陸金華鐘亞珍王玨林勝友

1.杭州市第一人民醫(yī)院集團(tuán)杭州市腫瘤醫(yī)院 杭州 310002 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院

龜鹿二仙膠含藥血清干預(yù)大鼠T細(xì)胞化療后自噬的初步研究

陸金華1鐘亞珍1王玨2林勝友1

1.杭州市第一人民醫(yī)院集團(tuán)杭州市腫瘤醫(yī)院 杭州 310002 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院

[目的]初步研究龜鹿二仙膠含藥血清干預(yù)大鼠T細(xì)胞化療后自噬的機制。[方法]將大鼠T細(xì)胞分為空白對照組、順鉑組、中藥血清組、順鉑+中藥血清組，干預(yù)12h、24h后使用RT-PCR、Western Blot技術(shù)檢測各組細(xì)胞ATG5、ClassIII PI3K、ClassI PI3K、mTOR mRNA及蛋白的表達(dá)情況。[結(jié)果]干預(yù)12h后，RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對照組比較，順鉑組ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。中藥血清組ATG5、ClassⅢ PI3K、mTOR mRNA表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與順鉑組比較，順鉑+中藥血清組ATG5、ClassⅢPI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA表達(dá)均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。Western Blot結(jié)果顯示，順鉑組mTOR蛋白表達(dá)較空白對照組上升（P＜0.05），其余組別各蛋白變化不明顯（P＞0.05）。干預(yù) 24h 后，RT-PCR 結(jié)果顯示，與空白對照組比較，順鉑組 ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；中藥血清組ATG5 mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，ClassⅢ PI3K、mTOR mRNA表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與順鉑組比較，順鉑+中藥血清組ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。Western Blot結(jié)果顯示，順鉑+中藥血清組 ATG5、ClassⅢ PI3K 蛋白表達(dá)較順鉑組下降（P＜0.05），ClassⅠPI3K、mTOR 蛋白變化不明顯（P＞0.05）。[結(jié)論]龜鹿二仙膠含藥血清對大鼠T細(xì)胞化療后自噬蛋白ATG5、ClassⅢPI3K、ClassⅠPI3K、mTOR的表達(dá)具有一定的調(diào)節(jié)作用。

龜鹿二仙膠；T 細(xì)胞；ATG5；ClassⅢ PI3K；ClassⅠPI3K；mTOR；自噬；化療

T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是腫瘤免疫的重要方式之一[1]，化療后T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能受損是影響腫瘤患者預(yù)后的重要原因之一，故保護(hù)化療后患者的T細(xì)胞數(shù)量及功能是腫瘤治療和改善預(yù)后研究的重要任務(wù)之一。項目團(tuán)隊既往研究發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膠能抑制化療后小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的凋亡[2]，國內(nèi)外研究顯示，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞的自噬過程存在密不可分的關(guān)系[3]，故本文著重研究龜鹿二仙膠含藥血清影響化療后大鼠T淋巴細(xì)胞自噬的機制。

1 材料與方法

1.1 藥品 龜鹿二仙膠（組方：龜板膠6g、鹿角膠9g、枸杞子15g、生曬參9g）的中藥飲片由杭州市腫瘤醫(yī)院中藥房采購，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑室進(jìn)行質(zhì)控并制備藥液。根據(jù)“人和動物之間按體表面積折算的等效劑量比值表”計算等效劑量（以生藥量計算，最終濃度為1g·mL-1），4℃保存。順鉑粉劑（杭州市腫瘤醫(yī)院藥房，批號：1WA2A160100）。

1.2 主要試劑 1640培養(yǎng)基（GIBCO，批號：8116222）；大鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液（TBD，批號：LTS1083P）；Anti-ClassI PI3K 抗體（SANTA，批號：sc7189）；Anti-ClassIII PI3K 抗體（SANTA，批號：sc134986）；Anti-ATG5 抗體（SANTA，批號：sc33210）；Anti-mTOR 抗體（SANTA，批號：sc8319）；RNA提取試劑盒（上海捷瑞生物工程公司，批號：GK3016）；PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)（TaKaRa公司，批號：RR036A）；SuperReal PreMix Color(SYBR Green)（北京天根生化科技公司，批號：FP215）。

1.3 主要儀器 3111型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo）；微量加樣器（美國Thermo）；H1650R臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；Spectra-MaxPlus 384酶標(biāo)儀（美國 Molecular Devices）；Mini-Proten Tetra Syste電泳系統(tǒng)（美國Bio-RAD）；ChemiDoc XRS+System凝膠成像儀（美國Bio-RAD）；移液器（德國Eppendorf）；TD5A臺式低速離心機（湖南凱達(dá)實業(yè)公司）；TU-10恒溫金屬?。ㄉ虾Ｒ缓銉x器公司）；SMA4000微光分光光度計（美國 Merinton）；CFX Connect Real-Time System(96孔)定量PCR儀（美國BIO-RAD）。

1.4 實驗動物 SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2012-0002，動物質(zhì)量合格證號：0234779。動物飼養(yǎng)在杭州赫貝科技有限公司的實驗動物房，使用許可證號：SYXK(浙)2015-0008。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度范圍20～25℃，相對濕度范圍40%～70%。

1.5 含藥血清的制備 SD大鼠12只，龜鹿二仙膠藥液灌胃，1次/d，每次2mL，連續(xù)3d，末次灌胃1h后進(jìn)行腹主動脈取血，離心后收集血清，水浴滅活，過濾，-20℃保存。

1.6 大鼠T淋巴細(xì)胞懸液的制備 SD大鼠2只，無菌條件下取脾臟，剪至5×5mm小塊，載玻片研碎，制成脾臟細(xì)胞懸液，200目過篩，收集單細(xì)胞懸液，320g離心5min，PBS重懸，滴加到等體積的淋巴細(xì)胞分離液中，510g水平離心20min，收取淋巴細(xì)胞層，細(xì)胞洗滌液清洗（5倍體積），320g離心5min，收集淋巴細(xì)胞沉淀，10%FBS 1640培養(yǎng)基重懸，即為T淋巴細(xì)胞懸液。

1.7 分組及細(xì)胞給藥處理 取T淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)密度至1×107/mL，以每孔100μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分為空白對照組（10%FBS1640培養(yǎng)基）、中藥血清組（4%大鼠正常血清+6%含藥血清1640培養(yǎng)基）、順鉑組（40μmoL順鉑+10%FBS1640培養(yǎng)基）、順鉑+中藥血清組（40μmoL順鉑+4%大鼠正常血清+6%含藥血清1640培養(yǎng)基）。將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h后，棄上清液，加入100μL對應(yīng)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別選取12h、24h兩個時間點進(jìn)行檢測。

1.8 RT-PCR檢測自噬相關(guān)蛋白mRNA表達(dá) 提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)定GAPDH為內(nèi)參，RT-PCR 測定ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA的表達(dá)。ATG5引物序列，正向：5’-TGCTCACTGGATGGAACCAC-3’，反向：5’-GCCTGTCAGCGAGGTTTACT-3’；ClassⅢPI3K引物序列，正向：5’-GCCCCATTTCATCCTTGTG-3’，反向：5’-GGTTGTTGTTGCCCCAGAC-3’；ClassⅠPI3K 引物序列，正向：5’-AGAGCCACAGGTGAAAATACGG-3’，反向 ：5’-CCAGATTTTCTTTCCGCAACAG-3’；mTOR引物序列，正向：5’-TTGCCAACTACCTTCGGAACC-3’，反向：5’-TCACGGAGAACGAGGACAGC-3’。GAPDH 引物序列，正向：5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’，反向：5’-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3’。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 15min，95℃變性 10s，59℃退火 30s，70℃延伸 40s，40 個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后，記錄 65～95℃范圍內(nèi)的熔解曲線。采用2－△△CT值分析結(jié)果。

1.9 Western Blot檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 根據(jù)樣本細(xì)胞量加入100μL IP裂解液，重懸搖晃離心后提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后按每泳道30μg進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗滌，加入目標(biāo)蛋白一抗、洗滌、加入二抗，最后用ECL化學(xué)發(fā)光檢測法進(jìn)行顯影。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行正態(tài)分布檢驗和方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析比較組間的顯著性差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干預(yù)12h后T細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)情況 與空白對照組比較，順鉑組ATG5、ClassⅢPI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA 表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01)；中藥血清組ATG5、ClassⅢ PI3K、mTOR mRNA表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；順鉑+中藥血清組 ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA表達(dá)均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與順鉑組比較，順鉑+中藥血清組ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA 表達(dá)均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

2.2 干預(yù)24h后T細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)情況 與空白對照組比較，順鉑組ATG5、ClassⅢPI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA 表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；中藥血清組ATG5 mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），ClassⅢ PI3K、mTOR mRNA表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；順鉑+中藥血清組ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與順鉑組比較，順鉑+中藥血清組ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表 2。

表1 干預(yù)12h后T細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)情況(±s,n=3)Tab.1 Changes of Autophagy associated Proteins mRNA in T cell after 12h(±s,n=3)

表1 干預(yù)12h后T細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)情況(±s,n=3)Tab.1 Changes of Autophagy associated Proteins mRNA in T cell after 12h(±s,n=3)

注：與空白對照組比較，★★P＜0.01；與順鉑組比較，△△P＜0.01。Note：Compared with blank control group,★★P＜0.01；compared with DDP group,△△P＜0.01.

組別 ATG5 ClassⅢ PI3K ClassⅠPI3K mTOR空白對照組順鉑組中藥血清組順鉑+中藥血清組1.00±0.00 1.76±0.02★★0.74±0.02★★1.26±0.04★★△△1.00±0.00 1.33±0.03★★0.67±0.04★★1.22±0.03★★△△1.00±0.00 3.46±0.01★★0.88±0.02★★3.42±0.01★★△△1.00±0.00 2.75±0.07★★0.91±0.02 2.45±0.11★★△△

2.3 干預(yù)12h后T細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與空白對照組比較，順鉑組mTOR表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05），ATG5、Class Ⅲ PI3K、ClassⅠPI3K表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），中藥血清組ATG5表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢，ClassⅢPI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA表達(dá)稍呈現(xiàn)上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與順鉑組比較，順鉑+中藥血清組 ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR表達(dá)未見明顯下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 1、2。

表2 干預(yù)24h后T細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)情況(±s,n=3)Tab.2 Changes of Autophagy associated Proteins mRNA in Tcell after 24h(±s,n=3)

表2 干預(yù)24h后T細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)情況(±s,n=3)Tab.2 Changes of Autophagy associated Proteins mRNA in Tcell after 24h(±s,n=3)

注：與空白對照組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；與順鉑組比較，△△P＜0.01。Note：Compared with blank control group,★P＜0.05,★★P＜0.01；compared with DDP group,△△P＜0.01.

組別 ATG5 ClassⅢ PI3K ClassⅠPI3K mTOR空白對照組順鉑組中藥血清組順鉑+中藥血清組1.00±0.00 2.75±0.14★★0.85±0.02★★0.95±0.01★★△△1.00±0.00 3.24±0.11★★1.16±0.05★0.61±0.03★★△△1.00±0.00 2.31±0.17★★0.86±0.01 0.71±0.02★★△△1.00±0.00 4.05±0.18★★1.21±0.02★0.87±0.05△△

圖1 干預(yù)12h后各組自噬相關(guān)蛋白條帶圖Fig.1 Bands of autophagy associated proteins in T cell after 12h

圖2 干預(yù)12h后各組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.2 Changes of autophagy associated proteins in T cell after 12h

2.4 干預(yù)24h后T細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與空白對照組比較，順鉑組ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；中藥血清組 ATG5、ClassⅢ PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢，但差異也均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與順鉑組比較，順鉑+中藥血清組ATG5、ClassⅢ PI3K表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 3、4。

圖3 干預(yù)24h后各組自噬相關(guān)蛋白條帶圖Fig.3 Bands of autophagy associated proteins in T cell after 24h

圖4 干預(yù)24h后各組自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.4 Changes of autophagy associated proteins in T cell after 24h

3 討論

多次化療后的腫瘤患者常出現(xiàn)乏力、納差、氣短、畏寒肢冷、腰膝酸軟等癥狀，屬肺、脾、腎三臟虧虛征象。文獻(xiàn)大多提示采用益氣滋陰補陽類中藥進(jìn)行“扶正”治療。本研究選用的龜鹿二仙膠出自明代王三才《醫(yī)便》一書，由鹿角膠、龜板膠、人參、枸杞子四味滋味純厚的藥品組成，是中醫(yī)傳統(tǒng)名方。《古今名醫(yī)方論》云“龜?shù)锰斓刂帤庾詈?，善通任脈”，能滋陰補血潛陽；“鹿得天地之陽氣最全，善通督脈”，能補腎益精?！夺t(yī)方考》云“人參善于固氣，枸杞子善于滋陰”；四藥合用，益精生血、陰陽并補，成為各科治療虛癥的基本方。在現(xiàn)代臨床實踐中，龜鹿二仙膠被廣泛用于衰老、慢性疲勞綜合征、骨質(zhì)疏松癥、老年癡呆、生殖系統(tǒng)異常等多種疾病。本項目團(tuán)隊先前研究證實龜鹿二仙膠可以有效抑制化療后小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞、CD34+造血干/祖細(xì)胞的凋亡，減輕化療后免疫功能受損，促進(jìn)骨髓造血[2]。后開展龜鹿二仙膠巴布劑的臨床研究，在Ⅲ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者化療期間輔助運用龜鹿二仙膠巴布劑，能減輕患者化療后的白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞減少等骨髓抑制狀態(tài)，改善中醫(yī)癥狀積分，從而提高患者的生存質(zhì)量[4-5]。近來，本項目團(tuán)隊對龜鹿二仙膠促進(jìn)骨髓造血及減輕免疫功能受損展開了進(jìn)一步研究。前期研究顯示化療后大鼠T淋巴細(xì)胞活力下降、凋亡增多，細(xì)胞內(nèi)自噬體（Autophagyosome）、自噬溶酶體（Autolysosome）明顯增多，龜鹿二仙膠含藥血清干預(yù)后，大鼠T淋巴細(xì)胞活力增加，凋亡減少，細(xì)胞內(nèi)自噬體、自噬溶酶體數(shù)量減少，提示龜鹿二仙膠能有效抑制化療后大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的凋亡。

普遍認(rèn)為自噬是一種細(xì)胞的防御和應(yīng)激調(diào)控機制，對細(xì)胞在惡劣環(huán)境下的生存具有重要意義。以細(xì)胞漿內(nèi)自噬體、自噬溶酶體的形成為主要特征[6]，大致由五個關(guān)鍵階段構(gòu)成[7]：（1）形成吞噬泡；（2）ATG5-12復(fù)合物形成與ATG16多聚化；（3）LC3形成并插入吞噬泡膜；（4）包繞預(yù)被降解物；（5）自噬體與溶酶體融合。其中ATG5與ATG12形成的復(fù)合物是自噬體形成的必要條件。自噬過程受多條上游信號通路調(diào)控，比較肯定的有[8-10]：Class I PI3K/AKT/mTOR負(fù)調(diào)節(jié)信號途徑；Class III PI3K正調(diào)節(jié)信號途徑。Class I PI3K及mTOR是自噬發(fā)生的上游負(fù)調(diào)節(jié)信號通路中的關(guān)鍵蛋白，表達(dá)上升可能會抑制自噬發(fā)生；Class III PI3K是自噬發(fā)生的上游正調(diào)節(jié)途徑的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)上升可能會促進(jìn)自噬發(fā)生。ATG5是自噬體形成的關(guān)鍵組分蛋白，其表達(dá)上升提示自噬體形成增加。

研究小組選擇自噬過程的關(guān)鍵蛋白及上游分子作為研究對象，研究顯示：干預(yù)12h后，順鉑組ATG5、Class III PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA 表達(dá)較空白對照組上調(diào)（P＜0.01）；順鉑+中藥血清組ATG5、Class III PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA 表達(dá)較順鉑組下降（P＜0.01）。順鉑組mTOR蛋白表達(dá)較空白對照組上升（P＜0.05），其余組別各蛋白變化不明顯（P＞0.05）。干預(yù) 24h后，順鉑組 ATG5、Class III PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA表達(dá)較空白對照組上升（P＜0.01）；順鉑+中藥血清組ATG5、ClassIII PI3K、ClassⅠPI3K、mTOR mRNA 表達(dá)較順鉑組下降（P＜0.01）。ATG5、ClassIII PI3K 蛋白表達(dá)較順鉑組下降（P＜0.05），與mRNA一致，而ClassⅠPI3K、mTOR蛋白變化不明顯。mRNA與蛋白表達(dá)的差異可能與中藥的多靶點性，以及基因表達(dá)翻譯為蛋白的時效差異有關(guān)。結(jié)果顯示順鉑能夠上調(diào)自噬上游負(fù)調(diào)節(jié)通路中關(guān)鍵蛋白ClassⅠPI3K、mTOR的表達(dá)，上調(diào)正調(diào)節(jié)通路蛋白ClassIII PI3K的表達(dá)，上調(diào)自噬體形成關(guān)鍵蛋白ATG5的表達(dá)，提示順鉑對T細(xì)胞自噬過程具有干預(yù)作用，并且對自噬體形成的上游正負(fù)調(diào)節(jié)通路均有促進(jìn)作用。但最終表現(xiàn)為自噬體形成蛋白ATG5的上升，提示順鉑對自噬過程影響以促進(jìn)作用為主。而中藥血清能下調(diào)上述蛋白的表達(dá)，提示中藥血清對順鉑導(dǎo)致的T細(xì)胞自噬具有抑制作用。

綜上所述，龜鹿二仙膠含藥血清對化療后T細(xì)胞自噬過程具有干預(yù)作用，并且可能主要作用于正調(diào)節(jié)通路及自噬體的形成過程。本研究為龜鹿二仙膠對抗化療后免疫抑制的臨床運用提供了理論依據(jù)。

[1] Gfeller D,Bassani-Sternberg M,Schmidt J,et al.Current tools for predicting cancer-specific T cell immunity[J].Oncoimmunology,2016,5(7):e1177691.

[2] 林勝友,沈敏鶴,陳健,等.龜鹿二仙膠抵抗化療小鼠脾T淋巴細(xì)胞凋亡的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2008,28(4):339-342.LIN Shengyou,SHEN Minhe,CHEN Jian,et al.Effect of Guilu Erxianjiao in Suppressing Splenic T-Lymphocyte Apoptosis in Mice Undergoing Chemotherapy[J].ChineseJournal of Integrated Traditional And Western Medicine,2008,28(4):339-342.

[3] Messer JS.The cellular autophagy/apoptosis checkpoint during inflammation[J].Cell Mol Life Sci,2017,74(7):1281-1296.

[4] 王玨,魏澹寧,張衛(wèi)平,等.龜鹿二仙膠巴布劑輔助治療大腸癌患者化療后骨髓抑制的臨床觀察[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2014,34(8):947-951.WANG Jue,WEI Danning,ZHANG Weiping,et al.Adjuvant Function of GuiluErxian Glue Cataplasm in Treating Carcinoma of the Large Intestine Patientswith Myelosuppression after Chemotherapy a Clinical Observation[J].Chinese Journal of Integrated Traditional And Western Medicine,2014,34(8):947-951.

[5] 魏澹寧,林勝友,張衛(wèi)平,等.龜鹿二仙膠巴布劑治療結(jié)直腸癌化療后不良反應(yīng)臨床研究[J].中醫(yī)學(xué)報,2016,31(219):1082-1085.WEI Danning,LIN Shengyou,ZHANG Weiping,et al.Clinical Study on Adverse Reactions of Guiluerxianjiao Cataplasm to Treat with Colorectal Cancer after Chemotherapy[J].Acta Chinese Medicine,2016,31(219):1082-1085.

[6] Chen Y,Yu L.Autophagic lysosome reformation[J].Exp Cell Res,2013,319(2):142-146.

[7] Crowell KT,Soybel DI,Lang CH.Inability to replete white adipose tissue during the recovery phase of sepsis isassociated with increased autophagy,apoptosisand proteasome activity[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Phsiol,2017,312（3）：R388-399.

[8] Yu X,Long YC,Shen HM.Differential regulatory functions of three classes of phosphatidylinositol and phosphoinositide 3-kinases in autophagy[J].Autophagy,2015,11(10):1711-1728.

[9] Jackson MP,Hewitt EW.Cellular proteostasis:degradation of misfolded proteins by lysosomes[J].Essays Biochem,2016,60(2):173-180.

[10] Hawkins PT,Stephens LR.PI3K signalling in inflammation[J].Biochim Biophys Acta,2015,1851(6):882-897.

Study on the Mechanism of Autophagy after Intervention of Guiluerxianjiao Decoction Drug Serum of Rat T Cell

LU Jinhua1,ZHONG Yazhen1,WANG Jue2,et al 1．Hangzhou Cancer Hospital/Hangzhou First People’s Hospital，Zhejiang(310002)，China;2．Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University

[Objective]To investigate the effects of Guiluerxianjiao decoction drug serum on the autophagy associated proteins of T cell(rat).discuss the internal mechansim of Guiluerxianjiao decoction drug serum on autophagy related signaling pathway in T cell after chemotherapy.[Method]The T cells were divided into 4 groups,i.e.,the blank control group,the DDP group,the Guiluerxianjiao decoction drug serum group,the DDP+Guiluerxianjiao decoction drug serum group.The autophagy associated proteins were detected by RT-PCR and Western Blot after 12h and 24h.[Results]After 12h，RT-PCR showed that compared with the blank control group,the expression of ATG5,ClassIII PI3K,ClassI PI3K,mTOR mRNA was increased(P＜0.01)after intervention of Cisplatin;and the expression of ATG5,ClassIII PI3K,mTOR mRNA was decreased(P＜0.01)after intervention of Guiluerxianjiao decoction drug serum.Compared with the DDP group,and the expression of ATG5,ClassIII PI3K,ClassI PI3K and mTOR mRNA was decreased in the DDP+Guiluerxianjiao decoction drug serum group(P＜0.01).Western Blot showed that only the expression of mTOR protein was increased in the DDP group compared with the blank control group(P＜0.05).The proteins in other groups had no significant change(P＞0.05).After 24h，RT-PCR showed that compared with the blank control group,the expression of ATG5,ClassIII PI3K,ClassI PI3K,mTOR mRNA was increased(P＜0.01)after intervention of Cisplatin;and the expression of ATG5 was decreased(P＜0.01)，ClassIII PI3K,mTOR mRNA was increased(P＜0.05)after intervention of Guiluerxianjiao decotion drug serum.Compared with the DDP group,and the expression of ATG5,ClassIII PI3K,ClassI PI3K and mTOR mRNA was decreased in the DDP+Guiluerxianjiao decoction drug serum group(P＜0.01).Western Blot showed that the expression of ATG5 and ClassIII PI3K protein was decreased in the DDP+Guiluerxianjiao decoction drug serum group compared with the DDP group（P＜0.05）.The ClassⅠPI3K and mTOR proteins had no significant change（P＞0.05）.[Conclusion]Guiluerxianjiao Decoction drug serum can regulate the expression of ATG5,ClassIII PI3K,ClassI PI3K,mTOR.

Guiluerxianjiao Decoction；T cell；ATG5；ClassⅢ PI3K；ClassⅠPI3K；mTOR；autophagy；chemotherapy

R331

A

1005-5509（2017）07-0612-05

10.16466/j.issn1005-5509.2017.07.015

2017-01-09）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項目（2014KYB202）；杭州市衛(wèi)生科技計劃（2014A32）

Fund projects：Projectofmedicaland health technology developmentprogram in Zhejiang Province （2014KYB202）；Science and Technology Planning Project of Hangzhou（2014A32）

林勝友，E-mail：linsy0628@163.com