張 潔， 鄭碧云， 陳治新， 李 丹， 王小眾

IL-10對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因的HL-7702細(xì)胞增殖的影響

張 潔， 鄭碧云， 陳治新， 李 丹， 王小眾

目的 探討白細(xì)胞介素-10(IL-10)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乙型肝炎病毒X(HBx)基因的HL-7702肝細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制。 方法 CCK-8法測定HBx基因?qū)L-7702細(xì)胞增殖的作用及IL-10對(duì)HL-7702/HBx細(xì)胞增殖的作用；流式細(xì)胞術(shù)測定IL-10對(duì)HL-7702/HBx細(xì)胞凋亡的影響；RT-PCR法測定HBx基因?qū)L-7702細(xì)胞表達(dá)CDKN1B蛋白質(zhì)mRNA的作用及IL-10對(duì)HL-7702/HBx表達(dá)CDKN1B mRNA的作用。 結(jié)果 CCK-8法顯示，HL-7702/HBx細(xì)胞比HL-7702細(xì)胞和HL-7702/MOCK細(xì)胞增殖速度明顯加快(P<0.05)；80 ng/mL的IL-10作用24 h可抑制HL-7702/HBx細(xì)胞增殖(P<0.05)；流式細(xì)胞術(shù)顯示，80 ng/mL的IL-10作用24 h對(duì)HL-7702細(xì)胞、HL-7702/HBx細(xì)胞及HL7702/MOCK細(xì)胞凋亡均無影響；RT-PCR法顯示，HL-7702/HBx細(xì)胞CDKN1B mRNA表達(dá)量較HL-7702細(xì)胞和HL-7702/MOCK細(xì)胞降低(P<0.05)，80 ng/mL的IL-10作用24 h后，HL-7702/HBx細(xì)胞較HL-7702/HBx空白組CDKN1B mRNA表達(dá)量上調(diào)(P<0.05)。 結(jié)論 HBx基因可促進(jìn)HL-7702細(xì)胞增殖，IL-10可抑制HL-7702/HBx細(xì)胞增殖而對(duì)其凋亡無影響。HBx基因可能通過下調(diào)HL-7702/HBx細(xì)胞CDKN1B mRNA的表達(dá)量而促進(jìn)細(xì)胞增殖，IL-10可能通過上調(diào)HL-7702/HBx細(xì)胞CDKN1B mRNA的表達(dá)量而抑制細(xì)胞增殖。

病毒蛋白質(zhì)類； 肝細(xì)胞； 肝炎病毒，乙型； 白細(xì)胞介素10； *細(xì)胞轉(zhuǎn)化，腫瘤； 細(xì)胞增殖

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)基因X區(qū)負(fù)責(zé)編碼乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)。HBx發(fā)揮生物學(xué)功能并不通過與HBV DNA的直接作用，而是通過和肝細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)相互作用而調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)[1]。HBx在調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面均可發(fā)揮作用[2]，在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用。白細(xì)胞介素-10(interleukin-10, IL-10)在多種肝病的預(yù)防和治療中具有一定的應(yīng)用前景，如IL-10水平的改變與肝臟損傷相關(guān)，水平降低時(shí)肝臟受損加重[3]；動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)也已證實(shí)，IL-10具有抑制肝纖維化的作用[4-5]。因此，本研究擬探討HBx基因在肝細(xì)胞增殖、惡性轉(zhuǎn)變中的作用，以及IL-10對(duì)HL-7702/HBx細(xì)胞增殖的作用及其可能的分子機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療HBV相關(guān)性HCC提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 HL-7702/HBx細(xì)胞(轉(zhuǎn)染重組HBx慢病毒載體的HL-7702肝細(xì)胞)、HL-7702/MOCK細(xì)胞(轉(zhuǎn)染慢病毒空載體的HL-7702肝細(xì)胞)、HL-7702細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室凍存。人IL-10(美國PeproTech公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8, 日本Dojindo公司)；Taq DNA聚合酶和MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑(美國Thermo公司);100 bp DNA Ladder(加拿大Fermentas公司);Annexin V-PE凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HL-7702、HL-7702/MOCK、HL-7702/HBx細(xì)胞加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d換液1次，待細(xì)胞融合至70%左右開始傳代，經(jīng)0.25%的胰酶消化并傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因?qū)L-7702細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)期生長的3組細(xì)胞，常規(guī)消化配成單細(xì)胞懸液，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，設(shè)6個(gè)復(fù)孔，接3塊板，分別培養(yǎng)24，48，72 h后取出，棄去原有培養(yǎng)液，用PBS洗滌后，加入混合液(CCK-8∶培養(yǎng)基=10 μL∶100 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于450 nm下檢測每孔吸光度(OD450 nm)。

1.2.3 IL-10對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因的HL-7702細(xì)胞增殖的影響 將備用的HL-7702/HBx細(xì)胞分成5組：對(duì)照組(不加IL-10)及加入20，40，60，80 ng/mL的IL-10組。常規(guī)消化配成單細(xì)胞懸液，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，設(shè)6個(gè)復(fù)孔，接3塊板，各相應(yīng)濃度的藥物作用各組細(xì)胞，3塊板分別作用24，48，72 h后采用CCK-8法檢測，選擇最佳抑制濃度和時(shí)間。另將細(xì)胞分為6組：HL-7702空白組及干預(yù)組、HL-7702/MOCK空白組及干預(yù)組、HL-7702/HBx空白組及干預(yù)組。各空白組不加IL-10試劑，各干預(yù)組加入最佳抑制濃度的IL-10。取對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞，常規(guī)消化，按每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，同步化后各空白組更換培養(yǎng)基，各干預(yù)組更換IL-10，作用時(shí)間為上述實(shí)驗(yàn)得到的IL-10最佳抑制時(shí)間，CCK-8法檢測。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)分為6組，具體分組同1.2.3。各空白組不加IL-10試劑，各干預(yù)組加入最佳抑制濃度的IL-10。取對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞，常規(guī)消化，單細(xì)胞懸液接種于6孔板，細(xì)胞密度為5×105mL-1，每孔2 mL。培養(yǎng)貼壁后，空白組更換培養(yǎng)基，干預(yù)組加入IL-10，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞，離心棄去上清，PBS洗滌，用100 μL Buffer將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105，分別加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD染液，混勻后避光作用，加入Buffer，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率(早期凋亡細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞的總凋亡率之和)。

1.2.5 RT-PCR檢測CDKN1B mRNA的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分為4組：HL-7702細(xì)胞空白組、HL-7702/MOCK細(xì)胞空白組、HL-7702/HBx細(xì)胞空白組、HL-7702/HBx細(xì)胞干預(yù)組。各空白組不加IL-10試劑，干預(yù)組加入最佳抑制濃度的IL-10。Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，用酶標(biāo)儀測RNA濃度，總RNA紫外分光光度計(jì)測OD260 nm及OD280 nm，標(biāo)本總RNA的OD260 nm/OD280 nm均在1.6～1.8。

CDKN1B基因(擴(kuò)增產(chǎn)物為317 bp)：

上游：5’-GGTGCTTGGGAGTTTTGAATG-3’

下游：5’-TCCATACACAGGCAATGAAATAC-3’

人β-actin基因(擴(kuò)增產(chǎn)物為600 bp)：

上游：5’-GCATCGTGATGGACTCCG-3’

下游：5’-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3’

逆轉(zhuǎn)錄體系反應(yīng)條件為42 ℃ 60 min→99 ℃5 min，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20 ℃保存。PCR反應(yīng)體系反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min→95 ℃變性45 s→55 ℃退火30 s→72 ℃延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照記錄。用Image J軟件分析各條帶的灰度值，以CDKN1B與β-actin灰度值比值作為CDKN1B mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，并比較分析各組間的表達(dá)量差異。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因?qū)L-7702細(xì)胞增殖的作用 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，各時(shí)間段(24，48，72 h)HL-7702/HBx細(xì)胞組的OD值均高于HL-7702及HL-7702/MOCK細(xì)胞組(P<0.05，圖1)，而HL-7702和HL-7702/MOCK細(xì)胞組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HL-7702/HBx細(xì)胞組的生長曲線較另外2組細(xì)胞明顯向左偏移，細(xì)胞生長速度明顯加快(圖2)。

與HL-7702/HBx比較，☆：P<0.05.圖1 CCK-8法檢測3組細(xì)胞增殖Fig 1 Proliferation of three groups of cells detected by CCK-8 assay

圖2 細(xì)胞生長曲線Fig 2 Cell growth curve

2.2 IL-10對(duì)HL-7702/HBx細(xì)胞增殖抑制最佳濃度和時(shí)間 作用24 h后，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制傾向逐漸加大，在80 ng/mL時(shí)有顯著差異(P<0.05，表1)。在作用48和72 h后，各濃度均無明顯變化(P>0.05)。故以80 ng/mL、作用24 h作為本實(shí)驗(yàn)IL-10對(duì)HL-7702/HBx細(xì)胞增殖抑制的最佳濃度和時(shí)間。

表1 不同濃度的IL-10在不同作用時(shí)間下對(duì)HL-7702/HBx細(xì)胞增殖的影響

Tab 1 Effects of IL-10 on the proliferation of HL-7702/HBx cells

ρIL?10(ng·mL-1)t培養(yǎng)/h24487201．023±0．0452．429±0．0493．067±0．046201．02±0．0322．392±0．0812．98±0．102401．009±0．0252．372±0．0392．995±0．08600．98±0．0382．419±0．0513．105±0．053800．892±0．047☆2．383±0．0673．029±0．125

n=6. 表中數(shù)據(jù)為OD值. IL-10：白細(xì)胞介素10. 與0 ng/mL比較，☆：P<0.05.

2.3 IL-10對(duì)HL-7702,HL-7702/MOCK,HL-7702/HBx細(xì)胞增殖的作用 用CCK-8法檢測80 ng/mL的IL-10作用24 h后6組細(xì)胞的活力，HL-7702及HL-7702/MOCK細(xì)胞的空白組與干預(yù)組的OD值差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)，而HL-7702/HBx細(xì)胞的干預(yù)組比空白組的OD值明顯減小(P<0.05，圖3)，說明IL-10對(duì)HL-7702/HBx細(xì)胞增殖具有抑制作用，而對(duì)HL-7702和HL-7702/MOCK細(xì)胞增殖無影響。

HL-7702/HBx空白組與干預(yù)組比較，☆：P<0.05.圖3 IL-10對(duì)HL-7702，HL-7702/Mock及HL-7702/HBx 3組細(xì)胞增殖的影響Fig 3 Effects of IL-10 on the proliferation of the 3 groups of cells

2.4 IL-10對(duì)HL-7702,HL-7702/MOCK,HL-7702/HBx細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)于HL-7702,HL-7702/MOCK及HL-7702/HBx 3組細(xì)胞，各細(xì)胞空白組和干預(yù)組間的比較差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2，圖4)，說明IL-10對(duì)HL-7702，HL-7702/MOCK及HL-7702/HBx細(xì)胞凋亡均無影響。

2.5 IL-10對(duì)CDKN1B mRNA相對(duì)表達(dá)水平的影響 4組細(xì)胞均在317 bp處出現(xiàn)CDKN1B的陽性條帶(圖5)。與HL-7702空白組比較，HL-7702/MOCK空白組的CDKN1B mRNA相對(duì)表達(dá)量并無明顯變化(P>0.05)；與HL-7702空白組及HL-7702/MOCK空白組比較，HL-7702/HBx空白組的CDKN1B mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下降(P<0.05)，且HL-7702/HBx干預(yù)組較HL-7702/HBx空白組明顯升高(P<0.05，圖6)。

表2 6組細(xì)胞凋亡率比較

Tab 2 Compared the apoptosis rates of the six groups of cells

分 組凋亡率/%空白組干預(yù)組HL?77027．02±4．814．13±1．25HL?7702/MOCK2．43±1．711．16±0．33HL?7702/HBx4．34±0．255．91±2．11

n=3.

圖4 各組細(xì)胞即刻凋亡流式細(xì)胞圖Fig 4 Flow cytometry about apoptosis rates of cells in each group

3 討 論

HBx可顯著加快正常肝細(xì)胞的增殖速度，促進(jìn)肝細(xì)胞向惡性增殖細(xì)胞發(fā)展[6-7]，還可通過抑制細(xì)胞凋亡途徑導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡受阻而誘發(fā)其惡性轉(zhuǎn)化[8]。表明HBx可能通過介導(dǎo)肝細(xì)胞的增殖和凋亡，調(diào)節(jié)失衡，誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，在HCC的起病和形成中扮演重要角色。本研究發(fā)現(xiàn)，HL-7702/HBx細(xì)胞增殖速度明顯快于HL-7702細(xì)胞和HL-7702/MOCK細(xì)胞，進(jìn)一步支持上述觀點(diǎn)。

M：marker； 1，5：HL-7702空白組； 2，6：HL-7702/MOCK空白組； 3，7：HL-7702/HBx空白組； 4，8：HL-7702/HBx干預(yù)組.圖5 RT-PCR法檢測4組細(xì)胞CDKN1B mRNA的表達(dá)Fig 5 Expression of CDKN1B mRNA in 4 groups of cells as analyzed by RT-PCR

1：HL-7702空白組；2：HL-7702/MOCK空白組；3：HL-7702/HBx空白組；4：HL-7702/HBx干預(yù)組. 與HL-7702/HBx空白組比較，☆：P<0.05.圖6 RT-PCR檢測CDKN1B mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig 6 Relative expression of CDKN1B mRNA analyzed by RT-PCR

IL-10作為一種已知的抑制性細(xì)胞因子，廣泛參與炎癥過程與免疫病理過程的負(fù)性調(diào)節(jié)。近年發(fā)現(xiàn)，IL-10的免疫活化功能亦可對(duì)腫瘤起到抑制作用[9-10]，如在卵巢癌、乳腺癌等腫瘤中表達(dá)的IL-10，有利于抗腫瘤效應(yīng)，表現(xiàn)為抑制腫瘤的生長及侵犯。研究表明，IL-10在肝病的治療方面有一定的應(yīng)用前景，如機(jī)體可通過刺激枯否氏細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞分泌IL-10減輕酒精性肝損害[11]；IL-10可通過抑制肝星狀細(xì)胞活化從而減輕肝纖維化[12]。值得注意的是，在抗HBx抗體陽性的慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化及HCC患者體內(nèi)，IL-10水平均明顯升高，提示二者間存在關(guān)聯(lián)，但具體關(guān)系尚不明確[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在使用20～80 ng/mL的IL-10干預(yù)的24 h內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，IL-10對(duì)HL-7702/HBx細(xì)胞增殖的抑制作用有加大的傾向，當(dāng)濃度為80 ng/mL時(shí)，與空白組比較差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故選擇80 ng/mL作用24 h為最佳實(shí)驗(yàn)條件。繼續(xù)測定IL-10對(duì)HL-7702細(xì)胞和HL-7702/MOCK細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，2種細(xì)胞的干預(yù)組和空白組的細(xì)胞增殖速度并無差別，推測IL-10對(duì)HL-7702細(xì)胞和HL-7702/MOCK細(xì)胞的增殖并無影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測則發(fā)現(xiàn)，IL-10對(duì)HL-7702，HL-7702/HBx及HL-7702/MOCK細(xì)胞的凋亡均無明顯影響。推測IL-10能抑制穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因的HL-7702細(xì)胞的增殖而無促其凋亡的作用，說明IL-10對(duì)阻止HBx基因所致肝細(xì)胞增殖失控和惡性轉(zhuǎn)化可能具有一定作用，預(yù)示IL-10在防治HBV相關(guān)性HCC可能具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控是導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變致腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。CDKN1B是細(xì)胞周期中一個(gè)重要的負(fù)性調(diào)控因子，許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與其表達(dá)下調(diào)相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，HL-7702/HBx細(xì)胞的CDNK1B mRNA的表達(dá)量較HL-7702細(xì)胞和HL-7702/MOCK細(xì)胞均下調(diào)，說明CDKN1B表達(dá)量的減少可能是HBx基因致HL-7702細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制之一。有報(bào)道指出，IL-10可通過上調(diào)細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控蛋白P27的水平從而抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖[15]。本研究結(jié)果與之相似，在使用80 ng/mL的IL-10作用24 h后，HL-7702/HBx干預(yù)組的CDKN1B mRNA表達(dá)量較空白組明顯增高，提示IL-10抑制HL-7702/HBx細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與其上調(diào)CDKN1B mRNA的表達(dá)有關(guān)，而具體機(jī)制還需運(yùn)用更為精確的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步驗(yàn)證與探討。

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(編輯：何佳鳳)

The Effect of IL-10 on the Proliferation of HL-7702 Cells Stably Expressing HBx Gene

ZHANG Jie, ZHENG Biyun, CHEN Zhixin, LI Dan, WANG Xiaozhong

Department of Gastroenterology, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China

Objective To investigate the effect of interleukin-10(IL-10) on the proliferation of HL-7702 cells stably expressing hepatitis B virus X protein(HBx) gene. Methods Cell-counting Kit-8(CCK-8) assay were explored to detect the effect of HBx gene on the proliferation of HL-7702 cells and the effect of IL-10 on the proliferation of HL-7702 cells stably expressing HBx gene. Flow cytometry was used to analyze the effect of IL-10 on the apoptosis of HL-7702/HBx cells. RT-PCR was used to detect the effect of HBx gene on the expression of CDKN1B mRNA in HL-7702 cells and the effect of IL-10 on the expression of CDKN1B mRNA in HL-7702/HBx cells. Result The data of CCK-8 assay showed that the proliferation rate of HL-7702/HBx cells was significantly faster than HL-7702 and HL-7702/MOCK cells(P<0.05). The proliferation of the HL-7702/HBx cells was significantly inhibited after being treated with 80 ng/mL IL-10 for 24 hours(P<0.05). In addition, treatment of IL-10 of 80 ng/mL for 24 hours had no effects on the apoptosis of HL-7702, HL-7702/MOCK and HL-7702/HBx cells. Compared with HL-7702 and HL-7702/MOCK cells, the expression of CDKN1B mRNA level in HL-7702/HBx cells was decreased(P<0.05). After the treatment of 80 ng/mL IL-10 for 24 hours, the expression of CDKN1B mRNA level in HL-7702/HBx cells had increased(P<0.05). Conclusions HBx gene can promote the proliferation of HL-7702 cells. IL-10 can inhibit the proliferation of HL-7702/HBx cells but has no effect on the apoptosis. HBx gene probably enhances the proliferation of HL-7702/HBx cells by down-regulating the expression of CDKN1B mRNA. IL-10 can inhibit the proliferation of HL-7702/HBx cells which was probably related to the up-regulation of the expression of CDKN1B mRNA.

viral proteins; hepatocytes; hepatitis B virus; interleukin-10; cell transformation, neoplastic; cell proliferation

2016-08-01

福建省臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)?？瀑Y助項(xiàng)目(閩衛(wèi)科教[2012]149號(hào))；福建省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(2016J05189)；福建省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)中青年骨干重點(diǎn)項(xiàng)目(2014-ZQN-ZD-9)

福建醫(yī)科大學(xué) 附屬協(xié)和醫(yī)院消化科，福州 350001

張 潔，女，住院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士

王小眾. Email: drwangxz@163.com

R341；R394；R73-37；R735.7；R977.6

A

1672-4194(2017)02-0077-05