劉衛(wèi)東,宋 倫,吳 景

1 遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院, 大連 116023 2 遼寧省海洋環(huán)境監(jiān)測總站, 大連 116023

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環(huán)境樣本中微型和微微型浮游植物高通量測序的引物優(yōu)化

劉衛(wèi)東1,2,*,宋 倫1,2,吳 景1,2

1 遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院, 大連 116023 2 遼寧省海洋環(huán)境監(jiān)測總站, 大連 116023

分別以18SrDNA的V4區(qū)和V9區(qū)為目標基因,采用高通量測序平臺和生物信息學方法,分析海水樣品中微型和微微型浮游植物多樣性。利用在線分析軟件對V4(F/R)、V9(F/R)和C4(F/R)3對引物的敏感性、特異性進行了評估和比較,發(fā)現(xiàn)自行設計的引物V4(F/R)對真核藻類的擴增特異性高于V9(F/R)和C4(F/R)。高通量測序結(jié)果顯示,檢測樣品平均獲得68834條原始序列,高質(zhì)量數(shù)據(jù)占99%以上,獲得基因注釋的序列數(shù)達94%以上。3對引物V4(F/R)、V9(F/R)、C4(F/R)鑒定的平均微型/微微型浮游植物OTUs數(shù)分別為78、42、58,引物V4(F/R)鑒定效率相對較高,同時對細小微胞藻(Micromonaspusilla)、(金牛微球藻Ostreococcustauri)、密球藻(Pycnococcusprovasolii)、抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)、赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)等優(yōu)勢種檢出頻率高于引物V9(F/R)。相對已發(fā)表的2對引物,設計的引物V4(F/R)對海洋微型和微微型藻類多樣性檢測更為高效。

微型浮游植物; 微微型浮游植物; 高通量測序; 18S rDNA可變區(qū)V4; 可變區(qū)V9

海洋微型和微微型浮游真核藻類具有生長快、密度高、分布廣等特點,是海洋初級生產(chǎn)力的重要貢獻者,同時也是赤潮、褐潮暴發(fā)的致災種[1]。由于微型和微微型藻類個體微小、缺乏形態(tài)學分類指標、多數(shù)難以分離培養(yǎng)、無法大量單純富集,所以傳統(tǒng)的分類學方法鑒定較為困難。分子生物學的快速發(fā)展,為微型和微微型藻類的多樣性研究帶來了新突破[2- 4]。Handelsman等[5]于1998年正式提出了宏基因組學,主要以環(huán)境樣品中的微生物群基因組為研究對象；以功能基因篩選、測序分析為研究手段；以微生物多樣性、種群結(jié)構、系統(tǒng)進化及與環(huán)境之間的關系為研究目的。其研究對象已從最初的土壤微生物發(fā)展到水體微生物和海樣浮游生物[6]。宏基因?qū)W主要的研究手段之一是根據(jù)核糖體基因rDNA數(shù)據(jù)庫進行引物設計,通過系統(tǒng)發(fā)生學分析得到該環(huán)境中生物的遺傳多樣性和分子生態(tài)學信息[7]。核糖體基因rDNA序列進化變異頻率緩慢,是生物群落系統(tǒng)進化分類研究主要基因之一,它包括糖體小亞基基因18S rDNA、5.8S rDNA、大亞基基因28S rDNA和轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS。其中核糖體小亞基基因18S rDNA存在于所有真核生物中,是同時具有信息和功能兩種作用的核糖體編碼基因[8],其數(shù)據(jù)庫豐富、基因序列種類廣泛,對引物設計、構建物種親緣關系等方面都具有不可替代的優(yōu)勢。18S rDNA由保守區(qū)和可變區(qū)交替排列組成,具有9個可變區(qū)[9],可作為種屬鑒定的分子標記。

Moon-van der Staay和LópezGarcía通過構建18S rDNA克隆文庫和分子系統(tǒng)樹,分別研究了太平洋近赤道海域表層海水和南極深海中微微型真核浮游生物的多樣性[10- 11]。在我國邵鵬、袁杰等人分別對廈門西海域和南沙群島海域微型和微微型浮游藻類建立了18S rDNA克隆文庫,分析了該水域浮游藻類的多樣性[12- 14]。自2005年起,高通量測序技術發(fā)展飛速,由于該技術具有簡單快速、測序通量高、錯誤率低和成本低廉等特點,加速了宏基因組學的發(fā)展[15]。Stoeck和Behnke等人對18s rDNA的可變區(qū)在真核生物多樣性研究中的作用進行了分析,為基因標記的選擇提供了參考[16- 17]。V4區(qū)和V9區(qū)是目前廣泛應用于真核生物多樣性研究的目標基因。Amaral-Zettler通過以18s rDNA可變區(qū)V9為目標基因設計引物,利用高通量測序技術研究了海洋浮游生物多樣性[18]。Stoeck等對以18s rDNA的V4和V9區(qū)為目標基因,結(jié)合高通量技術獲得了挪威峽灣中真核浮游生物的多樣性[16]。

由于不同引物對環(huán)境中生物多樣性的檢測效率差異較大,針對微型和微微型浮游植物,本研究分別以18SrDNA的V4區(qū)和V9區(qū)為目標基因設計和選擇引物進行擴增,對引物的敏感性和特異性進行評估和比較分析,采用高通量測序平臺和生物信息學方法,應用于遼東灣海域進行微型和微微型浮游植物檢測驗證,篩選高效檢測引物。

1 材料和方法

1.1 引物設計

本文針對目前已知的微型/微微型真核藻類以及黃渤海近岸赤潮生物種類設計了兩對引物。首先于NCBI數(shù)據(jù)庫調(diào)取相關序列,其中包括微微型真核藻類45種、中國近岸赤潮生物71種及常見真核藻類73種,涵蓋8個門、18個綱、179條序列。利用軟件MEGA4對序列進行多重序列比對,找到對應的V4區(qū),同時結(jié)合Hiseq2500 PE250測序技術要求進行引物設計,片段長度為300—450bp,為增加測序結(jié)果的準確性,充分利用測序技術,以V4區(qū)為核心區(qū)及兩側(cè)的保守區(qū)設計引物,獲得兩對引物V4(F/R),使用FPCR軟件檢測引物對的退火溫度Tm、CG含量,以及是否會產(chǎn)生二聚體,利用OligoCalc軟件檢測引物自身的互補性,包括潛在的發(fā)夾結(jié)構、3′端的互補性、自身退火位點的個數(shù)等基本參數(shù)。

1.2 引物敏感性、特異性評估

采用在線軟件TaxMan,根據(jù)核糖體基因數(shù)據(jù)庫,以多來源的rDNA為模板,通過多序列全局比對,對引物擴增的生物類群和未擴增的生物類群物種數(shù)量進行預測統(tǒng)計及比較,進而對3對引物的敏感性、特異性進行評估。本實驗選取已發(fā)表的海洋真核生物高通量測序引物V9(F/R)和C4(F/R)作為比較分析參照物[16]。

1.3 浮游植物鑒定

1.3.1 形態(tài)學鑒定

分別在遼東灣長興島海域采集3份浮游植物水樣,經(jīng)福爾馬林固定后帶回實驗室進行顯微鏡檢測。

1.3.2 分子鑒定

(1)樣品采集

現(xiàn)場采集1L表層海水,經(jīng)20 μm微孔濾膜過濾去除小型及大型浮游生物,然后用0.22 μm微孔濾膜過濾收集微型和微微型浮游生物,最后將濾膜轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌離心管中,置于-20 ℃或-80 ℃冷凍保存、運輸。

(2)DNA提取

采用CTAB法提取浮游生物基因組,將0.22 μm濾膜剪碎于1.5 mL離心管中,加入500 μL CTAB 裂解液(2% CTAB;100 mmol/L Tris-Cl pH 8.0；1.4 mmol/L NaCl；10 mmol/L EDTA)和1 μL β-巰基乙醇,5—10 μL蛋白酶K,55℃裂解1—1.5 h。短暫離心,取出液體于新的離心管中,用酚氯仿抽提2次后,取上清,加入兩倍體積預冷的無水乙醇,沉淀2—3 h,保留沉淀,使用75%乙醇清洗沉淀,得到微型浮游生物基因組DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并利用紫外分光光度計測定DNA濃度及純度,-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)引物合成和PCR擴增

引物序列設計完成,交由上海生工生物公司進行合成。PCR反應體系為50 μL,包括PCR Buffer 5 μL、dNTP Mixture 8μL、上下游引物(10 μmol/L)各2 μL、模板DNA 2 μL、Taq DNA聚合酶2.5 U,加適量滅菌水。擴增反應均在PE 9700型PCR儀(PE公司)上完成,反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s,58℃退火45 s,72℃延伸45 s,共33個循環(huán)；72℃延伸5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。將檢測合格產(chǎn)物交由諾和致源生物信息科技有限公司,使用NEB Next? UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina(New England Biolabs)建庫試劑盒進行文庫的構建,構建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測,合格后,使用Hiseq2500 PE250進行上機測序。

(4)數(shù)據(jù)分析

測序得到的原始數(shù)據(jù)使用FLASH軟件進行拼接,參照Qiime軟件質(zhì)量控制流程,將拼接后的序列經(jīng)過截取、過濾得到有效數(shù)據(jù)。利用Uparse軟件對有效數(shù)據(jù)進OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析,RDP Classifier方法與Silva數(shù)據(jù)庫對OUTs代表序列進行物種注釋分析。再對OTUs進行豐度、多樣性指數(shù)等分析,同時對物種注釋在各個分類水平上進行群落結(jié)構的統(tǒng)計分析。最后在以上分析的基礎上,可以進行一系列的基于OTUs和物種組成的聚類分析,挖掘樣品內(nèi)和樣品間的物種組成差異。

2 結(jié)果

2.1 引物設計

利用軟件MEGA4對179條序列進行多重序列比對,找到對應的V4和V9區(qū),同時結(jié)合測序技術要求進行引物設計,片段長度為300—450bp,并使用FPCR、OligoCalc等軟件對引物的基本參數(shù)進行檢測和評估,其基本參數(shù)滿足引物設計的基本要求,引物設計結(jié)果見表1。

表1 微型藻類18S rDNA可變區(qū)擴增引物序列

2.1 引物敏感性、特異性評估

采用在線軟件Taxman對3對引物的敏感性、特異性進行評估,結(jié)果如表2。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,引物V9(F/R)對的整體擴增效率低于引物V4(F/R)和C4(F/R),引物V4(F/R)對真菌、后生動物、領鞭毛蟲目類群的擴增特異性低于C4(F/R),對定鞭藻綱、綠藻門等生物類群的擴增特異性高于C4(F/R),說明V4(F/R)在擴增真核藻類類群中較有優(yōu)勢。

表2 引物對擴增SILVA數(shù)據(jù)庫中真核生物類群的特異性統(tǒng)計

引物對主要擴增真核類群的頻數(shù)分布,()內(nèi)的數(shù)字表示擴增該類群的序列數(shù),()前的數(shù)字表示擴增序列數(shù)占該類群序列數(shù)的比例

2.2 引物對基因組DNA擴增產(chǎn)物檢測

圖1 引物擴增片段檢測 Fig.1 PCR amplification of representative DNA templates with rDNA primer sets

為了比較3對引物在實際樣品中對真核藻類擴增特異性的差異,對采集的3份樣品分別進行了引物擴增。擴增產(chǎn)物的檢測結(jié)果見圖 1,本文中3對引物V4(F/R)、V9(F/R)和C4(F/R)的擴增產(chǎn)物片段分別為370bp、135bp、380bp左右,圖1顯示,片段長度檢測結(jié)果與設計要求相符,擴增產(chǎn)物量滿足測序需求,PCR體系合格。

2.3 不同引物對的測序結(jié)果

通過IlluminaHiSeq2500測序平臺PE250測序,得到的原始數(shù)據(jù)使用FLASH軟件進行拼接,參照Qiime軟件質(zhì)量控制流程,將拼接后的序列經(jīng)過截取、過濾得到有效數(shù)據(jù)。每個樣品平均獲得68834條原始序列,經(jīng)過拼接和質(zhì)量過濾,每個樣品平均得到68420條有效序列,高質(zhì)量數(shù)據(jù)占到99%以上,獲得基因注釋的序列數(shù)在97%以上,表明測得的數(shù)據(jù)準確可靠。9個樣品測序結(jié)果見表3。

為了研究樣品的物種組成多樣性信息,使用Uparse軟件對所有樣品的有效序列進行聚類,以97%的一致性將序列聚類成為OTUs。每個樣品平均獲得308個OTUs,每個OTUs代表一類物種。3對引物V4(F/R)、V9(F/R)和C4(F/R)鑒定的平均微型/微微型浮游植物OTUs數(shù)分別為78、42、58。

表3 有效序列數(shù)及OTUs數(shù)

2.4 鏡檢優(yōu)勢種屬與分子鑒定結(jié)果比較

鏡檢優(yōu)勢種屬與高通量測序結(jié)果見表4。從結(jié)果中可以看出引物V4(F/R)對鏡檢優(yōu)勢種屬的檢出率與引物C4(F/R)相當,并且都高于引物V9(F/R),對于樣品中物種多樣性的挖掘,引物V4(F/R)略高于引物C4(F/R),且明顯高于引物V9(F/R)。

表4 鏡檢優(yōu)勢種屬與分子檢測結(jié)果

根據(jù)表5注釋結(jié)果,在種水平下,統(tǒng)計3對引物對應的測序鑒定結(jié)果,引物V4(F/R)鑒定出的浮游植物數(shù)量多于V9(F/R)和C4(F/R)鑒定出的數(shù)量。3對引物對優(yōu)勢種Dolichomastixtenuilepis,細小微胞藻(Micromonaspusilla)、金牛微球藻(Ostreococcustauri)、密球藻(Pycnococcusprovasolii)、里氏金色藻(Chrysochromulinaleadbeateri)、抑食金球藻(Aureococcusanophagefferens)、赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)等微型和微微型浮游植物的鑒定能力比較,引物V4(F/R)與C4(F/R)相近,二者強于V9(F/R)。

表5 3對引物鑒定浮游植物種類

+表示引物擴增片段的注釋結(jié)果在3個樣品中任意出現(xiàn)一次即標記+

3 討論

分子生物學技術極大地推動了微型真核藻類多樣性的研究。目前,世界各大海域的微微型浮游生物分子多樣性逐步開展研究,相關基因文庫數(shù)據(jù)也在不斷更新和擴充[19- 22]。針對海洋微型和微微型藻類鑒定方面存在的難題,本實驗選擇18S rDNA的可變區(qū)作為目標基因,構建高通量測序文庫,應用生物信息學處理數(shù)據(jù),對海洋微型和微微型藻類進行了多樣性研究。18S rDNA結(jié)構和功能保守,區(qū)分力可達種屬水平,常用于真核生物物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)生學分析。18SrDNA全長序列交替排列著保守區(qū)和可變區(qū),反映了生物種間的親緣關系和物種間的差異,利用了保守區(qū)設計引物,擴增出可變區(qū),根據(jù)不同種屬可變區(qū)的序列特征進行分類[23]。真核生物共含有8個可變區(qū),其中V4和V9區(qū)是目前廣泛使用的真核生物標記基因[24]。Wuyts等比較分析了3253條核糖體rDNA核酸序列的V4區(qū),發(fā)現(xiàn)該區(qū)域為真核生物核糖體rDNA種多樣性最大的區(qū)域[25]。Stoeck和Micah等人研究發(fā)現(xiàn),V4區(qū)在區(qū)分親緣關系較近的物種具有較大優(yōu)勢[16],且與V9區(qū)相比,V4區(qū)得到的實驗結(jié)果更接近于以18S rDNA全長為目標基因的研究結(jié)果[23,26]。18S rDNA的V4區(qū)變異較大、長度較長、均一性好,適用于高通量測序技術,是微微型藻類鑒定的良好目標基因。

本文通過對3對引物的敏感性、特異性進行評估結(jié)果顯示：引物V4(F/R)對真菌、后生動物、領鞭毛蟲目類群的擴增特異性要低于V9(F/R)和C4(F/R),而對真核藻類的擴增特異性均高于V9(F/R),擴增紅藻門的特異性低于C4(F/R)。為了驗證引物V4(F/R)、V9(F/R)和C4(F/R)對海水樣品中微型/微微型浮游植物多樣性分析的可行性和差異性,采用IlluminaHiSeq2500測序平臺PE250測序,解析出在種的水平下每對引物對應的平均微型/微微型浮游植物OTUs數(shù),并與樣品的顯微鏡檢測結(jié)果進行比較。結(jié)果顯示,引物對V4(F/R)在微型/微微型浮游植物種類數(shù)鑒定方面優(yōu)于其他兩對引物。高通量測序獲得浮游植物種類與顯微鏡觀察結(jié)果進行比較,引物V4(F/R)對鏡檢結(jié)果中的藻類的檢出率與引物C4(F/R)相同,并且都高于引物V9(F/R),對于樣品中物種多樣性的挖掘能力,引物V4(F/R)略高于引物C4(F/R),且明顯高于引物V9(F/R)。

根據(jù)注釋結(jié)果,在種水平下,統(tǒng)計3對引物對應的擴增產(chǎn)物的鑒定結(jié)果,3對引物對優(yōu)勢種細小微胞藻、金牛微球藻、密球藻、里氏金色藻、抑食金球藻、赤潮異彎藻等微型和微微型浮游植物的鑒定能力,引物V4(F/R)與C4(F/R)相近,二者高于V9(F/R)。其中,金牛微球藻是一種單細胞綠藻,直徑0.8μm左右,是目前發(fā)現(xiàn)的個體最小、細胞結(jié)構簡單、基因組結(jié)構卻十分復雜的自養(yǎng)真核細胞生物[27]。Vaquer等[2]發(fā)現(xiàn)了法國肖瀉湖(Thaulagoon)金牛微球藻豐度與銅含量有關,并發(fā)現(xiàn)貝類無法攝食這種藻類。赤潮異彎藻是一種細胞微小、分布廣泛、廣溫、廣鹽性赤潮藻種,對其他生物影響較大[29- 31]。抑食金球藻,呈金光色球形或亞球形,直徑2μm左右,屬于微微型藻類,是目前發(fā)現(xiàn)引發(fā)褐潮的主要種類,對生態(tài)環(huán)境和漁業(yè)養(yǎng)殖影響較大[32]。2013年7月在長興島近岸海域出現(xiàn)水色異?，F(xiàn)象,經(jīng)分子檢測,主要優(yōu)勢種為抑食金球藻,豐度超過107個/L[33]。于杰等人利用通用引物擴增18S rDNA可變區(qū)V9后,結(jié)合高通量技術,建立浮游生物多樣性高效檢測技術,對渤海海域的4個褐潮多發(fā)區(qū)的優(yōu)勢藻種進行分析,發(fā)現(xiàn)抑食金球藻和多形微眼藻共同引發(fā)了該海域的褐潮[34]。

本研究表明,以18S rDNA的V4區(qū)作為目標基因,設計引物V4(F/R),借助IlluminaHiSeq 2500 PE250高通量測序平臺和生物信息學方法,建立了海洋微型和微微型藻類高效檢測方法。該方法既傳承了傳統(tǒng)分子技術的特點,又具有一些獨特的優(yōu)勢：測序通量高,實驗流程簡單；數(shù)據(jù)處理快速、準確；靈敏度高；節(jié)約成本；適用性廣泛。針對海洋中不同水域、水層、時間的微型/微微型浮游植物多樣性的研究均適用。

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Optimization of high-throughput sequencing primers for nanophytoplankton and picophytoplankton in environmental samples

LIU Weidong1,2,*, SONG Lun1,2, WU Jing1,2

1LiaoningOceanandFisheriesScienceResearchInstitute,Dalian116023,China2LiaoningOceanEnvironmentMonitoringStation,Dalian116023,China

In this study, nanophytoplankton and picophytoplankton diversity in seawater samples was analyzed using a high-throughput sequencing platform and a series of bioinformatics tools, based on the V4 and V9 region of 18S rDNA as the target gene. High-throughput sequencing, which is considered as one of the most important tools in genomics research, is widely applied in the field of marine nanophytoplankton and picophytoplankton diversity studies. We successfully obtained a pair of nanophytoplankton and picophytoplankton PCR primers V4(F/R)by analyzing the nucleic acid database and using a series of bioinformatics tools. Two pairs of universal primers were also selected for comparative analysis, which amplified variable region V4 and V9 of the small subunit nuclear ribosomal DNA (SSU nrDNA).The sensitivity and specificity of PCR primers V4(F/R), V9(F/R), and C4(F/R) were also evaluated and compared using online bioinformatics software. The results showed that the amplification specificity of primer pair V4(F/R) was better than that of V9(F/R) and C4(F/R) in eukaryotic algae. High-throughput sequencing results showed that 68834 raw tags were amplified by the primers, 99% of which were effective tags. Sequences of more than 94% of the effective tags were identified by Ribosomal Database ProjectClassifier, among which 308 operational taxonomic units (OTUs) of one sample were used for further analysis. The average numbers of nanophytoplankton and picophytoplankton OTUs amplified by V4(F/R), V9(F/R), and C4(F/R),were 78, 42, 58,respectively. The primer pair V4(F/R) was found to have higher sensitivity and specificity for amplifying nanophytoplankton and picophytoplankton, includingMicromonaspusilla,Ostreococcustauri,Pycnococcusprovasolii,Aureococcusanophagefferens,andHeterosigmaakashiwo. The V4 region from the environmental eukaryotic 18S rDNA gene could be suitable for high-throughput sequencing technology, and it was also a good target gene formarine nanophytoplankton and picophytoplankton identification. This study demonstrates the use of a simple, rapid, high sensitivity, and low-cost technology to explore marine nanophytoplankton and picophytoplankton diversity. Moreover, it also provides a reference for the early warning and control of brown tide disasters.

nanophytoplankton; picophytoplankton; high-throughput sequencing; variable region V4 of 18S rDNA; variable region V9

遼寧省自然科學基金資助項目(2014020182);中國海洋發(fā)展研究會重大項目資助(CAMAZDA201605);遼寧省海洋與漁業(yè)科研項目(201611);遼寧省科學技術計劃項目(2015103044);海洋公益性行業(yè)科研專項(201505019)

2016- 05- 18;

2016- 12- 22

10.5846/stxb201605180963

*通訊作者Corresponding author.E-mail: cnliu51@126.com

劉衛(wèi)東,宋倫,吳景.環(huán)境樣本中微型和微微型浮游植物高通量測序的引物優(yōu)化.生態(tài)學報,2017,37(12):4208- 4216.

Liu W D, Song L, Wu J.Optimization of high-throughput sequencing primers for nanophytoplankton and picophytoplankton in environmental samples.Acta Ecologica Sinica,2017,37(12):4208- 4216.