(guān)[12-15]。

此外，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)B19和Parv4病毒的標(biāo)準(zhǔn)

檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)兩種病毒最常用的方法主要有核酸檢測(cè)法和血清學(xué)檢測(cè)法[16-22]。前者主要包括斑點(diǎn)雜交、原位雜交及PCR等方法；后者主要有通過(guò)檢測(cè)IgG和IgM的構(gòu)象表位抗體的抗體檢測(cè)法，以及通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)及真核表達(dá)系統(tǒng)來(lái)制備的、以檢測(cè)病毒衣殼蛋白VP1和VP2的抗原檢測(cè)法，筆者在前期研究中已建立準(zhǔn)確度較高、快速靈敏的q-PCR方法[23]。本文試圖通過(guò)對(duì)多例妊娠早期自然流產(chǎn)與人工流產(chǎn)的孕婦血清中細(xì)小病毒感染率的差異，以探究細(xì)小病毒B19和Parv4與早期自然流產(chǎn)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年6月～2016年10月于廣東省人民醫(yī)院（含東川路門診和惠福西路門診）經(jīng)門診及住院檢查收集的379例不明原因流產(chǎn)或死胎的孕婦血清作為研究組，平均年齡為（28.1±4.2）歲，流

產(chǎn)時(shí)妊娠天數(shù)為23 ～ 71d，考慮到對(duì)照組的可比性，同時(shí)在上述門診以同期同地隨機(jī)選取人工流產(chǎn)的348例健康孕婦的血清為對(duì)照組，平均年齡為（24.2±2.5）歲，流產(chǎn)妊娠天數(shù)為40～77d。對(duì)照組和研究組在年齡和流產(chǎn)次數(shù)等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，且所有病例均通過(guò)診斷排除是由于母體免疫疾病、內(nèi)分泌失調(diào)、遺傳基因缺陷、子宮或生殖道畸形、宮腔黏粘以及不良外界環(huán)境影響、弓形蟲、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒感染等多種原因所造成的流產(chǎn)。endprint

1.2 樣品DNA的提取

無(wú)菌留取上述研究對(duì)象靜脈血5mL，加入細(xì)胞裂解液后，混勻，離心2000g 5min，離心后分離血清，按試劑盒說(shuō)明操作，提取的病毒DNA-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 材料及方法

1.3.1 儀器 Ultrospec2100核酸蛋白快速測(cè)定儀（購(gòu)自美國(guó)GE公司）；Gene Amp PCR System 9700核酸擴(kuò)增儀（購(gòu)自美國(guó)AB公司）；Bio-rad DNA 凝膠電泳儀（購(gòu)自美國(guó) Bio-rad公司）；Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)（購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司）；Applied Biosystems 7300 Real-time PCR system（購(gòu)自美國(guó)AB公司）；5804R低溫冷凍離心機(jī)（購(gòu)自美國(guó)Eppendorf公司）。

1.3.2 試劑 質(zhì)粒提取試劑盒（購(gòu)自北京天根生物有限公司 批號(hào)：VT303-01）；血液病毒DNA/RNA 小量提取試劑盒（購(gòu)自上海妙駿生物有限公司 批號(hào)：GD2311-01）。Premix Taq 擴(kuò)增反應(yīng)液（ 購(gòu)自 Takara 公司 批號(hào)：3027A） ；血樣中B19和Parv4的檢測(cè)熒光定量試劑盒（自主研發(fā)）。該自主研發(fā)試劑盒所選取的B19、Parv4的引物及探針由上海生物工程有限公司合成。見表1。

1.3.3 熒光定量PCR檢測(cè) 將提取的血清DNA分別進(jìn)行B19，parv4熒光定量檢測(cè)，B19PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×Premix Mix 12.5μL、酶0.25μL、B19.F/R

（10μmol/L）各1μL，B19-p（5μmol/L）1μL、DNA 5 μL、雙蒸水4.25μL，總反應(yīng)體積為25μL；Parv4檢測(cè)方法相同，僅加入引物及探針做對(duì)應(yīng)調(diào)整。反應(yīng)條件：50℃ 30min，然后以95℃ 2min、95℃ 5s、56℃ 50s 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；結(jié)果通過(guò)CT值（CT<35）判別陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采用SPSS 16.0，計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組B19的q-PCR檢測(cè)結(jié)果

在研究組的379例早期/中期流產(chǎn)孕婦中，B19的q-PCR檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性者共75例，占該組比例為19.7%；而對(duì)照組的348例孕婦血清檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性者共12例，占該組比例為3.44%，兩組間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著，P=0.040。研究組的B19陽(yáng)性統(tǒng)計(jì)概率為對(duì)照組的6.35倍（95%CI 1.2～17.83）。研究組75例陽(yáng)性者中，B19濃度范圍為1.9×104～3.7×106copies/mL，對(duì)照組陽(yáng)性者中濃度范圍為1.2×103～1.8×105copies/mL，研究組陽(yáng)性者樣品中病毒載量高于研究組約1個(gè)數(shù)量級(jí)。

2.2 兩組Parv4的q-PCR檢測(cè)結(jié)果

在研究組的379例早期自然流產(chǎn)孕婦中，Parv4的q-PCR檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性者共13例，占該組比例為3.43%；而對(duì)照組的348例孕婦血清檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性者共3例，占該組比例為0.86%，兩組間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著，P=0.042。研究組的Parv4陽(yáng)性統(tǒng)計(jì)概率為對(duì)照組的5.34倍（95%CI 1.1～15.83）。

研究組13例陽(yáng)性者中，Parv4濃度范圍為3.1×103～2.7×105copies/mL，對(duì)照組陽(yáng)性者中濃度范圍為1.2×103～1.8×104 copies/mL，研究組陽(yáng)性者樣品中病毒載量顯著高于研究組。

值得注意的是，在早期自然流產(chǎn)孕婦中Parv4檢測(cè)呈陽(yáng)性者的13例中，有12例B19的檢測(cè)也呈陽(yáng)性，而在對(duì)照組的Parv4檢測(cè)呈陽(yáng)性者的3例中，也有2例B19的檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。

3 討論

HPV B19是細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬中一大類目前已知的可使人類致病的、結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的無(wú)包膜線狀單鏈DNA 病毒，感染B19后臨床表現(xiàn)可為無(wú)明顯癥狀、傳染性紅斑及頭痛發(fā)燒、慢性貧血及短暫性再生障礙危象等[22] ，此外HPV B19也會(huì)導(dǎo)致宮內(nèi)感染引起一些不良妊娠結(jié)局如孕婦非免疫性流產(chǎn)及胎兒水腫等；Parv4是另一種稍晚發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)小病毒，其危害尚未明確，多數(shù)認(rèn)為與B19具有一定相似性，兩者均可通過(guò)呼吸道、血液制品、輸血等方式傳播，兒童和孕婦為主要易感人群[24]。據(jù)報(bào)道地方性流行時(shí)孕婦發(fā)病率可達(dá)1%～2%，而幼兒教師、兒童等發(fā)病率更是高達(dá)20%～30%[25]。筆者在前期的無(wú)償獻(xiàn)血樣品調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)，華南地區(qū)的健康獻(xiàn)血者中B19攜帶率已高達(dá)3-7%，Parv4的攜帶率統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)較少，但一般認(rèn)為遠(yuǎn)低于B19[23]。

在1984年有研究人員首次報(bào)道B19可通過(guò)胎盤垂直傳播[26]，歐美研究報(bào)道，在B19病毒感染的流行期，其中3%～8%的孕婦存在急性感染，胎盤垂直傳播率為33%～51%，有5%～16%的感染孕婦出現(xiàn)了嚴(yán)重胎兒發(fā)病和死亡，因?yàn)锽19病毒對(duì)人骨髓和脾臟中的祖代紅細(xì)胞具有特殊嗜性，妊娠中期胎兒紅細(xì)胞快速增長(zhǎng)且壽命較短，不能形成有效的免疫反應(yīng)來(lái)對(duì)抗感染，故胎兒感染B19后會(huì)使胎兒造血系統(tǒng)的紅系造血細(xì)胞受到破壞，胎兒發(fā)生造血危象、嚴(yán)重貧血、水腫及神經(jīng)系統(tǒng)畸形等，故而引起胎兒水腫和死胎[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，感染B19的孕婦患早期流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)性是未感染組的3.76倍[28]。另有研究數(shù)據(jù)表明，B19病毒是我國(guó)孕婦非免疫性流產(chǎn)等疾病的重要病因之一，并可發(fā)生于妊娠期任何時(shí)期，尤以旱中期妊娠多見[29]。對(duì)某地186例B19感染孕婦調(diào)查結(jié)果表明，胎兒受染率為33%，胎兒死亡率為9%[30]。有研究發(fā)現(xiàn)患者血清中B19IgM陽(yáng)性率為23.08%，明顯高于對(duì)照組的6.67%，表明妊娠早期自然流產(chǎn)與近期B19存在密切聯(lián)系[31]。endprint

從本研究的數(shù)據(jù)來(lái)看，華南地區(qū)孕婦人群中B19感染率略高于國(guó)內(nèi)其它已有調(diào)查地區(qū)，可能原因?yàn)楸狙芯克捎酶腥緳z測(cè)方法的靈敏性有關(guān)。多數(shù)文獻(xiàn)均只研究妊娠期前后B19感染與妊娠不良結(jié)局的密切關(guān)系。而本研究發(fā)現(xiàn)不僅B19且Parv4感染均可造成胎兒畸形、胎兒水腫、死胎等，均是妊娠早期自然流產(chǎn)的原因之一。因此預(yù)防B19和Parv4感染以及孕前或孕早期B19和Parv4的篩查對(duì)預(yù)防不良妊娠結(jié)局的發(fā)生和優(yōu)生優(yōu)育有重要意義。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)，Parv4常與B19合并感染，B19指標(biāo)在很大程度上同時(shí)可以反映Parv4的風(fēng)險(xiǎn)。因此血清中的B19可能預(yù)示著存在包括Parv4在內(nèi)的其它人細(xì)小病毒的感染風(fēng)險(xiǎn)。

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（收稿日期：2017-04-06）endprint