代群 黃宣 陳喆

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006

桔梗皂甙D對人胃癌細(xì)胞SGC7901增殖的抑制作用和機制研究

代群 黃宣 陳喆

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006

[目的]探討桔梗皂甙D（platycodin D，PD）對人胃癌細(xì)胞株SGC7901增殖的抑制作用及作用機制。[方法]體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株SGC7901，加入終濃度分別為5～20μm·L-1的PD。采用MTT法測定藥物對細(xì)胞增殖的抑制作用，Annexin V/PI雙標(biāo)法檢測細(xì)胞凋亡率，JC-1檢測線粒體膜電位的變化，Western blot檢測PD對凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP、bcl-2、bax和對MAPK信號通路蛋白ERK、JNK、p38及其磷酸化蛋白p-ERK、p-JNK、p-p38表達的影響。[結(jié)果]MTT結(jié)果顯示，PD作用24h和48h后，PD對SGC7901細(xì)胞增殖的抑制隨濃度的增加而增強；PD作用SGC7901后，細(xì)胞凋亡率明顯增加，線粒體膜電位降低。Western blot檢測結(jié)果顯示cleaved PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、bax蛋白表達量隨著藥物濃度的增加而升高，bcl-2蛋白表達下降，同時p-JNK、p-p38水平明顯升高，p-ERK蛋白水平下降，ERK、JNK、p38蛋白的表達無明顯變化。[結(jié)論]PD對胃癌細(xì)胞SGC7901有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。PD通過抑制ERK信號通路從而抑制細(xì)胞增殖，通過激活JNK和p38信號途徑調(diào)控bax和bcl-2表達，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，進而激活caspase，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

PD；SGC7901；細(xì)胞凋亡；線粒體膜電位；bcl-2家族蛋白；MAPK信號通路

胃癌是國內(nèi)發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，從分子腫瘤學(xué)角度分析，胃癌的發(fā)病機制在于腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控。近年來中藥抗腫瘤研究取得很大進展。桔梗皂苷D（platycodin，PD）是從桔梗中提取的主要活性成分，對多種腫瘤細(xì)胞如肺癌[1]、卵巢癌[2]、乳腺癌[3]、前列腺癌[4]等具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。PD抗腫瘤活性涉及抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移[1-4]。絲裂原激活蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）信號傳導(dǎo)途徑，可將細(xì)胞外信息傳遞至細(xì)胞核中，介導(dǎo)細(xì)胞的生存和凋亡，研究證實該信號通路異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[5]。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括ERK、JNK和p38信號通路，其中ERK信號通路主要與細(xì)胞的增殖相關(guān)[6]，JNK和p38信號通路則主要介導(dǎo)細(xì)胞的炎癥和凋亡[7-8]。本研究擬探討PD對人胃癌細(xì)胞株SGC7901增殖的抑制作用，及其否通過調(diào)控MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抗腫瘤的功效。

1 材料與方法

1.1 材料 PD購自成都曼思特生物科技有限公司(純度＞98%)；胎牛血清購自 Giboc 公司（1227693）；RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)基購自科易生物技術(shù)有限公司（2016011603）；CCK-8 試劑購自 Dojindo（KM671）；Apoptosis Assay細(xì)胞凋亡試劑盒（5306537）和JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒（71926）均購自BD公司；抗體 p-JNK(9255)、JNK(9258)、p-38(9215)、p38(9217)、p-ERK(9101)、ERK(9102)、bax(2772S)、bcl-2(2870)、cleaved PARP(9542S)、cleaved caspase-3(9661S)、cleaved caspase-9（9505S）均購自 Cell Signal公司；β-actin（4970P）及抗兔和抗鼠的二抗均為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株SGC7901購自中科院上海細(xì)胞生物研究所，含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞增殖抑制實驗 收集對數(shù)生長期的SGC7901細(xì)胞，以5×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔 100μL，加入終濃度為 5、10、15、20μm·L-1的PD，每個濃度設(shè)平行孔6個，并設(shè)立不加PD的空白組作為對照，于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24、48h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，酶標(biāo)儀450nm處檢測OD值，根據(jù)OD值計算藥物體外生長抑制率（inhibition rates，IR）和細(xì)胞存活率。

1.3.2 細(xì)胞凋亡實驗 取對數(shù)生長期的SGC7901細(xì)胞，按以5×104/mL接種于6孔板，每孔1mL。分別收集 5、10、15、20μm·L-1PD 藥物作用 24h 的細(xì)胞以及不加PD藥物的空白組細(xì)胞。按試劑盒說明書進行操作，冷PBS緩沖液洗2次，重懸于1×結(jié)合緩沖液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/L。取100μL細(xì)胞懸液加5μL Annexin-V FITC 標(biāo)記液和 5μL PI(50μm·mL-1)混勻，室溫避光孵育15min后，加400μL結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞凋亡的百分比。

1.3.3 線粒體膜電位的測定PD作用SGC7901細(xì)胞24h，收集細(xì)胞，PBS洗細(xì)胞3次，用去離子水按1:9比例稀釋 10×incubation Buffer為 1×incubation Buffer，混勻并預(yù)熱至 37℃，吸取 2.5mL 1×incubation Buffer，加入5μL JC-1 stocking solution，渦旋混勻配成JC-1 working solution，取 500μL JC-1 working solution將細(xì)胞均勻懸浮，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15min，室溫離心收集細(xì)胞，用 1×incubation Buffer洗兩次，吸取500μL 1×incubation Buffer重新懸浮細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位。

1.3.4 Western-Blot檢測蛋白表達 收集不同濃度PD作用24h的細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液100μL，12000r/min離心15min，采用BCA方法測定蛋白濃度，取30μg蛋白，加入上樣緩沖液，100℃下變性10min。10%的聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后依次加入第一、二抗體，在室溫下孵育2h，TBST緩沖液洗滌3次，每次10min，過氧化物酶法顯色，凝膠顯微成像系統(tǒng)處理，采用Quantity one軟件分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0進行統(tǒng)計，各組數(shù)據(jù)采用±s表示，兩組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 PD對SGC7901細(xì)胞的增殖抑制作用 5、10、15、20μm·L-1濃度的 PD 處理 SGC7901細(xì)胞 24h和48h，PD對細(xì)胞增殖的抑制作用（表1），細(xì)胞存活率（圖1）。結(jié)果顯示PD對胃癌細(xì)胞SGC7901的抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 PD對SGC7901細(xì)胞增殖的抑制作用（%，±s，n=3）Tab.1 Inhibitory effect of PD on the proliferation of SGC7901（%，±s，n=3）

表1 PD對SGC7901細(xì)胞增殖的抑制作用（%，±s，n=3）Tab.1 Inhibitory effect of PD on the proliferation of SGC7901（%，±s，n=3）

注：與空白組比較，*P＜0.05,**P＜0.01。Note:Compared with the blank group*P＜0.05,**P＜0.01.

時間40.2±7.6**59.8±10.3**10 15 20 24h 48h PD（μm·L-1）0 5 0 0 6.8±3.4 11.6±5.4 15.3±8.2*26.8±6.3*35.2±9.5**49.6±9.4**

圖1 PD對胃癌細(xì)胞SGC7901增殖存活率的影響Fig.1 Effect of PD on survival rate of gastric cancer cell SGC7901proliferation

2.2 PD誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡的作用 收集不同濃度PD處理24h的SGC7901細(xì)胞細(xì)胞，并用AnnexinV FITC/PI試劑標(biāo)記，5、10、15、20μm·L-1PD誘導(dǎo)細(xì)胞的早期凋亡率分別為（8.3±3.6）%、（15.9±4.2）%、（31.2±5.3）%、（39.6±5.2）%，與空白組凋亡率（2.5±1.2）%相比，細(xì)胞凋亡率明顯增加，見圖 2A；10、15、20μm·L-1PD與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），見圖 2B。

2.3 PD對SGC7901細(xì)胞線粒體膜電位的影響 SGC7901細(xì)胞經(jīng) 5、10、15、20μm·L-1PD 作用 24h 后，線粒體膜電位分別是 （87.6±4.9）%、（82.7±6.8）%、（56.7±5.7）%和（36.4±6.3）%，與空白組線粒體膜電位（94.2±1.8）%比較，結(jié)果顯示隨PD濃度的增加，線粒體膜電位降低，見圖 3A；10、15、20μm·L-1PD 與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），見圖 3B。

圖2 A PD誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡的作用Fig.2A The effect of PD on apoptosis of SGC7901

圖2 B PD誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率的統(tǒng)計分析Fig.2B Statistical analysis of PD on apoptosis rate

圖3 A PD對SGC7901細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.3A Effects of PD on mitochondrial membrane potential of SGC7901

圖3 B PD對細(xì)胞線粒體膜電位的統(tǒng)計分析Fig.3B Statistical analysis of PD on mitochondrial membrane potential

2.4 PD對caspase相關(guān)蛋白的影響 Western-blot實驗結(jié)果顯示PD作用SGC7901細(xì)胞24h后，隨著藥物濃度增加，cleaved PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白濃度逐漸增加，（圖4A）。半定量分析結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增高，PD對cleaved PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9 蛋白的作用逐漸增強，15和20μm·L-1濃度的PD與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），（圖 4B）。結(jié)果表明PD可以活化 caspase-3和caspase-9蛋白酶，形成cleaved caspase-3和cleaved caspase-9，進而降解底物生成cleaved PARP，參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

2.5 PD對SGC7901細(xì)胞bcl-2和bax蛋白表達的影響 不同濃度的PD作用SGC7901細(xì)胞24h后，Western blot方法檢測結(jié)果顯示bax蛋白表達水平隨藥物濃度的增加而增加，而bcl-2蛋白表達水平逐漸降低，（圖5A）。半定量分析結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增高，PD對bax、bcl-2蛋白的作用逐漸增強，15和20μm·L-1濃度的PD與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），（圖 5B）。結(jié)果表明 PD 可以作用bcl家族蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

2.6 PD對MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的作用 PD處理SGC7901細(xì)胞24h，Western blot方法檢測結(jié)果顯示p-JNK和p-p38增加，JNK、p38蛋白表達變化不明顯，表明PD激活了JNK、p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。p-JNK和p-p38升高的同時，p-ERK表達下降，表明PD通過降低ERK的活性抑制SGC7901細(xì)胞的增殖，（圖6A）。半定量分析結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增高，JNK、p38、ERK蛋白表達無明顯差異，而對p-JNK、p-p38、p-ERK 蛋白的作用逐漸增強，15 和20μm·L-1濃度的PD與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），（圖6B）。結(jié)果表明PD可以抑制 ERK信號，同時激活JNK和p38信號途徑。

圖4 A PD對SGC7901細(xì)胞caspase相關(guān)蛋白的作用Fig.4A Effects of PD on caspase protein in SGC7901 Cells

圖4 B PD對caspase相關(guān)蛋白作用的半定量分析Fig.4B Semi-quantitative analysis of PD on caspase protein

圖5 A PD對SGC7901細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白bcl-2和bax的影響Fig.5A Effects of PD on apoptosis related protein bcl-2 and bax in SGC7901 Cells

圖5 B PD對bcl-2和bax蛋白的半定量分析Fig.5B Semi-quantitative analysis of PD on protein bcl-2 and bax

圖6 A PD對MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的影響Fig.6A Effects of PD on important proteins of MAPK signaling pathway

圖6 B PD對MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白作用的半定量分析Fig.6B Semi-quantitative analysis of PD on important proteins of MAPK signaling pathway

3 討論

PD是常用傳統(tǒng)中藥桔梗的主要活性成分之一，近年來國內(nèi)外對其在體內(nèi)體外研究逐漸增多。PD不僅在抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫方面表現(xiàn)出良好的藥理活性，大量文獻報道PD也有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[1-4]。本研究結(jié)果顯示PD對胃癌細(xì)胞株SGC7901有抑制生長的作用，呈濃度依賴性，流式檢測結(jié)果也證實PD體外有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

線粒體膜電位的破壞是細(xì)胞凋亡早期發(fā)生的一個標(biāo)志性事件。bcl-2家族蛋白是重要的細(xì)胞線粒體凋亡調(diào)節(jié)因子，包括抑制和促進細(xì)胞凋亡兩類功能相反的蛋白質(zhì)，蛋白成員間的相互作用對線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起調(diào)控作用?？沟蛲龅鞍譩cl-2與結(jié)合在線粒體外膜面或存在于胞漿的促凋亡蛋白bax、bak等相互作用，引起線粒體膜通透性改變和跨膜電位丟失。細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體膜電位的變化使得膜的通透性發(fā)生改變。膜通透性的增加，使得線粒體蛋白包括細(xì)胞色素C、核酸內(nèi)切酶、凋亡誘導(dǎo)因子等從線粒體基質(zhì)釋放到細(xì)胞漿。細(xì)胞色素C的釋放伴隨膜電位的完全喪失，進而引發(fā)細(xì)胞凋亡酶的級聯(lián)效應(yīng)。本實驗應(yīng)用JC-1染色，通過流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位的變化，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加，胃癌細(xì)胞線粒體膜電位逐漸下降；實驗結(jié)果證實PD通過調(diào)控bcl-2、bax蛋白表達的改變引發(fā)線粒體膜電位的下降，激活caspase導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，在細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等的過程中具有至關(guān)重要的作用。已有文獻報道PD通過激活MAPK信號通路和EGFR介導(dǎo)的Akt通路發(fā)揮抑制乳腺癌生長、遷移、侵襲的作用[9]；也有研究發(fā)現(xiàn)PD通過激活p38信號通路誘導(dǎo)胃腺癌ACS凋亡和線粒體凋亡[10]。MAPK信號通路包括ERK、JNK/SAPK和P38信號途徑。其中ERK信號途徑與細(xì)胞增殖相關(guān)，JNK/SAPK和p38信號途徑通過誘導(dǎo)bcl-2和bax線粒體轉(zhuǎn)位，調(diào)控細(xì)胞凋亡。為了深入探討PD誘發(fā)SGC7901細(xì)胞凋亡的可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，本實驗檢測MAPK信號途徑中的關(guān)鍵蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PD作用下，磷酸化的JNK、p38表達升高，說明PD通過激活JNK和p38信號通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡。ERK的活性增強與細(xì)胞生長密切相關(guān)，隨著藥物濃度的增高，磷酸化的ERK表達下降，表明PD通過調(diào)控ERK蛋白活性的降低發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用。綜上，PD能抑制胃癌細(xì)胞的增殖，通過抑制ERK信號通路從而抑制細(xì)胞增殖，通過激活JNK和p38信號途徑調(diào)控bax和bcl-2表達，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，進而激活caspase，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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Inhibitory Effect of Platycodin D on Proliferation of SGC7901 Cells and Moleclar Mechanism

DAI Qun,HUANG Xuan,CHEN Zhe First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)

[Objective]To investigate the effects of platycodin D(PD)on the proliferation and apoptosis of human stomach cancer SGC7901 and the related mechanism.[Methods]SGC7901 was cultured in virto and was treated with 5～20μm·L-1concentrations of PD.Cell proliferation was examined by MTT assay.Cell apoptosis was detected by Annexin V FITC/PI double staining.The change of mitochondrial trans-membrane potential was measured by JC-1 staining.The potein expression of cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,cleaved PARP,bcl-2,bax,p-ERK,ERK,p-JNK,JNK,p-p38 and p38 detected by Western blot.[Results]MTT results showed that PD inhibited the growth of SGC7901 cells in a dose-dependent manner at 24h and 48h.SGC7901 cells treated with PD for 24h showed significantly enhanced apoptosis and weakened mitochondrial membrane potential compared with the control cells.Western blot results showed that PD could up-regulate expression of cleaved PARP,cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,bax,p-JNK,p-p38 protein,decreased bcl-2,p-ERK protein,the expression of ERK,JNK,p38 protein did not change significantly.[Conclusion]PD may inhibit the proliferation and induce the apoptosis of SGC7901 cells.These findings indicated that PD inhibited cell proliferation by inhibiting the ERK signaling.PD effect on bax and bcl-2 by activation of JNK and p38 signaling pathway resulted in the decrease of mitochondrial membrane potential and activation of caspase,which induced the apoptosis of cancer cells.

PD;SGC7901 cell apoptosis;mitochondrial membrane potential;bcl-2 family protein;MAPK signal pathway

R331

A

1005-5509（2017）07-0573-07

10.16466/j.issn1005-5509.2017.07.005

2017-03-16）

國家自然科學(xué)基金項目（81673745）

Fund project:National Natural Science Fund(81673745）

黃宣，E-mail：huangxuan1976@163.com