李天清 王軍 馮亞非 張揚(yáng) 馬真勝 嚴(yán)亞波 雷偉

第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，陜西 西安 710032

隨著顯微成像技術(shù)(包括μCT，μMRI)廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究和臨床初期研究，研究者們已經(jīng)能夠獲得骨骼的微觀三維空間結(jié)構(gòu)。通過(guò)μCT采集后的數(shù)據(jù)，可以保存為標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)數(shù)字通信圖像格式(the digital imaging and communications in medicine，DICOM)。圖像為斷層圖像格式，層與層之間間隔一定距離(層距)。通過(guò)閾值分割，提取出μCT圖像中的骨骼部分。計(jì)算松質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)學(xué)指標(biāo)。傳統(tǒng)的參數(shù)評(píng)價(jià)方法主要評(píng)估：骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)，骨表面積體積比(BS/BV)，骨小梁平均寬度(Tb.Th)，骨小梁數(shù)量(Tb.N)，骨小梁平均間隙(Tb.Sp)等。顯微CT(micro computer tomography，μCT)掃描結(jié)合顯微有限元(large-scale finite element, LSFE)模型是一種無(wú)創(chuàng)的在體檢測(cè)骨生物力學(xué)特性的手段[1]，可以用來(lái)輔助骨質(zhì)疏松骨折風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)藥物治療效果。然而，目前關(guān)于準(zhǔn)確測(cè)量松質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)參數(shù)和在臨床實(shí)踐中應(yīng)用結(jié)構(gòu)參數(shù)的研究很少。本研究的目的是探討人體脊柱松質(zhì)骨骨骼顯微結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能的區(qū)域性差異。

本研究采集了6具人體頸椎椎體松質(zhì)骨標(biāo)本，進(jìn)行顯微CT掃描后，應(yīng)用結(jié)構(gòu)參數(shù)測(cè)量、顯微有限元分析、力學(xué)參數(shù)計(jì)算方法，研究人椎體內(nèi)解剖部位對(duì)于結(jié)構(gòu)參數(shù)和力學(xué)參數(shù)測(cè)量結(jié)果的影響。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本制備

采集6個(gè)人頸椎C5椎體標(biāo)本(表1)。標(biāo)本來(lái)自第四軍醫(yī)大學(xué)解剖學(xué)教研室。在進(jìn)行μCT掃描前，通過(guò)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行篩查排除可能的代謝性骨病、骨腫瘤。拍攝X線平片，以確保沒(méi)有骨骼損壞或者其他骨病。應(yīng)用口腔鋸切除側(cè)塊和后方結(jié)構(gòu)(包括椎弓根、橫突、后弓、棘突，圖1)。

表1 標(biāo)本年齡和性別Table 1 The age and sex of the specimen

圖1 椎體分離過(guò)程 Fig.1 The separation process of vertebral bodyA.頸椎椎體的分離；B.第五頸椎；C和D:切除后方結(jié)構(gòu)的示意圖。

1.2 μCT掃描

椎體放置在圓形的掃描杯中，周圍用泡沫塑料填充，以防止在掃描過(guò)程中標(biāo)本移動(dòng)。在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍骨科研究所，應(yīng)用臨床前圓錐光束CT掃描儀(Healthcare Explore Locus, GE Medical Systems, Milwaukee, USA)進(jìn)行μCT掃描。該μCT是一個(gè)基于CCD的攝像頭，通過(guò)固定的角速度采集平片圖像。其旋轉(zhuǎn)角度因掃描方式的不同而變化，一般為180°到360°。掃描儀的視窗為一個(gè)邊長(zhǎng)為4 cm的立方體。調(diào)整標(biāo)本在掃描儀中的位置，確保整個(gè)標(biāo)本落入視窗范圍內(nèi)。掃描參數(shù)包括：①球管電壓為80 kV；②電流為250 μA；③快門速度為2500 ms；④重建因子為2；⑤旋轉(zhuǎn)角度為180°。在進(jìn)行濾波和空氣校正后，應(yīng)用濾波反向投影算法進(jìn)行重建，重建結(jié)果為立體分辨率為42 μm的圖像。

圖2 μCT掃描后選擇ROI并進(jìn)行三維重建Fig.2 ROI selection and three-dimensional reconstruction after CT scanA.μCT下椎體的矢狀位切片；B.ROI；C和D.ROI的三維重建圖

1.3 椎體子區(qū)域提取結(jié)構(gòu)參數(shù)

對(duì)掃描所得的μCT圖像進(jìn)行三維重建后，每個(gè)椎體的幾何結(jié)構(gòu)被劃分為12個(gè)邊長(zhǎng)為4.6 mm的立方體子域。每個(gè)椎體子域的編號(hào)方法如圖3所示。依據(jù)位置的不同，12個(gè)子域被劃分為6個(gè)不同的位置組，每個(gè)位置組中包含不同的子域。6個(gè)位置組包括外側(cè)子域組(包括5、6、11、12子域)，內(nèi)側(cè)子域組(包括1、2、3、4、7、8、9、10子域)，腹側(cè)子域組(包括1、3、7、9子域)，背側(cè)子域組(包括2、4、5、6、8、10、11、12子域)，頭側(cè)子域組(包括1、2、3、4、5、6子域)，尾側(cè)子域組(包括7、8、9、10、11、12子域)。

在圖像處理領(lǐng)域，Nyquist采樣率規(guī)定了圖像樣本的最低空間采樣率。依據(jù)Nyquist采樣率法則，樣本體積至少是所要采取的目標(biāo)樣本的最小特征的2倍。在松質(zhì)骨，骨骼的最小特征是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)參數(shù)來(lái)表達(dá)的，包括模型的骨小梁厚度和骨小梁分割度(Tb.Th和Tb.Sp)，因此子域的最小尺寸應(yīng)該是2倍的Tb.Th+Tb.Sp長(zhǎng)度。依據(jù)Hildebrand等的研究結(jié)果，Tb.Th和Tb.Sp的平均值分別為0.3 mm和0.8 mm。因此，在本研究中，掃描分辨率42 μm時(shí)，子域的一邊長(zhǎng)度包括110個(gè)體素(對(duì)應(yīng)為4.6 mm)，大約包含4個(gè)Tb.Th和Tb.Sp。

1.4 結(jié)構(gòu)參數(shù)和個(gè)體化骨小梁分割方法

松質(zhì)骨標(biāo)本的結(jié)構(gòu)參數(shù)包括骨體積分?jǐn)?shù)BV/TV、骨表面積體積比(BS/BV)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)，在本試驗(yàn)中應(yīng)用μCT自帶的軟件MicroView (Healthcare Explore Locus, GE Medical Systems, Milwaukee, USA)來(lái)測(cè)量這些標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)。

個(gè)體化骨小梁分割方法(individual trabeculae segmentation, ITS)是用來(lái)從μCT掃描得到的三維圖像中提取出單個(gè)骨小梁，分析不同的骨小梁結(jié)構(gòu)類型(板狀或者桿狀)對(duì)整個(gè)組織結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)。在松質(zhì)骨中，板狀骨小梁和桿狀骨小梁是決定松質(zhì)骨力學(xué)特點(diǎn)的兩種重要的顯微結(jié)構(gòu)特征。ITS方法可以用來(lái)評(píng)價(jià)子域中的骨小梁方向和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。ITS方法最早由哥倫比亞大學(xué)的Liu等[2]提出，在本研究中，我們用17個(gè)松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)參數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)每個(gè)子域的骨小梁結(jié)構(gòu)。子域的骨骼分割方法應(yīng)用大津法[3]所獲得全局閾值。如前所述，大津法是目前最成熟、應(yīng)用最廣的圖像分割方法。在圖像提取完后，應(yīng)用ITS方法(ITS, Columbia University, Milwaukee, USA)計(jì)算子域的結(jié)構(gòu)參數(shù)。本方法中，關(guān)于每個(gè)參數(shù)的計(jì)算方法見(jiàn)表2。

圖3 頸椎椎體子域編號(hào)方法Fig.3 Regional numbers of the cervical vertebral bone

1.5 顯微有限元模型計(jì)算的正交各向異性的彈性模量

應(yīng)用Simpleware(Simpleware Ltd., Exter, UK)軟件將子域的每個(gè)體素直接轉(zhuǎn)化為8節(jié)點(diǎn)6面體單元。設(shè)置松質(zhì)骨的組織屬性是各項(xiàng)同性的，線性彈性材料，其彈性模量為15GPa，泊松比為0.3.應(yīng)用ANSYS(ANSYS Inc., Canonsburg, PA, USA)軟件中的預(yù)設(shè)共軛梯度求解器(preconditioned conjugate gradient solver, PCG)求解。每個(gè)模型進(jìn)行6次仿真計(jì)算，沿著3個(gè)正交軸(x軸, y軸和z軸)模擬3個(gè)軸向壓縮實(shí)驗(yàn)和3個(gè)剪切試驗(yàn)。從模擬壓縮試驗(yàn)中，可以得到一般各向異性材料的剛度矩陣，然后通過(guò)優(yōu)化方法來(lái)計(jì)算材料的最佳正交軸。通過(guò)將各向異性剛度矩陣轉(zhuǎn)換一定的角度獲得正交矩陣。整理彈性模量和剛度矩陣，在本研究中，Eyy代表最低軸向模量的方向，Ezz代表最高軸向模量的方向。然后從正交矩陣中，計(jì)算出正交彈性張量的3個(gè)彈性模量(Eyy，Exx，Ezz)和3個(gè)剪切模量(Gxy,Gxz,Gyz)。

表2 ITS方法計(jì)算的17個(gè)結(jié)構(gòu)參數(shù)的描述和算法Table 2 Characterizations of the 17 parameters calculated with ITS method

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)比較結(jié)構(gòu)參數(shù)和松質(zhì)骨的表觀剛度在不同部位的差異，以P<0.05為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

從表3 來(lái)看，腹側(cè)和背側(cè)的結(jié)構(gòu)參數(shù)僅有rBV/TV、R-R junc、tBV/TV存在差異，外側(cè)和內(nèi)側(cè)的結(jié)構(gòu)參數(shù)僅有pTb.Th、rTb.Th、P-P Junc、R-P Junc、lBV/TV不存在差異，頭側(cè)和尾側(cè)的結(jié)構(gòu)參數(shù)均存在明顯差異。代表骨質(zhì)增多的指標(biāo)，在尾側(cè)均大于頭側(cè)，比如BV/TV、rBV/TV、pBV/TV、Tb.Th、Tb.N。

從表4來(lái)看，腹側(cè)和背側(cè)的表觀彈性模量沒(méi)有差異，表觀剪切模量存在差異；外側(cè)和內(nèi)側(cè)的表觀彈性模量在非主方向上存在顯著差異，在主方向上無(wú)顯著差異，表觀剪切模量無(wú)顯著差異；頭側(cè)和尾側(cè)的表觀彈性模量在主方向上存在顯著差異。

表3 頸椎椎體松質(zhì)骨不同解剖部位的結(jié)構(gòu)參數(shù)及差異Table 3 Microarchitectural parameters of different anatomical regions in the cervical vertebral bone

表4 不同解剖部位的表觀彈性模量及差異Table 4 Apparent elastic modulus values of different anatomical regions in the cervical vertebral bone

3 討論

在本研究中，我們探討了在人體椎體松質(zhì)骨中，結(jié)構(gòu)參數(shù)和表觀強(qiáng)度在不同解剖部位的差異。發(fā)現(xiàn)這些指標(biāo)均在頭側(cè)和尾側(cè)有顯著性差異。說(shuō)明結(jié)構(gòu)參數(shù)和表觀強(qiáng)度在人體脊柱的椎體松質(zhì)骨存在顯著的區(qū)域性差異。而常規(guī)的文獻(xiàn)報(bào)道只是模糊的報(bào)道了某個(gè)解剖部位的μCT研究。在本研究中，應(yīng)用顯微CT研究了常規(guī)的5個(gè)結(jié)構(gòu)參數(shù)和17個(gè)應(yīng)用ITS方法測(cè)量的特殊結(jié)構(gòu)參數(shù)在人體頸椎不同解剖部位的差異。我們主要的結(jié)果是：①在頸椎椎體松質(zhì)骨，頭側(cè)和尾側(cè)的結(jié)構(gòu)參數(shù)均存在顯著差異，其余部位的結(jié)構(gòu)參數(shù)無(wú)顯著差異。②在頸椎椎體松質(zhì)骨，頭側(cè)和尾側(cè)的表觀彈性模量在主方向上存在顯著差異；此外外側(cè)和內(nèi)側(cè)的表觀彈性模量在非主方向上存在顯著差異，在主方向上無(wú)顯著差異，表觀剪切模量無(wú)顯著差異。

本研究中觀察到，頭側(cè)和尾側(cè)的結(jié)構(gòu)參數(shù)和力學(xué)參數(shù)的區(qū)別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。頭-尾方向是椎體松質(zhì)骨承受載荷的主要方向[4]。也是骨小梁分布的主要方向。在椎體的頭側(cè)或者尾側(cè)采樣會(huì)導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果的顯著不同。這個(gè)差異在臨床應(yīng)用中具有實(shí)際的指導(dǎo)意義，提示在影像學(xué)檢查或者活檢采樣中應(yīng)該盡量采集沿頭-尾側(cè)長(zhǎng)度的樣本。如果采集的樣本尺寸過(guò)小，不能同時(shí)覆蓋頭側(cè)和尾側(cè)的組織，可能會(huì)帶來(lái)較大的采樣誤差。

對(duì)這種區(qū)域性差異的一種合理的解釋就是局部的生物力學(xué)環(huán)境的不同。尤其是對(duì)于椎體松質(zhì)骨部分。在日程生活中，人體無(wú)論在運(yùn)動(dòng)或者靜止的狀態(tài)下，負(fù)載主要沿著椎體部分垂直傳播。因此，越靠近尾側(cè)的松質(zhì)骨，承受的壓力負(fù)載越大。依據(jù)Wolff定律：骨質(zhì)量和結(jié)構(gòu)總是適應(yīng)力學(xué)載荷的形式[5]。此外，骨小梁的結(jié)構(gòu)參數(shù)與組織水平的力學(xué)屬性相一致[6]。因?yàn)樽刁w的骨小梁部分大約承受60%的軸向載荷，骨小梁結(jié)構(gòu)也與周圍的局部環(huán)境相適應(yīng)。事實(shí)上，在尾側(cè)區(qū)域的骨小梁的厚度更大，其孔隙率更小，密度更大，各向異性更大。這個(gè)研究結(jié)果也與腰椎的研究結(jié)果相似[7]。

與一般的總體的顯微結(jié)構(gòu)研究相比，關(guān)于顯微結(jié)構(gòu)區(qū)域性差異的分析也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。例如，在典型的椎體軸向暴力導(dǎo)致的爆裂性骨折中，應(yīng)力沿著椎體向下傳遞，從而導(dǎo)致在椎體的薄弱部位產(chǎn)生高的應(yīng)變能密度[8]。這個(gè)與本研究顯微結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果相吻合。尤其對(duì)于老年女性，骨折多發(fā)生于骨骼結(jié)構(gòu)比較薄弱的部位[9]。局部骨骼屬性的區(qū)域差異性分析結(jié)合動(dòng)力學(xué)分析，可以為骨折的預(yù)防方法提供重要參考。

本研究表明骨骼結(jié)構(gòu)在空間上不是均勻分布的。在尾側(cè)有較優(yōu)的結(jié)構(gòu)參數(shù)和較高的彈性模量。隨著年齡的增大，松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)逐漸疏松，這種差異會(huì)變得更加明顯。這種情況在絕經(jīng)后的女性可能更加嚴(yán)重，因?yàn)榇萍に厮降慕档蜁?huì)導(dǎo)致骨量丟失，反映在μCT上就是BV/TV、 Tb.Th和Tb.N的降低和Tb.Sp的增高[10]。我們的研究結(jié)果與之前Ito等[11]發(fā)表的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

本研究的局限性在于對(duì)子域的劃分具有隨意性。但是，由于人體的椎體松質(zhì)骨是正交各向異性的，因此這個(gè)劃分方法與解剖系統(tǒng)和人體的載荷方位相一致。測(cè)量的部位從椎體的核心向周圍擴(kuò)展，這么做的主要目的是盡量選擇松質(zhì)骨而不會(huì)接觸到皮質(zhì)骨殼而造成誤差。我們下一步的研究希望能夠建立一個(gè)松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)參數(shù)和力學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系，并研究這個(gè)關(guān)系的區(qū)域性差異，為臨床診斷和活檢提供進(jìn)一步參考。