高世蘭，張曉娜，胡方杰，李積東，蒲小燕，永 勝

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001)

低氧對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力及氧依賴殺傷功能的影響*

高世蘭，張曉娜，胡方杰，李積東，蒲小燕，永 勝§

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001)

目的 探討低氧對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(Mφ)吞噬殺傷能力，IL-6、TNF-α分泌功能的影響。方法 ①用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠腹腔Mφ對(duì)FITC標(biāo)記金黃色葡萄球菌的吞噬能力；②用雙乙?；葻晒馑?DCFH-DA)熒光探針法檢測(cè)Mφ呼吸爆發(fā)功能；③用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠Mφ培養(yǎng)上清中的NO濃度；④用ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中的IL-6、TNF-α濃度。結(jié)果 低氧暴露30 d后，模擬海拔5000 m實(shí)驗(yàn)組小鼠與常氧對(duì)照組(海拔400m)相比，小鼠腹腔Mφ吞噬能力、呼吸爆發(fā)能力及NO釋放量顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-6、TNF-α的濃度明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 模擬海拔5000 m低氧暴露30 d后，Mφ的吞噬能力和氧依賴殺傷功能降低，Mφ分泌IL-6、TNF-α的水平升高。說明低氧在一定程度上降低Mφ抗原清除能力并引發(fā)炎性反應(yīng)。

低氧 Mφ 吞噬能力呼吸爆發(fā) NO IL-6 TNF-α

急進(jìn)高原時(shí)，機(jī)體免疫功能發(fā)生改變，表現(xiàn)為T細(xì)胞的重新分布，免疫球蛋白、淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子分泌水平變化[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，模擬海拔8000 m，低氧暴露下的小鼠脾T淋巴細(xì)胞增值能力降低，脾CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)減少；大鼠外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞活化水平均下降，而B淋巴細(xì)胞增殖功能未見明顯變化[3]。在低氧環(huán)境中培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞的成熟延緩，細(xì)胞因子的分泌發(fā)生改變[4-5]。有關(guān)低氧環(huán)境對(duì)機(jī)體免疫損傷的研究是醫(yī)學(xué)熱點(diǎn)難點(diǎn)之一，因此有關(guān)低氧損傷的免疫機(jī)制及其防治措施的研究越來(lái)越受到關(guān)注。目前有關(guān)低氧對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的研究多側(cè)重于淋巴細(xì)胞，但對(duì)Mφ功能改變的報(bào)道甚少。Mφ是參與固有免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞，具有吞噬殺傷、抗原提呈、腫瘤抑制、生物活性物質(zhì)分泌等多種功能[6]。本研究模擬海拔5000 m環(huán)境，觀察低氧暴露下的小鼠Mφ功能改變，探討低氧條件對(duì)機(jī)體固有免疫細(xì)胞-Mφ吞噬殺傷以及分泌細(xì)胞因子功能的影響，為低氧對(duì)固有免疫的影響提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物

健康雄性BALB/c小鼠，4～6周齡，購(gòu)買于西安交大醫(yī)學(xué)院，合格證號(hào)：SCXK(陜2007-001)。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

無(wú)菌操作臺(tái)(ZHJH-C2019C，上海智城分析儀器制造有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Forma，美國(guó))；小型臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf 5148R，德國(guó))；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIO-RAD xMark，美國(guó))；恒溫?fù)u床(ZD-85，精達(dá)儀器制造廠) ；低壓氧艙(DYC-3000，貴州航空風(fēng)雷軍械有限責(zé)任公司)；流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur，美國(guó))。

1.2.2 試劑

脂多糖(LPS，Sigma公司)；RPMI-1640(索萊寶公司，北京)；PBS 緩沖液(北京索萊寶公司)；IL-6、TNF-a、NOELISA試劑盒(TSZ，美國(guó))；異硫氰酸熒光素(FITC，ebioscienc美國(guó))；雙乙酰基二氯熒光素(DCFH-DA，Sigma公司)；N-甲酞-甲硫氨酞-亮氨酞苯丙氨酸(fMLP，Sigma公司)；豆蔻酰佛波醇乙酷(PMA，Sigma公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 低氧動(dòng)物模型建立

小鼠常規(guī)分籠喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后分兩組。低氧實(shí)驗(yàn)組小鼠飼養(yǎng)于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)中心低壓氧艙(模擬海拔5000m)，常氧對(duì)照組小鼠飼養(yǎng)于西安交大醫(yī)學(xué)院常規(guī)動(dòng)物室(海拔400m)，兩組小鼠在18 ℃～22 ℃室溫條件下分籠喂養(yǎng)30 d。

1.3.2 Mφ吞噬能力檢測(cè)

1.3.2.1 小鼠腹腔Mφ制備：參照文獻(xiàn)方法[7]，分離獲取腹腔Mφ(細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106個(gè)/mL)。

1.3.2.2 FITC標(biāo)記細(xì)菌的制備：參照文獻(xiàn)方法[8](細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106個(gè)/mL)。

1.3.2.3 吞噬能力檢測(cè)：參照文獻(xiàn)方法[8]，細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用 FITC標(biāo)記細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞百分率表示Mφ吞噬率，陽(yáng)性細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(x-Mean)代表Mφ吞噬能力(吞噬指數(shù))[9]，每個(gè)樣本均檢測(cè)10000個(gè)細(xì)胞。

1.3.3 Mφ呼吸爆發(fā)檢測(cè)

1.3.3.1 探針DCFH-DA裝載：參照文獻(xiàn)方法[8](細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106個(gè)/mL)。

1.3.3.2 呼吸爆發(fā)能力檢測(cè)：參照文獻(xiàn)方法[8]，用FL1直方圖陽(yáng)性細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(x-Mean)表示ROS水平(圖1)[10]。

1.3.4 小鼠Mφ培養(yǎng)上清中的NO水平檢測(cè)

將1×106個(gè)/mL Mφ細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100μL/孔)，每孔加入100 μL LPS (5、10、20、40μg/mL，設(shè)未刺激對(duì)照組)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用NO檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清。檢測(cè)嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 小鼠Mφ培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α的釋放水平檢測(cè)

將1×106個(gè)/mL Mφ細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100μL/孔)，每孔加入100 μL LPS(終濃度為10μg/mL)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用IL-6、TNF-α試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清。檢測(cè)嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

常氧組 低氧組

Figure 1 Influence of hypoxia on peritoneal macrophages respiratory burst in mice

2 結(jié)果

2.1 低氧對(duì)Mφ吞噬能力的影響

低氧(模擬海拔5000m)下暴露小鼠30 d后，與常氧對(duì)照組相比，低氧組小鼠腹腔Mφ的吞噬率以及吞噬指數(shù)顯著降低(P<0.01)，說明低氧暴露致使小鼠Mφ吞噬抗原異物功能降低。數(shù)據(jù)詳見表1。

Table 1 Influence of hypoxia on peritoneal macrophages phagocytosis in ±s)

2.2 低氧對(duì)Mφ呼吸爆發(fā)功能的影響

低氧(模擬海拔5000m)下暴露小鼠30 d后，與常氧對(duì)照組相比，低氧實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔Mφ呼吸爆發(fā)水平顯著降低(P<0.01)，說明低氧暴露使小鼠腹腔Mφ氧依賴殺傷功能降低。組內(nèi)比較，刺激物fMLP、PMA濃度為0.1～10 μmo1/L時(shí)與未加刺激物比較，小鼠腹腔Mφ呼吸爆發(fā)水平顯著升高(P<0.01)；刺激物fMLP、PMA濃度為1～10 μmo1/L時(shí)與0.1 μmo1/L比較，小鼠腹腔Mφ呼吸爆發(fā)水平顯著升高(P<0.01)；刺激物fMLP、PMA濃度為10 μmo1/L時(shí)與1 μmo1/L比較，小鼠腹腔Mφ呼吸爆發(fā)水平顯著升高(P<0.01)。說明隨著刺激物濃度的增加，小鼠腹腔Mφ呼吸爆發(fā)水平也隨之升高。數(shù)據(jù)詳見表2、3。

Table 2 Influence of hypoxia on peritoneal macrophages respiratory burst in ±s)

*：compared with 0 μmo1/L groupP<0.01；#，compared with 0.1 μmo1/L groupP<0.01；△，compared with 1 μmo1/L groupP<0.01.

Table 3 Influence of hypoxia on peritoneal macrophages respiratory burst in ±s)

*：compared with 0 μmo1/L groupP<0.01；#，compared with 0.1 μmo1/L groupP<0.01；△，compared with 1 μmo1/L groupP<0.01.

2.3 低氧對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔MφNO產(chǎn)生的影響

低氧(模擬海拔5000m)下暴露小鼠30 d后，與常氧對(duì)照組相比，低氧實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中NO的濃度顯著降低(P<0.01)，說明低氧暴露使小鼠腹腔Mφ氧依賴殺傷功能降低。組內(nèi)比較，刺激物L(fēng)PS濃度為(5～40)μg/mL時(shí)與未加刺激物比較，小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中NO的濃度顯著增加(P<0.01)；刺激物L(fēng)PS濃度為(10～40)μg/mL時(shí)與5 μg/mL比較，小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中NO的濃度顯著增加(P<0.01)；刺激物L(fēng)PS濃度為(20～40)μg/mL時(shí)與10 μg/mL比較，小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中NO的濃度顯著增加(P<0.01)；刺激物L(fēng)PS濃度為40 μg/mL時(shí)與20 μg/mL比較，小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中NO的濃度顯著增加(P<0.01)。說明隨著刺激物濃度的增加，小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中NO的濃度也隨之增加。數(shù)據(jù)詳見表4。

*：compared with 0 μg/mL groupP<0.01；#，compared with 5 μg/mL groupP<0.01；△，compared with 10 μg/mL groupP<0.01；□，compared with 20 μg/mL groupP<0.01.

2.4 低氧對(duì)Mφ分泌IL-6、TNF-α的影響

低氧(模擬海拔5000m)下暴露小鼠30 d后，與常氧對(duì)照組相比，低氧實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α的濃度顯著上升(P<0.01)。說明模擬海拔5000 m低氧暴露可使小鼠Mφ分泌細(xì)胞因子的能力發(fā)生改變。組內(nèi)比較，刺激物L(fēng)PS濃度為10 μg/mL時(shí)與未加刺激物比較，小鼠腹腔Mφ培養(yǎng)上清中IL-6、TNF-α的濃度顯著增加(P<0.01)。數(shù)據(jù)詳見表5。

組別nIL-6LPS0μg/mLLPS10μg/mLTNF-αLPS0μg/mLLPS10μg/mL常氧組1034．2±3．345．3±4．5?48．7±3．569．4±8．2?低氧組1049．2±5．887．6±7．6?70．4±4．1112．6±25．2?t7．09415．21612．724 5．142P<0．001<0．001<0．001 <0．001

*：compared with 0 μg/mL groupP<0.01.

3 討論

研究表明，低氧應(yīng)激造成免疫功能穩(wěn)態(tài)的破壞，出現(xiàn)免疫抑制、機(jī)體易感性增加[1，11-12]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，高原肺水腫患者外周血中白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞明顯增高，并且血漿腫瘤壞死因-α(TNF-α)、IL-6、內(nèi)皮素-1(ET-1)、CRP含量亦顯著增高[13-14]。重癥急性高原病患者的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8含量均明顯高于高原健康人群[15]。以上研究說明低氧可導(dǎo)致機(jī)體的防御功能受損。固有免疫系統(tǒng)是機(jī)體防御病原體侵襲的第一道防線，固有免疫細(xì)胞能吞噬、分解生物大分子，殺滅病原體。Mφ是固有免疫應(yīng)答中重要的細(xì)胞成分，具有吞噬殺傷病原體、提呈抗原、分泌細(xì)胞因子及抑制腫瘤等多種功能，構(gòu)成了機(jī)體非特異防御的主要基礎(chǔ)[16]。Mφ通過其表面抗原識(shí)別受體(如Fc受體)識(shí)別抗原異物并促進(jìn)其吞噬[17]，吞入細(xì)胞內(nèi)的抗原異物通過 “呼吸爆發(fā)”產(chǎn)生大量活性氧(ROS，reactive oxygen species)這類高活性的殺菌物質(zhì)清除[18]，另外活化的Mφ所產(chǎn)生的誘導(dǎo)型NO合成酶(iNOS)可催化L-精氨酸與氧分子反應(yīng)產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide，NO)，NO與過氧化氫(H2O2)或過氧化物酶結(jié)合產(chǎn)生過亞硝酸鹽基，殺傷清除細(xì)菌。有研究表明，高原低氧可使人外周血中性粒細(xì)胞NADPH活性降低，從而影響其免疫功能[19]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，低氧抑制MφNADPH 氧化酶的活性[20]。另外，低氧導(dǎo)致Mφ的吞噬能力降低[21-22]，清除金黃色葡萄球菌的功能受到抑制[23]。Mφ分泌IL-6、TNF-α等多種細(xì)胞因子，參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展[24]。低氧可引起高原人群血清中IL-6、TNF-α的上升[25]。研究表明，肺動(dòng)脈高壓大鼠模型中，低壓低氧致使大鼠血清中TNF-α、IL-6分泌增加[26]。據(jù)報(bào)道，活化的Mφ可分泌IL-6、TNF-α促炎癥因子而引起廣泛的組織損傷、多器官炎性反應(yīng)[6，27]。研究發(fā)現(xiàn)TNF-α具有活化Mφ、增強(qiáng)Mφ殺傷功能、提高中性粒細(xì)胞吞噬能力及增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[16]。本實(shí)驗(yàn)在低氧暴露下，用fMLP、PMA作為刺激劑，觀察Mφ吞噬殺傷功能變化；用LPS作為Mφ的刺激劑，觀察Mφ分泌炎性因子IL-6、TNF-α以及NO的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模擬海拔5000 m高原低氧暴露30 d后，小鼠腹腔Mφ吞噬能力及氧依賴殺傷功能明顯低于常氧對(duì)照組，而分泌IL-6、TNF-α水平顯著高于對(duì)照組。相同濃度刺激物L(fēng)PS作用下，NO的分泌水平隨著刺激濃度的增加而增加。

本研究顯示，模擬海拔5000 m低氧暴露可導(dǎo)致小鼠腹腔Mφ吞噬殺傷功能降低、分泌細(xì)胞因子能力增加，使清除抗原能力降低，引發(fā)炎性反應(yīng)，抑制Mφ免疫功能。

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Effects of Plateau Hypoxia on Phagocytosis and Oxygen-dependent Catalyticactivity of Peritoneal Macrophages in Mice

GAO Shi-lan，ZHANG Xiao-na，HU Fang-jie，LI Ji-dong，PU Xiao-yan，YONG Sheng§

(Qinghai University Medical College，Xining，810001，China)

Objective To explore the influences of hypoxia on the phagocytosis and cytolyticactivity as well as secretion variation of Interleukin-6(IL-6)and Tumor Necrosis Factor-α(TNF-α)of peritoneal macrophages in mice.Methods (1)Using flow cytometry to detect the phagocytosis and cytolyticactivity of peritoneal macrophages to staphylococcus aureus marked with fluorescein isothiocyanate(FITC).(2)The respiratory burst level of the cultured macrophage in mice was detected with 2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)fluorescent probe method.(3)The concentration of nitric oxide(NO)of the cultured macrophage supernatant in mice was determined with ELISA kits.(4)The concentration of IL-6 and TNF-α of the cultured macrophage supernatant in mice was also measured with ELISA kits.Results Compared with the normoxic control group(400m)，the hypoxia group(5000m)exposed under simulated altitude of 5000 m for 30 days，all of the phagocytosis，respiratory burst level and NO release decreased(P<0.05)，while the concentration of IL-6 and TNF-α in the Mφ supernatant of the hypoxia group were significantly increased(P<0.05).Conclusion After exposed to hypoxia at simulated altitude of 5000 m for 30 days，the phagocytosis and cytolyticactivity of mice are suppressed and the cytokines secretion level of IL-6 and TNF-α in Mφ are increased.It suggests that plateau hypoxia can suppress the antigen clear functions of Mφ and induce inflammatory reactions in mice.

Hypoxia Macrophages Phagocytosis Respiratory burst IL-6 TNF-α

﹡：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81060249)；青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014-ZJ-715，2015-ZJ-741)；§：通信作者，博士，副教授，E-mail：yongsheng@qhu.edu.cn 高世蘭(1992～)，女，藏族，青海籍，免疫學(xué)在讀碩士研究生

R392

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.02.008

2016-11-09