李琦，陳明真，趙林果

(南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院；江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210037)

耐熱木聚糖酶基因的克隆表達(dá)及其在酶解玉米芯木聚糖中的應(yīng)用

李琦，陳明真，趙林果*

(南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院；江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210037)

為尋求具有耐熱性能的木聚糖酶，筆者以嗜熱網(wǎng)球菌(Dictyoglomusthermophilum)DSM3960的基因組為模板，克隆得到木聚糖酶基因xynB-DT，該基因全長1 083 bp，共編碼361個(gè)氨基酸，蛋白的理論分子量約為40 ku。通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白質(zhì)屬于糖苷水解酶G11家族。實(shí)現(xiàn)大腸桿菌異源表達(dá)重組木聚糖酶XynB-DT，通過IPTG誘導(dǎo)，酶活達(dá)到30.6 U/mL。該重組木聚糖酶的最適溫度為85℃，在60～80℃范圍內(nèi)均有較好溫度穩(wěn)定性，在60℃條件下保溫2 h，酶活維持在90%以上，在90℃下保溫2 h，酶活尚殘余約50%；最適pH為6.5，在pH為5.0～7.5范圍內(nèi)保溫24 h仍可保留約90%剩余酶活力。該酶以Beechwood木聚糖為底物，米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(Vmax)值分別為5.63 mg/mL和1.572 mmol/(L·min-1)。以玉米芯木聚糖為底物，研究XynB-DT水解玉米芯木聚糖的條件及產(chǎn)物，結(jié)果顯示在溫度70℃、pH 6.0條件下酶解12 h，加酶量為400 U/g，最終酶解得率為44.3%，玉米芯木聚糖的水解產(chǎn)物主要以木二糖和木三糖為主，表明該木聚糖酶在低聚木糖制備方面具有較大應(yīng)用潛能。

嗜熱網(wǎng)球菌；木聚糖酶；克?。凰?/p>

木聚糖酶是一類可將木聚糖降解為低聚木糖和木糖的酶的總稱，主要分為內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶、外切β-1,4-木聚糖酶以及β-D-木糖苷酶[1-3]。內(nèi)切β-1,4-木聚糖酶，以內(nèi)切方式水解木聚糖主鏈中的β-1,4-糖苷鍵，生成木二糖和木三糖等寡糖，是降解木聚糖最主要的酶，在造紙、紙漿工業(yè)、食品和飼料工業(yè)中有廣泛應(yīng)用前景[4-6]。我國作為農(nóng)業(yè)大國，全國年糧食總產(chǎn)量達(dá)到6億t，但大量秸稈、玉米芯等農(nóng)副產(chǎn)物卻只能被焚燒，既造成環(huán)境污染又浪費(fèi)生物資源。玉米芯內(nèi)木聚糖含量高達(dá)35%，木聚糖經(jīng)木聚糖酶水解后可獲得具有應(yīng)用價(jià)值的低聚木糖。低聚木糖作為一種新型功能性食品添加劑，在提高食物質(zhì)量方面具有較大潛能[7]。然而，在食品加工工業(yè)中，需要利用較高溫度以提升底物的溶解性并防止雜菌污染。耐高溫木聚糖酶具有較大應(yīng)用價(jià)值及廣闊市場(chǎng)前景。

目前，木聚糖酶已經(jīng)從細(xì)菌、真菌、植物和各種無脊椎動(dòng)物中分離，其中，微生物來源的木聚糖酶最為廣泛[8]，通常細(xì)菌來源的木聚糖酶比真菌來源的木聚糖酶耐熱。根據(jù)酶蛋白催化區(qū)的氨基酸同源性以及疏水簇分析，大多數(shù)木聚糖酶屬于糖苷水解酶家族F/10和G/11族。一般情況下，F(xiàn)/10族木聚糖酶分子量大，熱穩(wěn)定性好，大部分含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，作用底物廣泛，且水解產(chǎn)物中單糖成分含量較多。與F/10族木聚糖酶相比，G/11族木聚糖酶同源性在40%～90%范圍內(nèi)，且分子量低，催化效率高，最適pH為2.0～9.0，最適溫度為35～80℃，熱穩(wěn)定性低以及單一催化結(jié)構(gòu)域等特點(diǎn)，對(duì)木聚糖有較高的特異性[9-11]。嗜熱網(wǎng)球菌(Dictyoglomusthermophilum)作為一種極耐熱菌，其分泌的木聚糖酶歸屬于G/11家族，通過研究其酶學(xué)特性，能夠使其較好應(yīng)用于半纖維素資源生產(chǎn)食品、藥品、保健品等。筆者通過基因克隆方法，從D.thermophilum中獲得耐高溫的木聚糖酶XynB-DT，再利用該酶酶解玉米芯木聚糖，最終利用離子色譜法分析水解后的低聚木糖產(chǎn)物。對(duì)該類具有應(yīng)用價(jià)值的低聚木糖進(jìn)行開發(fā)和研究，不僅可充分利用資源，也能夠創(chuàng)造較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 菌株質(zhì)粒和培養(yǎng)基

表達(dá)載體pET-20b購于TaKaRa公司；目的基因來源菌株D.thermophilumDSM3960購于DSM(www.dsmz.de)；宿主菌大腸桿菌(Escherichiacoli)Top 10F’和BL21由南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院微生物技術(shù)研究室保藏。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 1 g(pH控制在中性)，加入100 mL蒸餾水，121℃滅菌20 min，培養(yǎng)基溫度降至60℃時(shí)加入相應(yīng)抗生素。

1.2 主要試劑

dNTP、Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DL5000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI等購于TaKaRa公司；胰蛋白胨、酵母提取物購于Oxoid公司；櫸木木聚糖(Beechwood)標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、氨芐青霉素、核酸染料等購自于南京天為公司；引物合成及測(cè)序由南京思普金公司完成。

1.3 主要儀器

上海智城ZHWY-2102C搖床，日本TOMY SX-500自動(dòng)蒸氣滅菌鍋，德國Eppendorf公司臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)5415R，德國Eppendorf公司梯度PCR儀，美國Bio-rad公司凝膠成像系統(tǒng)，美國Molecular Devices公司全波長酶標(biāo)儀SpectraMax190。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI上公布的D.thermophilumDSM3960的xynB-DT基因序列設(shè)計(jì)引物如下：xynB-DT-f1(CCGGAATTCATGTTTCTTAAAAAACTTA)和xynB-DT-r1(TTGCGGCCGCTTACTGTATCAAC)。下劃線部分分別為EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)。

1.4.2 木聚糖酶基因的克隆

將合成的引物用TE buffer稀釋成10 μmol/L工作液，以D.thermophilumDSM3960基因組DNA為模板，用引物對(duì)xynB-DT進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為：D.thermophilumDSM3960基因組DNA 1.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2.0 μL，dNTP Mixture 4.0 μL，10×Ex Taq buffer(Mg2+free)5.0 μL，MgCl24.0 μL，Ex Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 31.5 μL。

1.4.3 pET-20b-xynB-DT表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

割膠回收基因片段xynB-DT，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI分別對(duì)目的基因片段和大腸桿菌表達(dá)載體pET-20b進(jìn)行雙酶切后連接，構(gòu)建表達(dá)載體pET-20b-xynB-DT。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliTop 10F’和E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中，將重組菌接入到含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)平板中37℃過夜培養(yǎng)，篩選出陽性重組菌。挑選陽性單菌落至5 mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃，180 r/min條件下恒溫過夜培養(yǎng)，至OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后，離心收集菌體，用50 mmol/L pH為7.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液重懸后，超聲破碎至菌液澄清，在4℃條件下10 000 r/min離心5 min，收集上清液即為胞內(nèi)酶液。

1.4.4 重組木聚糖酶的表達(dá)條件優(yōu)化

挑取單菌至5 mL LB培養(yǎng)基中，在37℃，180 r/min條件下恒溫培養(yǎng)12 h。轉(zhuǎn)接于50 mL LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至OD600為0.8，加入終濃度分別為0.005，0.01，0.02，0.05和0.1 mmol/L的IPTG，28℃下誘導(dǎo)4 h，以不添加IPTG為對(duì)照；選定IPTG濃度為0.01 mmol/L，在28℃條件下分別誘導(dǎo)2，4，6和8 h，以0 h為對(duì)照；選定IPTG濃度為0.01 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h，改變誘導(dǎo)溫度20，24，28，32和37℃。

1.4.5 重組木聚糖酶的純化、酶活測(cè)定及SDS-PAGE分析

重組蛋白用鎳親和試劑盒純化。Ni柱平衡后，將粗酶液以1 mL/min速率上樣，然后使用平衡緩沖液以同樣速率洗去未吸附的蛋白質(zhì)和雜質(zhì)，使用200 mmol/L咪唑緩沖液進(jìn)行洗脫，并收集蛋白。將收集的酶液透析除鹽后進(jìn)行酶活測(cè)定和SDS-PAGE分析。

以Beechwood木聚糖為底物，采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[12]測(cè)定純化后的木聚糖酶XynB-DT的活性。反應(yīng)體系為：100 μL檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液(pH 6.5, 50 mmol/L)，50 μL 1%底物在85℃下預(yù)熱5 min，加入50 μL酶液，85℃下反應(yīng)30 min后加入300 μL DNS混勻，煮沸計(jì)時(shí)5 min后混勻，于540 nm波長處測(cè)定其吸光度。以有底無酶作為對(duì)照。

SDS-PAGE試驗(yàn)方法參照分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行[13]。取500 μL酶液，加入500 μL的2×蛋白電泳緩沖液，煮沸計(jì)時(shí)5 min后離心。取15 μL上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.4.6 重組木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析

最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性測(cè)定：在60，65，70，75，80，85和90℃溫度下，分別測(cè)定木聚糖酶酶活，以測(cè)定的酶活最高為100%計(jì)算相對(duì)酶活；在最適pH條件下，于60，70，80和90℃條件下分別保溫20，40，60，80，100和120 min，以未育溫的木聚糖酶活力為相對(duì)100%。

最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性測(cè)定：在最適溫度條件下，分別測(cè)定pH 5.0～7.5條件下的酶活力，以測(cè)定的最高酶活力為相對(duì)100%，根據(jù)各pH條件下酶活力大小確定重組木聚糖酶的最適反應(yīng)pH；在不含底物條件下，將重組木聚糖酶置于不同pH(5.0～7.5)的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液中，于4℃保存24 h，在最適溫度及pH條件下測(cè)定其殘余酶活力，以未經(jīng)過pH處理酶的酶活力為相對(duì)100%。

1.4.7 重組木聚糖酶水解玉米芯木聚糖條件優(yōu)化

玉米芯木聚糖提取方法[14]：風(fēng)干玉米芯粉碎至40～60目(420～250 μm)，加入10%的NaOH溶液至固液比為1∶10，在121℃條件下抽提1 h后抽濾，用適量水洗滌抽濾渣1～2遍。合并所有液體，使用鹽酸中和至pH為7.0，離心后沉淀物用蒸餾水洗至乳白色，烘干粉碎后即為玉米芯木聚糖。樣品用4%硫酸水解，混勻后在121℃下水解1 h，調(diào)節(jié)pH至中性，離心取上清液測(cè)定總還原糖，將所測(cè)還原糖質(zhì)量濃度乘以木聚糖聚合系數(shù)0.88，即得到木聚糖質(zhì)量。

重組木聚糖酶酶解玉米芯木聚糖條件優(yōu)化：玉米芯木聚糖底物質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL，以純化后的XynB-DT為酶解用酶，以還原糖質(zhì)量濃度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究溫度(30，40，50，60，70和80℃)、pH(5.0，5.5，6.0，6.5，7.0和7.5)、加酶量(50，100，200，400，800和1 000 U/g)和時(shí)間(2，4，6，8，10，12，14和16 h)對(duì)酶解的影響，優(yōu)化酶解條件，所有條件均設(shè)置3組平行試驗(yàn)。酶解率和低聚木糖得率根據(jù)以下公式計(jì)算：

酶解率=(還原糖×0.88)/玉米芯木聚糖質(zhì)量濃度×100%

低聚木糖得率=(x2+x3+x4+x5+x6)/玉米芯木聚糖質(zhì)量濃度×100%

式中，x2、x3、x4、x5和x6分別為木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖的質(zhì)量濃度，mg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的來源于D.thermophilumDSM3960的xynB-DT基因序列設(shè)計(jì)特異性引物(Genbank：CP001146.1)，擴(kuò)增出xynB-DT基因片段，全長1 083 bp，該基因編碼361個(gè)氨基酸。該基因與來源于Caldicellulosiruptorsp.F32和Paenibacilluscurdlanolyticus的木聚糖酶基因分別具有80%和56%的同源性。將xynB-DT基因片段連接到大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-20b中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-20b-xynB-DT(圖1)，載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliTop 10F’中，篩選陽性克隆。

對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI和NotI雙酶切驗(yàn)證(圖1)，一條在3 000 bp左右，為切去xynB-DT基因的pET-20b片段；另一條在1 000 bp左右的條帶為xynB-DT基因的片段，說明此細(xì)菌木聚糖酶的基因已插入到pET-20b載體上。

Lane1：DL5000 Marker；Lane2：重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物圖1 表達(dá)載體pET-20b-xynB-DT的構(gòu)建及雙酶切驗(yàn)證圖Fig. 1 Construction and double enzyme digestion of expression vector pET-20b-xynB-DT

2.2 重組木聚糖酶表達(dá)條件優(yōu)化

在不同的誘導(dǎo)劑IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度條件下，測(cè)定重組木聚糖酶酶活力，以最高酶活力為100%，結(jié)果如圖2所示。重組木聚糖酶誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件分別為：在32℃條件下，添加0.02 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)6 h后所測(cè)木聚糖酶酶活最高，達(dá)到30.6 U/mL，表達(dá)量在木聚糖酶大腸桿菌表達(dá)水平下位居前列[15-16]。

圖2 重組木聚糖酶表達(dá)條件優(yōu)化Fig. 2 Condition optimization of expression of recombinant xylanase

2.3 目的蛋白純化及重組木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

誘導(dǎo)6 h后的菌液離心收集，并超聲破碎后,經(jīng)過鎳親和柱純化得到電泳純的木聚糖酶XynB-DT(表1)。結(jié)果顯示，經(jīng)鎳親和柱純化后，最終的酶得率為73%。透析除鹽后進(jìn)行SDS-PAGE分析(圖3)和木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定。SDS-PAGE分析的結(jié)果表明，誘導(dǎo)的重組菌具有明顯蛋白條帶，經(jīng)85℃熱處理后，已有較大部分雜蛋白被去除，說明該細(xì)菌木聚糖酶蛋白純化手段簡單。經(jīng)鎳柱純化后得到一條清晰單一的XynB-DT蛋白條帶，且目的蛋白條帶在40～55 ku范圍內(nèi)，與理論蛋白分子量接近，由此可知，重組木聚糖酶基因已在大腸桿菌中成功表達(dá)。

表1 重組木聚糖酶XynB-DT的純化

利用純化后的重組木聚糖酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果如圖4。以1% Beechwood xylan為底物，在pH 5.0條件下，測(cè)定溫度60～90℃下的酶活性。由圖4a可知，重組木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為85℃，在70～90℃內(nèi)均能保持80%以上相對(duì)酶活力；而由圖4b可見，該重組木聚糖酶在60～80℃下 具有較好穩(wěn)定性，保溫120 min后酶活基本未變化。

M：蛋白上樣Marker；1：帶有空載質(zhì)粒pET-20b的大腸桿菌；2：細(xì)胞破碎后粗酶液；3：85℃熱變性60 min蛋白；4：鎳柱純化后蛋白圖3 重組木聚糖酶的SDS-PAGE圖Fig. 3 The SDS-PAGE of recombinant xylanase

在90℃下保溫60 min仍能保持50%以上相對(duì)酶活力。在溫度85℃下，測(cè)定pH 5.0～7.5條件下的酶活性。由圖4c可知，該木聚糖酶在pH 5.5～7.0范圍內(nèi)均能維持80%以上活性，當(dāng)pH高于7.0后，活性下降趨勢(shì)明顯。該重組木聚糖酶在pH 5.0～7.5緩沖液中4℃下放置24 h后，仍能保持90%以上活性(圖4c)。

以不同濃度的木聚糖為底物測(cè)定重組酶的酶活，采用雙倒數(shù)法計(jì)算該酶的米氏常數(shù)Km。1/s為橫坐標(biāo)(底物濃度的倒數(shù))，1/v為縱坐標(biāo)(酶促反應(yīng)速度的倒數(shù))，該直線在x軸上的截距為1/Km值，y軸上的截距為1/Vmax值，結(jié)果如圖4d所示。重組木聚糖酶的Km和Vmax分別為5.63 mg/mL和1.572 mmol/(L·min-1)。

a)最適溫度；b)溫度穩(wěn)定性；c)最適pH和pH穩(wěn)定性；d)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程圖4 重組木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)Fig. 4 Enzyme characterization of recombinant xylanase

2.4 玉米芯木聚糖的制備及酶解條件研究

玉米芯中除含有高達(dá)35%的木聚糖外，還含有大量纖維素、木質(zhì)素、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，它們通過共價(jià)鍵、氫鍵等作用力緊密結(jié)合，需通過物理、化學(xué)等手段進(jìn)行預(yù)處理，手段一般包括高溫蒸煮浸提、酸法提取、堿法提取等[17]。本試驗(yàn)通過堿法提取玉米芯木聚糖，從50 g玉米芯中得到木聚糖提取物10 g。

溫度和pH對(duì)酶的酶解有較大影響。一定溫度范圍內(nèi)，隨溫度升高，酶-底物中間體分解轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的速度加快。當(dāng)溫度過高則會(huì)降低酶的穩(wěn)定性，使其失活，從而影響酶的反應(yīng)速率。參考本文木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)，選取30，40，50，60，70和80℃測(cè)定其酶解的最適溫度(底物質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL，酶用量為200 U/g，pH為6.5，酶解12 h)，結(jié)果如圖5a所示。溫度對(duì)酶解率影響較大，最適酶解溫度為70℃，當(dāng)溫度過低時(shí)不利于酶解反應(yīng)發(fā)生，高于70℃后，酶解率開始下降。最適酶解溫度條件下，選取pH為5.0，5.5，6.0，6.5，7.0和7.5測(cè)定其酶解的最適pH(底物質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL，酶用量為200 U/g，酶解12 h)。由圖5b可知，在pH為5.0～6.5范圍內(nèi)，其酶解率維持在35%以上，而當(dāng)pH逐漸升高為弱堿性時(shí)，其酶解率下降，當(dāng)pH為6.0時(shí)，酶解效率最高。

a)最適溫度；b)最適pH；c)最適酶用量；d)最適酶解時(shí)間圖5 重組木聚糖酶酶解玉米芯木聚糖的條件優(yōu)化Fig. 5 Condition optimization of degradation of corncob xylan by recombinant xylanase

加酶量對(duì)酶解率也有顯著影響，當(dāng)加酶量不足時(shí)，底物酶解不充分，而加酶量過大則導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加，因此應(yīng)選擇合適的加酶量。選取酶用量為50，100，200，400，800和1 000 U/g(底物質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL，溫度為70℃，pH為6.0，酶解12 h)，結(jié)果如圖5c所示。隨酶用量增加，酶解率逐漸升高，但當(dāng)酶用量高于400 U/g時(shí)，酶解率增加趨勢(shì)平緩。這可能是因?yàn)榘肜w維素分子與木聚糖酶的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量有限，當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)全部被占據(jù)后，過多用量反而增加了酶與底物的無效吸附，從而降低了酶解率。因此，從降低生產(chǎn)成本方面考慮，酶用量選擇400 U/g較為合適。

酶解反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解效果具有一定影響，酶解時(shí)間過短，則底物酶解不充分，但受酶穩(wěn)定性的限制，在70℃條件下經(jīng)過一定反應(yīng)周期后酶逐漸失活，不利于低聚木糖產(chǎn)生，因此應(yīng)選擇合適的酶解時(shí)間。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度1.25 mg/mL、溫度70℃、pH 6.0和加酶量400 U/g的條件下酶解2，4，6，8，10，12，14 和16 h后分別取樣，結(jié)果如圖5d所示，酶解率隨酶解時(shí)間的延長而升高，超過12 h后，酶解率變化不大。因此，最佳的反應(yīng)時(shí)間為12 h。

x1：木糖；x2：木二糖；x3：木三糖；x4：木四糖圖6 重組木聚糖酶水解玉米芯木聚糖產(chǎn)物的離子色譜分析圖Fig. 6 Ion chromatography analysis diagram ofdegradation products of corncob xylan

目前，聚合度在2～4范圍內(nèi)的功能性低聚木糖在食品中應(yīng)用較為廣泛，它們能夠促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌增殖，改善腸道功能，因此作為新一代生物制品具有較大應(yīng)用潛力[18]。在最適條件下，重組木聚糖酶對(duì)玉米芯木聚糖的水解產(chǎn)物用離子色譜進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示。酶解12 h后，酶解產(chǎn)物以低聚木糖為主，其中木二糖和木三糖質(zhì)量濃度分別達(dá)到279.381 5和275.228 4 mg/L，占總糖的90%以上，且只有少量木糖被檢出，而在G10族木聚糖酶的酶解產(chǎn)物中木糖含量則偏高[19]。最終的酶解得率為44.3%，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相近[20-21]。本研究中得到的重組木聚糖酶具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，且酶解產(chǎn)物中木糖含量少，說明其在生物轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)低聚木糖方面具有較大應(yīng)用前景。

3 結(jié) 論

本研究以來源于D.thermophilumDSM3960的基因組為模板，對(duì)木聚糖酶XynB-DT進(jìn)行克隆、表達(dá)研究，結(jié)論如下：

1)D.thermophilum來源的木聚糖酶基因全長1 083 bp，共編碼361個(gè)氨基酸，該基因編碼蛋白質(zhì)屬糖苷水解酶G11家族。成功構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-20b-xynB-DT，優(yōu)化其表達(dá)條件：32℃條件下，添加0.02 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h后產(chǎn)酶量達(dá)到30.6 U/mL。

2)經(jīng)鎳親和柱純化后得到電泳純的重組木聚糖酶，該酶的最適反應(yīng)溫度為85℃，最適反應(yīng)pH為6.5，在pH為5.0～7.5范圍內(nèi)具有較好穩(wěn)定性，在90℃條件下保溫120 min，剩余酶活達(dá)50%以上，該酶的Km和Vmax分別為5.63 mg/mL和1.572 mmol/(L·min-1)。

3)利用重組木聚糖酶對(duì)玉米芯木聚糖進(jìn)行酶解，獲得最佳酶解條件為：溫度70℃，pH 6.0，加酶量400 U/g，酶解12 h。利用HPLC對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，產(chǎn)物中含有較多木二糖和木三糖，分別占水解產(chǎn)物總量的49.4%和48.7%。因此，該重組木聚糖酶不但具有優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)，且在水解玉米芯木聚糖的產(chǎn)物中以低聚木糖為主，木糖含量少，較利于低聚木糖的純化，顯示了其在制備低聚木糖方面具有較大應(yīng)用潛力。

本研究可為XynB-DT木聚糖酶工業(yè)化生產(chǎn)低聚木糖提供一定的理論基礎(chǔ)，促進(jìn)其工業(yè)化應(yīng)用。

[ 1 ]萬紅貴, 王濤, 蔡恒, 等. 木聚糖酶的特性及應(yīng)用研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(3):92-95. WAN H G, WANG T, CAI H, et al. Research advances on characteristics and application of xylanases[J]. Food and Fermentation Industries, 2008, 34(3):92-95.[ 2 ]KHANDEPARKER R, NUMAN M T. Bifunctional xylanases and their potential use in biotechnology[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2008, 35(7):635-644.

[ 3 ]JOSELELU J P, COMTAT J, RUEL K. Chemical structure of xylans and their interaction in the plant cell wall[J]. Progress in Biotechnology, 1991, 179(3):356-364.

[ 4 ]孫振濤, 趙祥穎, 劉建軍, 等. 微生物木聚糖酶及其應(yīng)用[J]. 生物技術(shù), 2007, 17(2):93-97. SUN Z T, ZHAO X Y, LIU J J, et al. Microbial xylanases and their industrial applicafions[J]. Biotechnology, 2007, 17(2):93-97.

[ 5 ]陸健, 曹鈺, 陳堅(jiān), 等. 木聚糖酶的產(chǎn)生、性質(zhì)和應(yīng)用[J]. 釀酒, 2001, 28(6):30-34. LU J, CAO Y, CHEN J, et al. Production, properties and applications of xylanase[J]. Liquor Making, 2001, 28(6):30-34.

[ 6 ]KIM J C, SIMMINS P H, MULLAN B P, et al. The digestible energy value of wheat forpigs, with special reference to the post-weaned anaimal[J]. Animal Feed Science and Technology, 2005, 122:257-287.

[ 7 ]BRIENZO M, CARVALHO W, MILAGRES A M. Xylooligosaccharides production from alkali-pretreated sugarcane bagasse using xylanases fromThermoascusaurantiacus[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2010, 162(4):1195-1205.

[ 8 ]BEG Q K, KAPOOR M, MAHAJAN L, et al. Microbial xylanases and their industrial applications:a review[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2001, 56(3-4):326-338.

[ 9 ]COLLINS T, GERDAY C, FELLER G. Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2005, 29(1):3-23.

[10]劉亮偉, 秦天蒼, 翟繼, 等. F10/G11木聚糖酶家族密碼子偏好型分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 42(2):223-227. LIU L W, QIN T C, ZHAI J, et al. Analysis on codon bias in F/10 and G/11 xylanase[J]. Journal of Henan Agricultural University, 2008, 42(2):223-227.

[11]SUBRAMANIYAN S, PREMA P. Biotechnology of microbial xylanases:enzymology, molecular biology, and application[J]. Critical Reviews in Biotechnology, 2002, 22(1):33-64.

[12]MILLER G L. USE of dinitrosalicylic acid reagent for of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry, 1959, 31(3):426-428.

[13]AUSUBEL F M, KINGSTON R E, SEIDMAN J G, 等. 精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(第四版)[M]. 北京：科學(xué)出版社, 2005, 22-24, 26, 55-58. AUSUBEL FM, KINGSTON R E, SEIDMAN J G, et al. Short protocols in molecular biology (4th edition) [M]. Beijing:Science Press, 2005, 22-24, 26, 55-58.

[14]李秀婷, 孫寶國, 宋煥祿, 等. 玉米芯水不溶性木聚糖的堿法提取及酶解分析[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2010, 10(5):171-176. LI X T, SUN B G, SONG H L, et al. Studies on alkali extraction of water insoluble xylan from corncobs and enzymolysis analysis[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2010, 10(5):171-176.

[15]向亞萍, 羅楚平, 周華飛, 等. 枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)極耐熱木聚糖酶及其酶學(xué)性質(zhì)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 32(5):1037-1042. XIANG Y P, LUO C P, ZHOU H F, et al. Expression of xylanse B gene ofThermotogamaritimainBacillussubtilisand the properties of recombinase[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 2016, 32(5):1037-1042.

[16]陳鮮, 郭穎, 胡勝偉, 等. 嗜熱木聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2016, 35(11):3060-3068. CHEN X, GUO Y, HU S W, et al. Expression of a thermophilic xylanase gene inPichiapastorisand its enzymatic properties[J]. Genomics and Applied Biology, 2016, 35(11):3060-3068.

[17]楊瑞金, 許時(shí)嬰, 王璋. 凝膠過濾色譜法研究酶法生產(chǎn)低聚木糖過程中木聚糖分子結(jié)構(gòu)的變化[J]. 中國糧油學(xué)報(bào), 2002, 17(4):48-51. YANG R J, XU S Y, WANG Z. The changes in the structure of xylan during the enzymatic production of xylooligosaccharides with gel filtration chromatography[J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2002, 17(4):48-51.

[18]OTIENO D O, AHRING B K. The potential for oligosaccharide production from the hemicellulose fraction of biomasses through pretreatment processes:xylooligosaccharides (XOS), arabinooligosaccharides (AOS), and mannooligosaccharides (MOS)[J]. Carbohydrate Research, 2012, 360(1):84-92.

[19]BERRIN J G, JUGE N. Factors affecting xylanase functionality in the degradation of arabinoxylans[J]. Biotechnology Letters, 2008, 30(7):1139-1150.

[20]歐陽嘉, 劉明, 李鑫, 等. 重組木聚糖酶生產(chǎn)低聚木糖的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2011, 31(2):37-42. OUYANG J, LIU M, LI X, et al. Experimental investigation of xylooligosaccharides production by recombinant xylanase[J]. Chemistry and Industry of Forest Products, 2011, 31(2):37-42.

[21]楊然, 朱培華, 姚君, 等. 重組木聚糖酶酶解玉米芯制備低聚木糖[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2015, 41(4):115-120. YANG R, ZHU P H, YAO J, et al. Experimental investigation of xylooligosaccharides production from corn cob by recombinant xylanase[J]. Food and Fermentation Industries, 2015, 41(4):115-120.

Cloning and expression of a thermophile GH11 xylanase gene andits application in xylooligosaccharide production

LI Qi, CHEN Mingzhen, ZHAO Linguo*

(CollegeofChemicalEngineering,NanjingForestryUniversity;JiangsuKeyLaboratoryofBiomassBasedGreenFuelsandChemicals,Nanjing210037,China)

The GH11 endo-1, 4-xylanase gene,xynB-DTfromDictyoglomusthermophilumDSM3960 was cloned and expressed inEscherichiacoli. The full-length gene contained 1 083 bp, which encoded 361 amino acids. The recombinant plasmid pET-20b-xynB-DTwas reconstructed and expressed in theE.coliBL21 successfully. In addition, the pure protein was obtained by Ni-NTA affinity column, and the molecular weight of protein was approximately 40 ku. The activity of recombinant xylanase was 30.6 U/mL in LB medium by IPTG induction. The properties of XynB-DT were analyzed and the results showed that the optimum temperature of this recombinant enzyme was 85℃, and the relative enzyme activity was higher than 90% under 60℃ in 120 min and more than 50% under 90℃ in 120 min. Correspondingly, the optimum pH was 6.5, and it preserved enzyme activity lower than 90% in the range of 5.0-7.5 for pH. TheKmandVmaxfor beechwood xylan was 5.63 mg/mL and 1.572 mmol/(L·min-1), respectively. Then, taking the corncobs xylan as the substrate, this study was focused on the hydrolyzing conditions and the hydrolysis products identified by ion chromatography, and the results showed that after 12 h, under 70℃, pH 6.0 with the enzyme dosage of 400 U/g, the final hydrolysis yield was 44.3%. As the major hydrolytic products, xylobiose and xylotriose were excised from corncob xylan by XynB-DT and only a little of amount of xylose was detected during the hydrolysis. All the results made XynB-DT be attractive for potential application in xylooligosaccharides production.

D.thermophilum; xylanase; gene cloning; hydrolysis

2016-10-28

2017-02-09

江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(13KJA220004)；江蘇省“333高層次人才培養(yǎng)工程”專項(xiàng)資助項(xiàng)目 (BRA2015317)；江蘇省“六大人才高峰”資助項(xiàng)目(2014-JY-011)；江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)。

李琦，女，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵及酶工程。通信作者：趙林果，男，教授。E-mail:lgzhao@njfu.edu.cn

Q819

A

2096-1359(2017)04-0063-07