劉軍莉，湯峰，劉川川，崔森，李占全

(1.青海大學高原醫(yī)學研究中心；2.青海大學附屬醫(yī)院；3.高原醫(yī)學應用基礎重點實驗室； 4.青海-猶他高原醫(yī)學聯(lián)合重點實驗室，青海 西寧 810000)

阿爾茨海默病淀粉樣蛋白抗原表位`的生物信息學預測*

劉軍莉1，2，3，4，湯峰1，3，4，劉川川1，3，崔森2，3#，李占全2，3&

(1.青海大學高原醫(yī)學研究中心；2.青海大學附屬醫(yī)院；3.高原醫(yī)學應用基礎重點實驗室； 4.青海-猶他高原醫(yī)學聯(lián)合重點實驗室，青海 西寧 810000)

目的 利用生物信息學預測阿爾茨海默病中淀粉樣前體蛋白的二級結構及優(yōu)勢抗原表位，擬為今后基于Aβ蛋白表位疫苗的設計奠定基礎。方法 用Genbank獲取APP及氨基酸殘基片段Aβ1～42蛋白的氨基酸序列，應用生物信息學在線軟件SOPMA預測上述蛋白的二級結構，并通過IEDB、SYFPEITHI、Bcepred和ABCpred軟件在線預測APP及Aβ1～42的T、B細胞抗原表位。同時對上述蛋白的親水性、柔韌性、抗原傾向性及抗原暴露表面區(qū)域性進行預測。結果 APP及Aβ1～42蛋白二級結構中α-螺旋及延伸鏈比例分別為46.49%、52.38%，所占比例較高，有較強的抗原性，提示存在潛在的優(yōu)勢抗原性表位。進一步通過不同生物信息學方法分析出APP的T細胞表位位于37～49、16～28、1～13、11～24、30～43、42～0；Aβ1～42蛋白的T細胞表位位于3～11(675～683)、1～11(673～683)、22～31(696～705)、31～39(705～713)。APP蛋白潛在的B細胞表位位于49～62、72～85、350～365、637～652；Aβ1～42蛋白的B細胞表位位于4～19(676～691)、26～39(700～713)、11～26(683～698)、26～41(698～713)。結論 APP及Aβ1～42蛋白存在潛在的優(yōu)勢抗原性表位，且Aβ1～42的抗原優(yōu)勢表位與APP優(yōu)勢表位不同，針對Aβ1～42設計更具有特異性的表位疫苗對APP無影響從而發(fā)揮更好的預防、治療作用。該結論為今后基于Aβ蛋白表位疫苗的設計奠定了理論基礎。

阿爾茨海默病 APP蛋白 二級結構 表面抗原

β淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)為淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)的酶解產(chǎn)物，由細胞分泌，Aβ在腦內(nèi)的異常形成聚集產(chǎn)生的神經(jīng)毒性作用已經(jīng)被公認為阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)形成和發(fā)展的關鍵因素[1-2]。APP經(jīng)過β、γ分泌酶依次裂解為Aβ1～40 、Aβ25～35、Aβ1～42等多種片段。有研究表明AD患者腦內(nèi)主要成分為Aβ1～42，而正常老年人和AD患者腦內(nèi)均存在Aβ1～40[3]，但Aβ1～42毒性更強，更容易聚集，形成Aβ沉積的核心，從而引發(fā)神經(jīng)毒性作用[4]。因此以Aβ1～42為靶標研制疫苗阻斷和清除Aβ沉積，是預防和治療AD的一種有效策略。然而由于以Aβ1～42為抗原所產(chǎn)生的抗體會對APP產(chǎn)生相應的免疫識別，對正常的機體功能造成損傷。因此，如何激活機體免疫系統(tǒng)對Aβ1～42產(chǎn)生特異性高識別，并避免對APP蛋白正常功能的影響是AD預防與治療的科學難題。

本研究擬利用在線生物信息學軟件預測和分析APP及毒性片段Aβ1～42的二級結構特征，同時應用不同軟件預測APP及Aβ1～42潛在的 T 細胞和B細胞的優(yōu)勢抗原表位，并尋找出Aβ1～42的優(yōu)勢表位避免引入APP蛋白的優(yōu)勢表位，為今后基于Aβ蛋白的表位疫苗的設計奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 獲取APP蛋白的氨基酸序列

從GenBankhttps：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/178616?report=fasta)獲取APP及Aβ1～42相應的氨基酸序列[5]。GenBank記錄顯示，APP蛋白由770個氨基酸組成，Aβ1～42由42個氨基酸組成。見表1。

表1 APP蛋白及A β1～42蛋白的氨基酸序列的組成

Table 1 Amino acid sequence of APP protein and A β1～42 protein

1.2 預測 APP蛋白及Aβ1～42蛋白的二級結構特征

應用在線生物信息學軟件SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi- bin/secpred_sopma.pl)分析APP蛋白質(zhì)序列的二級結構[6]。輸入所獲取APP蛋白及Aβ1～42蛋白的氨基酸序列，對這兩個蛋白的二級結構的四個構象狀態(tài)(α-螺旋結構、延長鏈結構、β-轉角結構和無規(guī)則卷曲結構)分別進行分析。相似性閾值和窗口寬度的參數(shù)分別設置為8和17，其余參數(shù)為默認值[7]。

1.3 預測APP蛋白及Aβ1～42蛋白的T細胞抗原表位

明確APP及Aβ1～42蛋白的二級結構后，分別采用生物信息學軟件[IEDB(http：//tools.immuneepitope.org/main/index.html)[8]和Syfpeithi(http：//www.syfpeithi.de)]進行人源 MHC1抗原 HLA-A*02：01 分析，以預測APP蛋白潛在的T細胞抗原表位。將APP及Aβ1～42蛋白質(zhì)的氨基酸序列按要求分別輸入上述網(wǎng)址，并且調(diào)整參數(shù)：“MHC allele(s)”設定為 HLA-A * 02：01，“l(fā)ength”設定為8、9、10，其余參數(shù)值不變。

1.4 預測APP蛋白及Aβ1～42蛋白的B細胞抗原表位

分別應用下列在線軟件[Bcepred(http：//www.imtech.resin/raghava/bcepred/bcepred_submission.html)和ABCpred(http：//www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)[9]分析APP及Aβ1～42蛋白質(zhì)潛在的B細胞抗原表位。將上述蛋白的氨基酸序列按要求分別輸入上述網(wǎng)址，并且調(diào)整參數(shù)：親水性為 2；抗原性傾向為1.8；彈性為1.9；表面暴露面積為2.4；其余參數(shù)值不變。并設置 ABCpred 軟件的抗原表位長度分別為10、12、14、16，其余參數(shù)不變。

2 結果

2.1 預測APP及Aβ1～42蛋白的二級結構特征

為評估APP及Aβ1～42蛋白的抗原特性，課題組應用生物信息學軟件SOPMA預測上述蛋白的二級結構。APP蛋白質(zhì)中的α螺旋結構和無規(guī)則卷曲結構極有可能是潛在的優(yōu)勢抗原表位。預測的二級結構特征見圖1A、B。分析結果顯示，APP的二級結構中α螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈、β轉角結構的比例分別為46.69%、32.86%、13.38%、7.27%。見圖1(A)。Aβ1～42蛋白中的延伸鏈結構和無規(guī)則卷曲結構極有可能是潛在的優(yōu)勢抗原表位。其二級結構中α螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈、β轉角結構的比例分別為4.76%、23.81%、52.38%、19.05%。見圖1(B)。

圖中不同顏色的線條代表不同的二級結構：藍色，α螺旋；綠色，β轉角；紅色，延伸鏈；紫色，無規(guī)卷曲.根據(jù)結構特征圖可知APP蛋白在α螺旋最利于形成抗原表位，而Aβ1～42蛋白在延伸鏈有利于形成抗原表位.

Lines in different colors represent different secondary structures：Blue，α helix；green，β turn；red，extended strand；and purple， random coil.An increased number of α helix and extended strands in the protein corresponded with an increased likelihood of the protein forming an antigenic epitope.

圖1 APP蛋白及Aβ1～42蛋白的二級結構預測

Figure 1 Secondary structure prediction results for the APP and Aβ1-42 protein

2.2 預測APP及Aβ1～42蛋白的T細胞抗原表位

若能明確APP及Aβ1～42蛋白抗原表位的精確位置，對于研發(fā)表位疫苗極其重要。在此次研究中，使用不同在線軟件分別進行APP及Aβ1～42蛋白的T細胞表位預測。用IEDB軟件預測高分值為99和100。然而，通過SYFPEITHI軟件預測高分值為14和29。盡管這兩種方法預測軟件所采用的評分系統(tǒng)各不相同，但其共同點是分值較高的位點區(qū)域即為被預測的潛在抗原表位。見表2～3。

表2 使用IEDB和Syfpeithi在線預測APP的T細胞抗原表位

Table 2 Analysis of the T cell epitopes of APP protein using IEDB and Syfpeithi online prediction software

IEDE：http：//tools.iedb.org/mhci/result_in_text/；Syfpeithi：http：//www.syfpeithi.de.

表3 使用IEDB和Syfpeithi在線預測Aβ1～42的T細胞抗原表位

Table 3 Analysis of the T cell epitopes of Aβ1-42 protein using IEDB and Syfpeithi online prediction software

序號IEDB起始位點氨基酸序列得分Syfpeithi起始位點氨基酸序列得分13EFRHDSGYE10031IIGLMVGGV25222EDVGSNKGAI98．533GLMVGGVVI2431DAEFRHDSGYE96．516KLVFFAEDV24422EDVGSNKGAIIG9626SNKGAIIGL2156HDSGYEVHHQ9630AIIGLMVGG29622EDVGSNKG944FRHDSGYEV22

IEDE：http：//tools.iedb.org/mhci/result_in_text/；Syfpeithi：http：//www.syfpeithi.de.

2.3 預測APP及Aβ1～42蛋白的B細胞表位

使用Bcepred軟件進行預測，對APP的氨基酸序列的親水性、靈活性、抗原傾向性及抗原暴露表面區(qū)域性進行分析。預測分析結果見圖2。預測分析出APP蛋白的有高親水性的3個區(qū)域見圖2 A：T192～205(氨基酸序列：ESDNVDSADAEEDD)、T214～222(氨基酸序列：DTDYADGSE)、T238～262(氨基酸序列：EEEEADDDEDDEDGDEVEEEAEEPV)；預測出的2個彈性區(qū)域見圖 2B：T53～57(氨基酸序列：DSDPS)、T98～102(氨基酸序列：CKRJR)；2個可能的抗原傾向性區(qū)域見圖 2C：T70～76(氨基酸序列：LQYCQEV)、110～121(氨基酸序列：HFVIPIRCLVGE)。2個可能的抗原表面暴露區(qū)域見圖2D：T100～106(氨基酸序列：RGRKQCK)、T501～507(氨基酸序列：EQKDRQH)。對Aβ1～42蛋白的氨基酸序列的親水性、靈活性、抗原傾向性及抗原暴露表面面積進行分析。分析出Aβ1～42蛋白的有高親水性的1個區(qū)域見圖3 A：T24～26(氨基酸序列：VGS)；預測出的1個彈性區(qū)域見圖3B：T23～25(氨基酸序列：DVG)；1個抗原傾向性的區(qū)域見圖3：T14～17(氨基酸序列：HKQL)。

圖2 生物信息學軟件Bcepred預測APP蛋白的B細胞表位

A 親水性 B 彈性 C 抗原暴露表面積 D 抗原的傾向性

表4 生物信息學軟件ABCpred預測APP蛋白的B細胞抗原表位

Table 4 Analysis of the B cell epitopes of APP protein using ABC pred online prediction software

http：//www.imtech.res.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html

表5 生物信息學軟件ABCpred預測Aβ1-42蛋白的B細胞抗原表位

Table 5 Analysis of the B cell epitopes of Aβ1-42 protein using ABCpred online prediction software

http：//www.imtech.res.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html

3 討論

本研究結果顯示，APP及Aβ1～42蛋白存在潛在的優(yōu)勢抗原性表位，且Aβ1～42的抗原優(yōu)勢表位與APP優(yōu)勢表位不同。Aβ1～42的優(yōu)勢表位可避免引入APP蛋白的優(yōu)勢表位，從而激活機體免疫系統(tǒng)對Aβ1～42產(chǎn)生特異性高識別，避免對APP蛋白的正常功能產(chǎn)生不利影響。該結論為今后基于Aβ蛋白表位疫苗的設計奠定基礎。

制備疫苗的最主要步驟是獲得有關抗原表位的信息。近年來，隨著生物信息學的快速發(fā)展，多參數(shù)、多方法分析預測提高了表位預測的準確性。申子剛等人[10]應用DNAStarProtein軟件對FSHR胞外區(qū)的蛋白二級結構和表面特征進行分析，并在線進行B細胞表位預測，預測出FSHR胞外區(qū)蛋白可能的抗原表位。蛋白質(zhì)的二級結構與其表位分布密切相關。研究證實，α螺旋結構在維持蛋白質(zhì)二級結構的穩(wěn)定中起重要作用，但α螺旋結構呈現(xiàn)于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，因此不易與抗原分子結合[11]。與α螺旋結構不同，延伸鏈及無規(guī)卷曲等結構具有與配體特異性結合的結構區(qū)域，且多出現(xiàn)于蛋白質(zhì)的表面，因而延伸鏈和無規(guī)卷曲結構所在的區(qū)域是抗原表位形成的[12]有利部位。

本研究使用不同方法、設置不同參數(shù)分析了APP及毒性片段Aβ1～42蛋白的二級結構。通過對前述蛋白的多種性質(zhì)采用不同算法進行整合分析，從而提高所預測的抗原表位的準確性和特異性。

通過在線軟件SOPMA分析，得出APP蛋白的二級結構中有利于形成表面抗原的α螺旋結構的比例為46.49%，Aβ1～42蛋白的延伸鏈結構比例較高，為52.38%，提示有較強的抗原性。研究顯示，MHC-I 型的表位在預測的T細胞表位中的準確率高達90%[13]。在中國人群中HLA-A *02：01是最常見的HLA-I類分子，陽性率為55%。因此，在此項研究中，我們將前述兩種蛋白抗原的HLA-A * 02：01 限制性表位使用 IEDB和SYFPEITHI在線軟件進行預測分析。結果提示APP蛋白的T細胞表位位于37～49、16～28、1～13、11～24、30～43、42～50；Aβ1～42蛋白的T細胞表位位于3～11(675～683)、1～11(673～683)、22～31(696～705)、31～39(705～713)。B表位一般位于抗原分子的彈性區(qū)，具有可動性，這一特性有利于抗原表位和抗體結合部位表現(xiàn)出最佳的結構互補狀態(tài)。如果互補性提高，結合的親和力隨之增強。我們通過在線生物性信息學軟件和數(shù)據(jù)庫，對APP及Aβ1～42毒性片段進行親水性、柔韌性、抗原傾向性及抗原表面積暴露區(qū)域性進行B表位預測，分析得出APP蛋白潛在的B細胞表位位于49～62、 72～85、350～365、637～652；Aβ1～42蛋白的B細胞表位位于4～19(676～691)、26～39(700～713)、11～26(683～698)、26～41(698～713)。

本研究結果顯示APP及Aβ1～42均存在抗原的優(yōu)勢表位，且Aβ1～42的抗原優(yōu)勢表位與APP優(yōu)勢表位不同。針對AD中毒性片段Aβ1～42設計出更具有特異性的表位疫苗，并尋找出Aβ1～42的優(yōu)勢表位避免引入APP蛋白的優(yōu)勢表位，從而發(fā)揮更好的預防、治療作用。該結論為今后基于Aβ蛋白表位疫苗的設計奠定了理論基礎。

[1]Santos AN，Ewers M，Minthon L，et.al.Amyloid-β oligomers in cerebrospinal fluid are associated with cognitive decline in patients with Alzheimer's disease[J].J Alzheimers Dis.2012；29(1)：171-6.

[2]李大祥，鮮殊，楊衛(wèi)，等.茶葉的神經(jīng)保護作用研究進展[J].茶葉科學，2011，2：79-86.

[3]Gandy S.The role of cerebral amyloid beta accumulation in common forms of Alzheimer disease[J].J Clin Invest，2005，11 5(5)：1121-9.

[4]王芳，周愛民.β淀粉樣蛋白的研究進展[J].醫(yī)學綜述，2012，18(20)：3377-9.

[5]龐明泉.多房棘球蚴抗原蛋白Emy162及TSP3的抗原表位的預測及鑒定[D].青海大學，2016.

[6]Geourjon C and Deléage G.SOPMA.significant improvements in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments[J].Comput Appl Biosci，1995，11(6)：681-4.

[7]龐明泉，湯峰，周虎，等.多房棘球蚴抗原蛋白TSP3抗原表位的生物信息學預測[J].青海醫(yī)學院學報，2016，37(1)：01-8.

[8]Vaughan K，Peters B，Larche M，et al.Strategies to query and display allergy-derived epitope data from the immune epitope database[J].Int Arch Allergy Immunol，2013，160(4)：334-45.

[9]Sollner J，Grohmannr，Rapberger，et al.Analysis and prediction of protective continuous B-cell epitopes on pathogen proteins[J].Imm-unome Res，2008，4(1)：1.

[10]Shen ZG，Yan P，He W，et al.Prediction of the secondary structure and the B cell epitope of the extracellular domain of FSHR[J].Journal of Chongqing Medical University，2010，35：1317-20.

[11]Li Y，Liu X，Zhu Y，et al.Bioin formatic prediction of epitopes in the Emy162 antigen of Echinococcus multilocularis[J].Exp Ther Med，2013，6(2)：335-40.

[12]來魯華，徐筱杰，唐有祺.蛋白質(zhì)的結構預測與分子設計[J].大學化學，1993，8(5)：49.

[13]Testa JS，Shetty V，Hafner J，et al.MHC class I presented T cell epitopes identified by immunoproteomics analysis are targets for a cross reactive influenza specific T cell response[J].PLoS One，2012，7(11)：1-4.

Bioinformatic Prediction of Epitopes in The Amyloid β-Protein Antigen of Alzheimer′s Disease※

LIU jun-li1，2，3，4，TANG feng1，3，4，LIU chuan-chuan1，3，CUI sen2，3#，LI zhan-quan2，3&

(1.Research Center for Altitude Medicine；2.Qinghai University Affiliated Hospital； 3.The Key laboratory of high altitude medicine of Qinghai Province； 4.Qinghai-Utah Joint Research Lab for High Altitude Medicine，Xining 810000，China)

Objective The present study aims to predict the secondary structure and the T-and B-cell epitopes for the amyloid β-protein antigen，in order to reveal the dominant epitopes of the antigen.Methods The secondary structure of the protein was analyzed using SOPMA server.The T-cell and B-cell epitopes of APP and Aβ1～42 were predicted using IEDB，Syfpeithi，Bcepred and ABCpred online software.The characteristics of hydrophilicity，flexibility，antigenic propensity and exposed surface area were predicted.Result The α helix and extended strand accounted for 46.49% and 52.38% of the secondary structure of the APP and Aβ1～42 protein，respectively.This was indicative of the presence of potential dominant antigenic epitopes in these two proteins.The T-cell epitopes of APP and Aβ1～42 were analyzed by different bioinformatics methods.The high scoring T-cell epitopes of APP were located at positions 37～49，16～28，1～13，11～24，30～43 and 42～50；Aβ1～42 were 3～11(675～683，1～11(673～683)，22～31(696～705)，31～39(705～713)；B-cell epitopes of APP and Aβ1～42 were located at positions 49～62，72～85，350～365，637～652 and 4～19(676～691)，26～39(700～713)，11～26(683～698)，26～41(698～713)，respectively.Conclusions APP and Aβ1～42 have the potential advantage of antigenic epitopes，and their antigenic epitopes were different.If the epitope vaccine designed for A 1～42 has no effect on APP，it will provide a theoretical basis for the study of epitope vaccines in the future.

Alzheimer′s disease Amyloid Precursor protein Secondary structure Epitopes

※：青海省科技廳自然科學基金項目(2017-ZJ-771)；#：通信作者，教授，博士研究生導師，E-mail 13897284366@139.com；&：通信作者，教授，博士研究生導師 ，E-mail Li-zhanquan@163.com 劉軍莉(1977～)，女，漢族，甘肅籍，副主任醫(yī)師，在讀博士

R741

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.02.004

2017-4-26