張倫，楊申明，徐成東，王飛，胡小安*

(1.楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南楚雄675000；2.南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，南京210037)

滇橄欖樹不同組織原花色素質(zhì)量濃度及抗氧化性能研究

張倫1，楊申明1，徐成東1，王飛2，胡小安1*

(1.楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南楚雄675000；2.南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，南京210037)

原花色素是最有效的自由基清除劑之一，具有非常強(qiáng)的清除自由基和抗氧化的能力。以云南地區(qū)滇橄欖樹為原料，采用超聲波提取法，對其樹皮、樹芯、樹枝、樹葉的原花色素質(zhì)量濃度進(jìn)行了研究，并對樹枝原花色素的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。其次，對樹皮原花色素抗氧化能力及與維生素C(vitamin C, VC)的抗氧化協(xié)同作用進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：樹枝的原花色素質(zhì)量濃度最高，其次是樹皮、樹葉、芯材。同時(shí)，樹枝中原花色素提取的最佳條件為：以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的乙醇為提取劑，料液比1∶7，提取溫度60℃，提取時(shí)間30 min，在此條件下原花色素的提取率能達(dá)到3.85%。滇橄欖樹皮提取物具有很強(qiáng)的抗氧化性，清除DPPH自由基的能力最佳，原花色素質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，自由基清除率高達(dá)88.55%，且抗氧化有效成分主要集中在乙酸乙酯層，水層仍然含有部分抗氧化成分。原花色素和VC以質(zhì)量比為3∶1,1∶1,1∶3進(jìn)行復(fù)配后的自由基最高清除率分別為88.84%，91.27%，91.05%，協(xié)同作用強(qiáng)弱順序?yàn)?∶1>1∶3>3∶1。

滇橄欖；不同組織；原花色素；抗氧化性

滇橄欖(PhyllanthusemblicaLinn.)又名云南余甘子，是大戟科落葉灌木的果實(shí)，主要生長在熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。云南省是全國野生滇橄欖分布最廣、產(chǎn)量最高的省份之一[2]。在工業(yè)生產(chǎn)中，滇橄欖樹皮僅作為生產(chǎn)上等的栲膠原料，而樹皮含有多種藥食和保健的有機(jī)活性物質(zhì)[3-4]，如果膠、胡蘿卜素、核黃素、生物堿、有機(jī)酸和單寧等[5]。滇橄欖的根、葉、樹皮皆可入藥[1]，若只作為工業(yè)栲膠原料開發(fā)利用價(jià)值很低而且單一，造成很大的資源浪費(fèi)。原花色素(proanthocyanidins)是植物體內(nèi)形成的，普遍存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)中，它能在熱酸處理下生成花色素的物質(zhì)，是一種很好的氧自由基清除劑和脂質(zhì)過氧化抑制劑。原花色素具有清除自由基抗氧化的功能[6-7]，這是由于原花色素分子結(jié)構(gòu)單元芳香環(huán)有多個(gè)鄰、間位活性酚羥基，易于釋放H·給各類自由基，并終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而防止氧化，起到預(yù)防衰老、治療和預(yù)防心血管疾病及美白防曬等方面的作用[8-9]。

目前，國內(nèi)外提取原花色素方法有多種，如用脫氧去離子、有機(jī)溶劑、超臨界流體、微波[10]等方法。超聲提取技術(shù)是近年對植物有效成分提取分離中的一種提取手段，因提取時(shí)間短、效率高而廣泛應(yīng)用[11]。本研究以橄欖樹皮為材料，采用超聲波輔助乙醇回流浸提法進(jìn)行滇橄欖樹不同部位原花色素的提取。通過單因素和正交試驗(yàn)篩選出最佳因素，通過方差與極差分析得到原花色素的最佳提取工藝條件，對比滇橄欖樹皮不同部位原花色素質(zhì)量濃度，以期為原花色素的下一步開發(fā)利用提供依據(jù)，同時(shí)對云南地區(qū)滇橄欖資源和促進(jìn)山區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

在大理南澗隨機(jī)選取4～5年生植株，采摘時(shí)間為8月，采摘量各為5 kg的橄欖樹皮、樹干、樹枝、葉。原料在50～60℃的恒溫箱中烘干，粉碎，過篩(0.25～0.60 mm)，備用；無水乙醇、濃硫酸、香草醛、DPPH溶液、維生素C(vitamin C, VC)均為分析純。

實(shí)驗(yàn)所用儀器有電子分析天平、DFY-500搖擺式高速中藥粉碎機(jī)、KB5200型超聲波清洗器(超聲功率200 W，頻率40 kHz)、HH-S2恒溫水浴鍋、SHZ-A循環(huán)水式真空泵、Alpha-1502紫外可見分光光度計(jì)(上海譜元儀器有限公司制造)。

1.2 原花色素提取與純化

樹皮、樹干、樹枝分別剝離自然晾干，在50～60℃的恒溫箱中烘干粉碎過0.25 mm篩得粉末，在60℃下，以60%乙醇提取(超聲波輔助提取)30 min，然后進(jìn)行抽濾，濾液烘干至質(zhì)量恒定(50℃)并稱質(zhì)量(分析天平)，取樣按標(biāo)準(zhǔn)曲線配成溶液測吸光度。

將粗提物用5%乙醇配成溶液，用3倍體積的乙酸乙酯萃取→將酯層和水層過AB-8大孔吸附樹脂→用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乙醇(20%，30%，40%，50%及無水乙醇)洗脫→洗脫液蒸干成粉末→測定抗氧化性。

1.3 原花色素質(zhì)量濃度及抗氧化性的測定

原花色素測定：以香草醛-硫酸法[12]測定原花色素的質(zhì)量濃度?？瞻诪? mL甲醇+5 mL 3%香草醛-甲醇溶液+5 mL硫酸-甲醇溶液；樣品為1 mL樣品甲醇溶液+5 mL 3%香草醛-甲醇溶液+5 mL硫酸-甲醇溶液，避光反應(yīng)30 min，測定500 nm處吸收值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算原花色素的質(zhì)量濃度。

根據(jù)質(zhì)量濃度分別計(jì)算出滇橄欖樹皮中原花色素的提取率。原花色素提取率公式：

式中：m1為提取物總質(zhì)量，mg；m2為樹皮質(zhì)量，mg；C為提取物中原花色素質(zhì)量濃度，mg/mL；W為樹皮含水率，%。

原花色素抗氧化性測定:清除二苯基苦基肼自由基(DPPH·, 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl)法[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 兒茶素質(zhì)量濃度與吸光度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of absorbance vsconcentration of catechin

以兒茶素為標(biāo)樣，配置1 mg/mL的兒茶素/甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液；配成不同濃度；準(zhǔn)確配置3%的香草醛-甲醇溶液與30%的硫酸-甲醇溶液；在反應(yīng)體系0.5 mL標(biāo)樣+2.5 mL 3%香草醛+2.5 mL 30%硫酸；溫度為30℃下避光反應(yīng)30 min，后測其在500 nm處的紫外吸收值，空白樣為0.5 mL的甲醇。根據(jù)方法所繪出的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

根據(jù)兒茶素/甲醇標(biāo)樣測出吸光度后做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線表達(dá)式是y=3.516x+0.117，R2=0.993 5。測出原花色素樣液的吸光度后，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及提取率公式計(jì)算出原花色素的提取率，最后根據(jù)提取率確定最佳提取條件。

2.2 滇橄欖樹不同部位原花色素質(zhì)量濃度的差異

滇橄欖樹不同部位原花色素含量見圖2。

圖2 滇橄欖樹不同部位原花色素質(zhì)量濃度及提取率Fig. 2 Content and extraction yield of proanthocyanidins at different parts from Phyllanthus emblica

由圖2可知，滇橄欖樹不同部位原花色素質(zhì)量濃度順序：樹枝>樹皮>樹葉>樹干。原花色素提取率順序也同樣為：樹枝>樹皮>樹葉>樹芯。原花色素的分布及聚合度依植物種類和組織部位而異，在許多植物的非種子組織中是以可溶而無色的混合物存在，而木本植物中的原花色素主要存在于樹皮及枝葉中[14]。本研究中的樹枝為無法再分離出樹芯的小樹枝，因此，滇橄欖樹原花色素主要集中在樹皮中，且樹枝部位的樹皮原花色素質(zhì)量濃度要高于樹芯位置的樹皮。

2.3 不同提取條件對原花色素提取率的影響

研究了乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、料液比等對原花色素提取率的影響。以0.25 mm樹枝原料，料液比為1∶10，在70℃下超聲波輔助提取30 min，研究了不同濃度乙醇對原花色素提取率的影響；以0.25 mm樹枝原料，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶6，提取溫度為60℃，研究了不同提取時(shí)間對原花色素提取率的影響；以0.25 mm樹枝原料，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶6，超聲波輔助提取30 min，研究了不同提取溫度對原花色素提取率的影響；以0.25 mm樹枝原料，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的乙醇為提取劑，提取溫度為40℃，超聲波輔助提取時(shí)間為30 min，研究了不同料液比對原花色素提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同因素對滇橄欖樹枝原花色素提取率的影響Fig. 3 Effects of different factors on the extraction yield of proanthocyanidins from Phyllanthus emblica branch

由圖3可以看出，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對樹枝中原花色素有直接影響。在料液比、提取溫度、提取時(shí)間、粒度目數(shù)一定的前提下，原花色素的提取率隨乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，原花色素的提取率最大，提取率為2.220%。隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步提高，提取率逐步減少。這是由于隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，一些醇溶性的雜質(zhì)、親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，這些成分與原花色素競爭同乙醇-水分子結(jié)合從而導(dǎo)致提取率下降，所以選擇60%為最佳乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)。對于提取時(shí)間，提取30 min時(shí)原花色素的提取率最大，并隨著提取時(shí)間的增加，提取率逐漸減少。這是由于提取時(shí)間過長，原花色素在溶液中長時(shí)間受熱可使酚結(jié)構(gòu)被破壞。因此選擇30 min為最佳提取時(shí)間，其提取率為3.545%。對于提取溫度，溫度的增加能使分子運(yùn)動(dòng)速率加快，滲透、擴(kuò)散、溶解速率加快，但是過高的溫度會(huì)導(dǎo)致原花色素的結(jié)構(gòu)被氧化破壞。滇橄欖樹枝原花色素的提取率隨提取溫度的影響先增大后減小，溫度為60℃時(shí)，原花色素的提取率最高，到達(dá)3.828%。料液比對提取率也有很大影響，溶劑量增加提取率增加，但過多的溶劑會(huì)造成浪費(fèi)，其次醇溶性雜質(zhì)增加而影響提取率。本研究樹枝中原花色素的提取率隨料液比的影響先增大后減小。當(dāng)料液比為1∶6時(shí)，原花色素的提取率最高，達(dá)到2.221%。與黑荊樹皮、毛楊梅樹皮、馬尾松樹皮等其他木本植物相比，滇橄欖樹各部位中的原花色素較少。

2.4 原花色素提取工藝條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以原花色素提取率為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)方法對原花色素提取工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 因素水平

通過正交試驗(yàn)方差分析可看出(表2)，提取溫度、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比3個(gè)因素對原花色素提取率的影響為料液比>提取溫度>乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，得出最佳工藝條件組合為A2B2C3，即：提取溫度為60℃，乙醇濃度為60%，料液比1∶7，提取時(shí)間為30 min時(shí)提取率最高達(dá)到3.85%±0.001%，且同條件下的4個(gè)平行樣中，不存在顯著性差異。

表2 正交試驗(yàn)對滇橄欖樹枝原花色素提取率的影響

2.5 初級分離產(chǎn)物抗氧化活性的比較

滇橄欖樹皮中提取出的原花色素具有很強(qiáng)的自由基清除能力。近年來人們對數(shù)十種植物的二聚體、三聚體、四聚體等低聚和高聚體原花色素進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)原花色素有效成分主要集中在單體或低聚物部分[15-16]。而經(jīng)過乙酸乙酯、樹脂等萃取過的原花色素經(jīng)研究主要含有低聚原花色素[17]。因此本研究將粉碎粒度為0.25 mm的滇橄欖樹皮粉末，采用最佳工藝條件提取出的原花色素以乙酸乙酯進(jìn)行萃取。由于植物有機(jī)溶劑粗提物雜質(zhì)多，需要進(jìn)一步去除雜質(zhì)而進(jìn)行分離與純化。具體的分離與純化方法隨著植物有效成分的不同而不同。本研究將經(jīng)過乙酸乙酯萃取得到的原花色素采用AB-8大孔吸附樹脂進(jìn)行分離。探討未上柱前的原花色素乙酸乙酯層、乙酸乙酯層萃取后進(jìn)行上柱，被樹脂吸附后的流出液、VC以及乙酸乙酯萃取時(shí)的水層進(jìn)行抗氧化比較分析，結(jié)果見圖4。

圖4 原花色素不同分離產(chǎn)物的DPPH清除率Fig. 4 DPPH scavenging rates of proanthocyanidins with different extraction agents

從圖4中可以看出，水層中的原花色素質(zhì)量濃度達(dá)到70 μg/mL時(shí)都不如酯層10 μg/mL時(shí)抗氧化效果好。說明滇橄欖樹皮提取物中抗氧化有效成分主集中在酯層，水層仍然含有部分原花色素。這是由于酯層中主要為原花色素低聚物，而水層中主要為高聚物[18]。其次，上樣后流出液清除DPPH自由基的能力顯著降低，說明質(zhì)量濃度(或清除作用)較小，其抗氧化效果甚至不如水層，有效成分已經(jīng)被樹脂吸附。再次，當(dāng)原花色素質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí),未上柱的乙酸乙酯層就已經(jīng)與VC質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)的效果相當(dāng)，說明滇橄欖樹皮中原花色素具有很強(qiáng)清除DPPH自由基的能力。但是隨著原花色素質(zhì)量濃度的增加其清除效果卻未繼續(xù)增加，說明原花色素質(zhì)量濃度與清除效果并不成線性關(guān)系。未上柱的乙酸乙酯層原花色素清除DPPH自由基能力的質(zhì)量濃度為10 μg/mL，清除率已達(dá)到最大為88.55%。對滇橄欖樹皮提取物初級分離產(chǎn)物的抗氧化活性比較，為后續(xù)有效成分的分離提純提供參考。

2.6 不同濃度乙醇洗脫(乙酸乙酯層)產(chǎn)物與未上柱酯層抗氧化活性的比較

由于不同濃度乙醇洗脫產(chǎn)物具有不同的原花色素結(jié)構(gòu)。為了確定抗氧化活性最強(qiáng)的原花色素洗脫產(chǎn)物，將原花色素乙酸乙酯層樣品過AB-8大孔吸附樹脂柱，然后用一定乙醇濃度進(jìn)行解吸，分別收集洗脫液并測定其洗脫液中抗氧化性，結(jié)果見圖5。

圖5 原花色素不同濃度洗脫產(chǎn)物對DPPH的清除率Fig. 5 DPPH scavenging rates of proanthocyanidins eluted with different concentrations

從圖5可以看出，用20%，30%，40%，50%及無水乙醇洗脫產(chǎn)物后，抗氧化有效成分主要集中在20%，30%，40%洗脫成分上。50%乙醇洗脫液清除率較低，這是因?yàn)椴煌囊掖枷疵摮煞衷ㄉ亟Y(jié)構(gòu)不同，此結(jié)果為后續(xù)洗脫成分結(jié)構(gòu)的檢測與抗氧化性機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。而經(jīng)過洗脫后的成分抗氧化性能并不如未洗脫的乙酸乙酯層抗氧化性好。因此推測不同結(jié)構(gòu)的原花色素抗氧化時(shí)具有一定協(xié)同作用。由于原花色素與VC單獨(dú)作用的抗氧化效果都很好，所以將未進(jìn)行洗脫分離的乙酸乙酯層與VC以適量濃度進(jìn)行復(fù)配，比較其抗氧化活性。

2.7 VC與未上柱的乙酸乙酯層原花色素復(fù)配下抗氧化活性的比較

將VC與未上柱的乙酸乙酯層原花色素按照一定比例進(jìn)行復(fù)配，考察其復(fù)配后的抗氧化效果、復(fù)配的劑量以及最佳的復(fù)配比例，結(jié)果見表3。

表3 VC與未上柱的乙酸乙酯層原花色素復(fù)配下對DPPH的清除率

從表1可以看出，滇橄欖樹皮原花色素與VC復(fù)配后有協(xié)同抗氧化作用，不同比例復(fù)配的協(xié)同抗氧化效果不同。當(dāng)在一定劑量的原花色素中按3∶1比例少量加入VC時(shí)，清除作用效果不明顯，說明VC的添加對原花色素影響不大。而在原花色素與VC按質(zhì)量比1∶3比例復(fù)配時(shí)，清除作用效果較3∶1時(shí)明顯，無原花色素添加時(shí)，VC需50 μg/mL才能達(dá)到90%以上清除率，而當(dāng)添加原花色素9 μg/mL后，則VC只需27 μg/mL即可使清除率達(dá)到90%以上。當(dāng)原花色素與VC按質(zhì)量比1∶1比例復(fù)配時(shí)，清除效果顯著提高。說明滇橄欖樹皮原花色素與VC復(fù)配后有很好的協(xié)同抗氧化效果，尤其1∶1配比的協(xié)同作用較好。滇橄欖樹皮原花色素與VC復(fù)配組中協(xié)同作用的強(qiáng)弱順序?yàn)?∶1>1∶3>3∶1。

3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，滇橄欖樹不同部位原花色素質(zhì)量濃度有所不同，樹枝的原花色素質(zhì)量濃度最高，依次是樹枝>樹皮>樹葉>樹芯。另外，不同部位原花色素提取率依次為：樹枝>樹皮>樹葉>樹芯。其中滇橄欖樹枝原花色素最佳提取條件為：采用超聲波提取法，60℃；乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%；料液比1∶7，提取時(shí)間為30 min時(shí)提取率最高達(dá)到3.85%。其次經(jīng)過乙酸乙酯層萃取的原花色素質(zhì)量濃度為10 μg/mL的清除DPPH能力與VC質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)的效果相當(dāng)，清除率最高為88.55%，說明了滇橄欖樹皮提取物具有很強(qiáng)的抗氧化性，且抗氧化有效成分主要集中在乙酸乙酯層，水層仍然含有部分原花色素，酯層抗氧化性要優(yōu)于水層。將粗提物用AB-8樹脂進(jìn)行分離，流出液進(jìn)行抗氧化性測定，其抗氧化效果低于水層，說明有效成分已經(jīng)被樹脂吸附，AB-8樹脂分離純化效果較好。用20%，30%，40%，50%及無水乙醇洗脫產(chǎn)物后，抗氧化有效成分主要集中在20%，30%，40%洗脫成分上。而單獨(dú)洗脫成分的抗氧化性能并不如未洗脫的乙酸乙酯層的好，因此推測不同結(jié)構(gòu)的原花色素抗氧化時(shí)具有一定協(xié)同作用。將未進(jìn)行洗脫分離的乙酸乙酯層原花色素與VC以適量濃度進(jìn)行復(fù)配。結(jié)果表明滇橄欖樹皮原花色素與VC復(fù)配后有協(xié)同抗氧化作用，不同比例復(fù)配的協(xié)同抗氧化效果不同，原花色素與VC以1∶1配比的協(xié)同作用較好。原花色素和VC以質(zhì)量比為3∶1,1∶1,1∶3進(jìn)行復(fù)配后對DPPH的最高清除率分別為88.84%，91.27%，91.05%，協(xié)同作用強(qiáng)弱順序?yàn)?∶1>1∶3>3∶1。本研究明確了滇橄欖樹不同組織原花色素質(zhì)量濃度，探討其樹皮抗氧化機(jī)制，研究不同分離產(chǎn)物，以及與VC之間協(xié)同的氧化作用，對滇橄欖樹的開發(fā)和利用具有重要意義。

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Research on the mass concentration and antioxidation ofproanthocyanidins in different tissues fromPhyllanthusemblicaLinn.

ZHANG Lun1, YANG Shenming1, XU Chengdong1, WANG Fei2, HU Xiaoan1*

(1.CollegeofChemistryandLifeScience,ChuxiongNormalUniversity,Chuxiong675000,Yunnan,China; 2.NanjingForestryUniversity,Nanjing210037,China)

Proanthocyanidins are one of the most effective free radical scavenger, which have strong capability of scavenging free radical and antioxidation. Taking thePhyllanthusemblicaLinn. tree in Yunan Provnice as the raw material, the content of proanthocyanidins in barks, tree cores, branches and leaves were determined by ultrasonic extraction technology. In the same time, the extraction conditions were optimized. In additon, antioxidant activities and VC(vitamin C) synergistic effect of proanthocyanidins fromPh.emblicaLinn. barks were compared. The results showed that the content of proanthocyanidins is the highest in the branch; followed by the barks, the leaves, and the tree core. The optimum extraction conditions of proanthocyanidins from the branch were as follows: with 60% ethanol as the extracting agent, solid-liquid ratio of 1∶7, temperature of 60℃ and time for 30 min. Under this best condition, the extraction rate could reach 3.85%. The extraction has strong antioxidant activity fromPh.emblicabarks. Scavenging DPPH ability of free radical was the best when proanthocyanidin concentration was 10 μg/mL, the highest scavenging rate was 88.55%. Antioxidant active ingredients were mainly concentrated in the ethyl acetate layer and the aqueous layer also contains part of the antioxidants. The scavenging rates were 88.84%, 91.27% and 91.05%，respectively, when the complex concentrations of proanthocyanidins and VC was 3∶1, 1∶1 and 1∶3, respectively, and the effects of synergy showed the result of 1∶1>1∶3>3∶1.

PhyllanthusemblicaLinn.; different tissues; proanthocyanidins; antioxidation

2016-08-20

2017-01-19

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項(xiàng)目(2014FD052)；楚雄師范學(xué)院學(xué)術(shù)骨干資助項(xiàng)目(13XJGG03)。

張倫，女，講師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。通信作者：胡小安，男，副教授。E-mail:huxiaoan@cxtc.edu.cn

TQ041

A

2096-1359(2017)04-0057-06