孫瑞麗，朱淑霞，張燕燕，王行健

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，山東 濱州 256600)

[專題研究]

異甘草素對(duì)小兒腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制研究

孫瑞麗，朱淑霞，張燕燕，王行健

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，山東 濱州 256600)

目的 研究異甘草素對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其相關(guān)分子機(jī)制。方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，用不同濃度(0、10、20、40、60、80μmol/L)異甘草素處理，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。異甘草素處理24h、48h、72h后，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)FoxM1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 U251細(xì)胞經(jīng)過濃度為0、10、20、40、60、80μmol/L的異甘草素處理24h、48h及72h后，細(xì)胞增殖均不同程度地受到抑制。在相同作用時(shí)間，不同濃度之間細(xì)胞增殖情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為38.5、98.9、108.1，均P<0.05)；在相同異甘草素濃度，不同作用時(shí)間(24h、48h、72h)細(xì)胞增殖情況比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為11.4、20.8、43.1、53.9、30.4，均P<0.05)。不同濃度異甘草素作用于U251 細(xì)胞24h后，隨著異甘草素濃度的增加，細(xì)胞凋亡率增加(F=120.3，P<0.05)。不同濃度異甘草素處理U251細(xì)胞48h后，F(xiàn)oxM1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(71.2±5.1)%、(54.6±3.3)%、(35.4±4.1)%、(20.8±4.0)%，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=83.5，P<0.05)。結(jié)論 異甘草素體外可有效抑制U251細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其分子機(jī)制可能與下FoxM1基因的表達(dá)有關(guān)。

異甘草素；腦膠質(zhì)瘤；增殖；凋亡；FoxM1

腦膠質(zhì)瘤是小兒顱內(nèi)最常見的原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，具有惡性程度高、生長(zhǎng)增殖快、生存期短等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害患兒身體健康。目前其常規(guī)治療以手術(shù)治療為主、放化療為輔。但因腦膠質(zhì)瘤病理類型復(fù)雜，浸潤(rùn)范圍廣，與正常組織分界不清，目前手術(shù)切除困難，其復(fù)發(fā)率也較高；另外膠質(zhì)瘤對(duì)放射線敏感性較低，且傳統(tǒng)的化療藥物在殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞的同時(shí)又對(duì)人體正常細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的毒副作用，且易出現(xiàn)多藥耐藥，容易導(dǎo)致化療失敗。中藥治療毒性低、療效好，且能與其他化療藥物配伍使用，具有廣闊的應(yīng)用前景。異甘草素(Lsoliquiritigenin，ISL)是一種從甘草和蔥中提取的具有查耳酮結(jié)構(gòu)的甘草黃酮類化合物，具有廣泛的生物和藥理活性, 具有抗氧化[1]、抗腫瘤[2]，逆轉(zhuǎn)耐藥[3]、保護(hù)心血管[4]等屬性，其抗腫瘤作用是近年來的研究熱點(diǎn)。有研究證實(shí)，ISL能抑制人類前列腺癌[5]、肺癌[6]、白血病[1]及乳腺癌[2]等多種癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響較少報(bào)道。本試驗(yàn)初步觀察 ISL對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖與凋亡的影響，探討其可能的分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)，異甘草素(大連美侖生物技術(shù)有限公司)，RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó) Hyclone 公司)；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒(日本 TAKARA 公司)；四甲基偶氮唑[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT](碧云天生物技術(shù)有限公司)；流式細(xì)胞凋亡試劑盒(BD公司)；二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)Sigma公司)；PCR引物(生工生物工程上海有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

將U251細(xì)胞株置于含10%胎牛血清及含青霉素(濃度為100U/mL)、鏈霉素(濃度為0.1mg/mL)雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3天傳代1次。

1.2.2四甲基偶氮唑法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104/mL，每孔100μL接種于96孔板上。待細(xì)胞貼壁后，每組分別加入ISL，使其終濃度分別為0、10、20、40、60、80μmol/L。將各組細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、48h及72h后，每孔加入20μL(5mg/mL)MTT孵育4h，棄去培養(yǎng)基，加入150μL DMSO溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在490nm處的吸光度值(A490)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率(IR)=(1-實(shí)驗(yàn)組A490/空白組A490)×100%。

1.2.3細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 U251細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度2×105/孔接種于6孔板上，培養(yǎng)基終體積2.5mL，培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞，后用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌2次(780g離心5min)后棄上清，依次加入500μL結(jié)合緩沖液(binding buffer)懸浮細(xì)胞、5μL磷脂酰絲氨酸蛋白抗體-異硫氰酸酯(Annexin V-FITC)、5μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混勻，室溫避光反應(yīng)15min，1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)FoxM1 mRNA的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞接種于6孔板上，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，加入不同濃度(0、20、40、60μmol/L)異甘草素。分別于加藥48h后收集細(xì)胞，并提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA純度，A260/A280 =1.8～2.0，測(cè)定RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)兩步法檢測(cè)FoxM1 mRNA的表達(dá)情況，β-actin為內(nèi)參，引物序列為：正義鏈5′-TCAGGG￣ATGGTGAGAGATCC-3′，反義鏈 5′-GAATGGG￣CAAACCTTCA￣GTC-3′。FoxM1正義鏈5′-TGCAGCTA￣GGATTGAATCTTC-3′，反義鏈5′-GGAGCCCAGT￣CCATC￣AGAACT-3′。按下列條件進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，總共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組比較采用One-way ANOVA方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1異甘草素對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響

U251細(xì)胞經(jīng)0、10、20、40、60、80μmol/L的異甘草素處理24h、48h及72h后，細(xì)胞增殖均不同程度地受到抑制。在相同作用時(shí)間，不同濃度之間細(xì)胞增殖情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為38.5、98.9、108.1，均P<0.05)；在相同異甘草素濃度，不同作用時(shí)間(24h、48h、72h)細(xì)胞增殖情況比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為11.4、20.8、43.1、53.9、30.4，均P<0.05)。24h、48h、72h的半數(shù)抑制濃度(IC50)值逐漸縮小，分別(50.5±4.3)、(38.9±0.8)、(22.3±0.6)μmol/L。依據(jù)以上結(jié)果，篩選20、40、60μmol/L的異甘草素用于后續(xù)試驗(yàn)。不同濃度的異甘草素對(duì)U251細(xì)胞增殖抑制的影響見圖1。

圖 1 MTT法檢測(cè)不同濃度的異甘草素作用不同時(shí)間后人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251 細(xì)胞的增殖抑制率

Fig. 1 Proliferation inhibitory rates of U251 cells treated with ISL of different concentration (0, 10, 20, 40, 60, 80μmol/L) for different time detected by MTT

2.2異甘草素對(duì) U251細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度異甘草素(0、20、40、60μmol/L)作用于U251細(xì)胞24h后，AnnexinV-FITC/PI 染色雙法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，凋亡率分別為(3.2±0.6)%、(8.7±1.9)%、(19.3±2.5)%、(37.8±3.6)%，隨著藥物濃度的增加凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=120.3，P<0.05)，見圖2。

注：A為異甘草素0μmol/L，B 為異甘草素20μmol/L，C為異甘草素40μmol/L，D為異甘草素60μmol/L；隨著異甘草素濃度的增加，U251細(xì)胞凋亡率增加；凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率=右下象限+右上象限。

圖 2 不同濃度異甘草素作用24h 對(duì)U251 細(xì)胞凋亡的影響

Fig. 2 Effect of ISL of different concentration on cell apoptosis of U251 cells at 24h

2.3異甘草素對(duì)U251細(xì)胞FoxM1基因表達(dá)的變化

通過分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)FoxM1 mRNA的表達(dá)結(jié)果顯示，不同濃度的異甘草素(0、20、40、60μmol/L)處理U251細(xì)胞48h后，F(xiàn)oxM1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(71.2±5.1)%、(54.6±3.3)%、(35.4±4.1)%、(20.8±4.0)%，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=83.5，P<0.05)，見圖3。

圖 3 不同濃度異甘草素作用48h對(duì)U251細(xì)胞FoxM1 mRNA基因表達(dá)的影響

Fig. 3 Effect of ISL of different concentration on expression of FoxM1 mRNA of U251 cells at 48h

3討論

3.1兒童腦膠質(zhì)瘤的臨床特征及傳統(tǒng)治療的局限性

膠質(zhì)瘤是兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤，發(fā)病率為2.0/10萬(wàn)，發(fā)病高峰年齡為5～8歲，學(xué)齡前后發(fā)病較多，且統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)男孩多于女孩，比例約為1.3:1，該病具有發(fā)病率高、致死率高、復(fù)發(fā)率高及生存期短等特點(diǎn)[7]。膠質(zhì)瘤的臨床癥狀主要包括顱內(nèi)壓增高及腫瘤壓迫兩方面，如頭圍增大、頭痛、嘔吐、視物模糊、行走不穩(wěn)、生長(zhǎng)發(fā)育異常及局限性癲癇，后期表現(xiàn)為神經(jīng)方面功能缺失，如癱瘓等[8]。腦膠質(zhì)瘤常規(guī)治療包括手術(shù)切除、放療及化療。手術(shù)切除是其主要治療手段，但因兒童膠質(zhì)瘤位于中線部位居多，手術(shù)入路困難，術(shù)后并發(fā)癥多且嚴(yán)重。另外，放療對(duì)小兒正在發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)有難以預(yù)測(cè)的影響，所以有些待3歲后才能放療，因而化療逐漸成為治療兒童膠質(zhì)瘤的重要手段。目前，主要的化療藥物包括替莫唑胺、順鉑及甲氨蝶呤，但化療藥物毒副作用大且易產(chǎn)生耐藥，復(fù)發(fā)率極高，平均生存時(shí)間仍小于14個(gè)月。因此從天然藥物中尋找新的低毒、高效的靶向基因治療抗腫瘤藥物，是目前國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者亟待解決的重要問題。

3.2異甘草素抑制U251細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡

中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥在臨床上的應(yīng)用歷史悠久，博大精深。異甘草素屬于黃酮類化合物，廣泛存在于甘草等植物中，具有廣泛的生化學(xué)特性。近年來，異甘草素對(duì)前列腺癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤具有抑制作用，其抗腫瘤作用逐漸被重視。為了探討異甘草素是否抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及促進(jìn)凋亡，本研究以U251細(xì)胞為研究對(duì)象進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，U251細(xì)胞經(jīng)濃度為 0、10、20、40、60、80μmol/L的異甘草素處理24h、48h及72h后，細(xì)胞增殖均不同程度地受到抑制，呈顯著的劑量及時(shí)間依賴性。不同濃度異甘草素(0、20、40、60μmol/L)作用于U251細(xì)胞24h后，Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)U251細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，隨著異甘草素濃度的增加，細(xì)胞凋亡率增加。提示異甘草素能通過抑制U251細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腦膠質(zhì)瘤的作用。

3.3異甘草素抗腫瘤作用機(jī)制

多種基因參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展。叉頭框轉(zhuǎn)錄基因M1(forkhead box M1，F(xiàn)oxM1)是轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，該轉(zhuǎn)錄因子的作用涉及廣泛的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、分化，細(xì)胞周期及凋亡、損傷修復(fù)等，其表達(dá)失調(diào)在胃癌、宮頸癌等多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[9-10]。因此，F(xiàn)oxM1在多種腫瘤中被認(rèn)為是重要的分子標(biāo)志與治療的潛在靶標(biāo)，然而在腦膠質(zhì)瘤作用的研究報(bào)道少見。Liu等[11]研究了FoxM1表達(dá)水平與急性粒細(xì)胞白血病(myeloid leukemia，AML)患者的臨床特點(diǎn)及預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)FoxM1基因高表達(dá)與白血病危險(xiǎn)程度有關(guān)，且提示預(yù)后不良，因此FoxM1有望成為一個(gè)有前途的治療靶點(diǎn)及潛在的預(yù)后標(biāo)志。顏世舉等[12]研究表明FoxM1過表達(dá)能導(dǎo)致骨肉瘤的發(fā)生，沉默F(xiàn)oxM1 mRNA 基因的表達(dá)能夠顯著抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)凋亡。本試驗(yàn)通過RT-PCR法檢測(cè)FoxM1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，不同濃度的異甘草素(0、20、40、60μmol/L)處理U251細(xì)胞48h后，隨著異甘草素濃度增加，U251細(xì)胞中FoxM1 mRNA表達(dá)水平逐漸下降，提示異甘草素可能通過下調(diào)FoxM1 mRNA基因的表達(dá)，發(fā)揮其抗腦膠質(zhì)瘤的作用，其治療作用是否與FoxM1 mRNA基因有關(guān)還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究證實(shí)異甘草素顯著抑制U251細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其相關(guān)機(jī)制可能與下調(diào)FoxM1基因的表達(dá)有關(guān)。本試驗(yàn)初步證明了異甘草素的抗腦膠質(zhì)瘤作用，為異甘草素應(yīng)用于腦膠質(zhì)瘤的治療提供了理論依據(jù)。

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[專業(yè)責(zé)任編輯:孫 新]

Effects of isoliquiritigenin on proliferation and apoptosis in children glioma cells and its possible mechanisms

SUN Rui-li, ZHU Shu-xia, ZHANG Yan-yan, WANG Xing-jian

(Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Shandong Binzhou 256600, China)

Objective To study the influence of isoliquiritigenin (ISL) on U251 cell proliferation and apoptosis and its relevant molecular mechanisms. Methods U251 cells in logarithmic phase were extracted and cultured with different concentration of ISL (0, 10, 20, 40, 60, 80μmol/L), and every concentration was provided with 5 holes. Cell proliferation was detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and cell apoptosis was measured by flow cytometry after treatment for 24h, 48h and 72h. Expression level of FoxM1 mRNA was determinated by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results Proliferation of U251 cell was inhibited at different degree at 24h, 48h or 72h after being disposed in ISL with concentration of 0, 10, 20, 40, 60, 80μmol/L. Difference in cell proliferation in different concentration of ISL for same action time had statistical significance (Fvalue was 38.5, 98.9 and 108.1, respectively, allP<0.05). Difference in cell proliferation in same concentration of ISL for different action time (24h, 48h, 72h) was statistically significant (Fvalue was 11.4, 20.8, 43.1, 53.9 and 30.4, respectively, allP<0.05). After U251 cells were disposed in different concentration of ISL for 24 hours, cell apoptosis rate increased with increase of ISL concentration (F=120.3,P<0.05). FoxM1 mRNA expression level was 71.2±5.1%, 54.6±3.3%, 35.4±4.1% and 20.8±4.0%, respectively when U251 cell disposed in different concentration of ISL for 48h, and difference was statistically significant (F=83.5,P<0.05). Conclusion ISL could inhibit proliferation and induce apoptosis of U251 cells in vitro. Its molecular mechanism is related with down-regulation of FoxM1 expression.

isoliquiritigenin (ISL); brain glioma; proliferation; apoptosis; FoxM1

2017-02-19

濱州市軟科學(xué)資助項(xiàng)目(2016BRK18)

孫瑞麗(1990-)，女，在讀碩士研究生，主要從事兒童神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

朱淑霞，副主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.06.002

R739.4

A

1673-5293(2017)06-0624-03