憂遁草的抗氧化作用研究

彭亞博　林其洋　魏釗異

摘 要：憂遁草（Clinacanthus nutans CN）是東南亞地區(qū)著名的中草藥植物，含有多種植物化學成分，常被使用于治療炎癥與癌癥。該研究通過測定還原力、ABTS自由基、DPPH自由基以及羥自由基的清除能力，對憂遁草的抗氧化性進行了全面評估，通過不同產地的憂遁草提取物和torlox的對比得到了海南憂遁草對DPPH自由基、ABTS自由基、以及羥自由基的IC50分別為0.895mg/mL、0.494mg/mL和0.932mg/mL，產自揭陽憂遁草IC50為0.685mg/mL、0.262mg/mL、0.801mg/mL?？梢?，憂遁草具有較好的抗氧化作用，且產自揭陽的憂遁草提取物的抗氧化能力優(yōu)于產自海南的憂遁草提取物。

關鍵字：憂遁草；抗氧化；研究進展

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）14-0025-05

Abstract：The antioxidant potentials of the methanol extracts from CN were measured as 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） and 2，2'-azinobis- （3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid） （ABTS） radical scavenging abilities as well as the reducing power assay.IC50 of CN extract from Hainan Province were respectively 0.895mg/mL（DPPH），0.494mg/mL（ABTS） and 0.932mg/mL（OH-），while these values of CN extract from Jieyang were 0.685mg/mL（DPPH）and 0.262mg/mL （ABTS），0.801mg/mL（OH-）.The result illustrated that the antioxidant activities of CN extract from Jieyang was stronger than that of Hainan.It suggested that CN extract could be considered as natural antioxidant sources and dietary nutritional supplements to prevent oxidation-related diseases.

Key words：Clinacanthus nutans；Antioxidant activity；Research progress

憂遁草為爵床科（Acanthaceae）鱷嘴花屬鱷嘴花Clinacanthus nutans的全草，早期歸類于扭序花屬，其別名有鱷嘴花、扭序花、青箭、沙巴蛇草、柔刺草等，廣泛分布于馬來西亞、泰國、印度尼西亞以及我國南部至西南部如海南、廣東、廣西、云南等地區(qū)。在東南亞國家，尤其是泰國和馬來西亞，憂遁草是當?shù)匾环N比較著名且廣泛使用的藥用植物，我國《廣西藥用植物名錄》最早記錄了該種藥用植物該植物繁殖一般利用莖切為主要繁殖方式[1-3]。近年來，憂遁草引起了全世界科研人員的目光，源于一名馬來西亞淋巴癌患者服用憂遁草而痊愈的事件，受到了許多患者的親睞，目前，國內銷售的憂遁草主要來源于海南五指山地區(qū)和廣東揭陽地區(qū)。

通過許多研究者的努力，憂遁草中的主要成分已經被逐漸探明，憂遁草內含有多種不同類型的化合物，主要包括三萜類、黃酮碳苷類、葉綠素類，含硫糖苷類以及植物甾醇類以及一些小分子化合物和生物堿。有學者在20世紀70年代發(fā)現(xiàn)了憂遁草中含有三萜類化合物如羽扇豆醇、白樺脂醇[4，5]，其后，有學者從憂遁草中又發(fā)現(xiàn)了諸如（clinacoside A、clinacoside B、clinacoside C）的含硫糖苷類物質[6]。Teshima KI等[7]研究結果發(fā)現(xiàn)了憂遁草中含有某些黃酮碳苷類如牡荊草素等，徐淑芬[8]與Tu SF等[9]從憂遁草中分離純化獲得了一些含硫化合物。Ayudhya TDN[10]和SakdaratS等[11]在研究中分別分離純化得到了3種和8種葉綠素，Ayudhya TDN分離純化得到的是3種脫鎂葉綠素，而SakdaratS則得到8種葉綠素，其中有5種結構沒有被探明，但有3種結構與葉綠素和葉綠素類似。憂遁草中還富含鈣、鐵、鎂等微量元素以及多種氨基酸和其他化合物。此外還含大量人體必需氨基酸、脂肪酸、礦物質[12]。Yong YK[13]采用在分析憂遁草的抗腫瘤和抗氧化成分時，得到了多個小分子化合物。如正十五醇（n-pentadecanol）、二十烷（eicosane）、十七烷（heptadecane）、二十一烷（heneicosane）鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate）、山崳醇（behenic alcohol）等。

憂遁草是東南亞國家及泰國地區(qū)著名的中草藥植物，常被用于治療各種疾病，許多藥效學研究已證明憂遁草在抗單純皰疹病毒方面有其獨特的效用[14，15]。臨床上將憂遁草用于治療生殖器皰疹及帶狀皰疹均也取得了較為良好的效果，臨床效果表現(xiàn)良好[16]。憂遁草在抗病毒方面已有的研究主要包括以下幾個方面：Kongkaew C等[17，18]研究憂遁草的提取物對HSV-1F的抑制作用，Vachirayon-stien T 等[19]指出在被病毒感染前，憂遁草提取物對HSV-2具有較為顯著的抑制作用，其作用機制可能為憂遁草與病毒表面的某些分子相互作用而成。與此同時，Thawaranantha D等[20]采用 DNA 雜交技術研究，證明了憂遁草在抗人乳頭瘤病毒（HPV）方面具有良好的抑制作用。有學者研究憂遁草莖葉部分4個不同萃取部位對免疫功能的效果評估，結果表明乙醇萃取物具有良好的免疫調節(jié)活性。有研究表明憂遁草莖的乙醇提取物對離體大鼠膀胱的抑制收縮作用優(yōu)于葉的提取物[21]。在泰國及馬來西亞等地，憂遁草還被用于治療蛇咬傷。毒理學的相關研究亞急性毒性實驗結果表明目前沒有憂遁草甲醇提取物并對大鼠造成死亡及任何不利影響[22-24]?？梢姡瑧n遁草用作藥物治療疾病是無毒副作用或毒副作用較小。王瑤等[25]的研究結果表明憂遁草對小鼠急性肝損傷具有一定的保護作用。

近年來，國內外學者研究發(fā)現(xiàn)憂遁草中不少成分具有抗氧化和清除自由基的功能并進行了一系列的實驗。Pannangpetch P等[26]研究憂遁草的乙醇提取物抗氧化活性以及其對大鼠紅細胞氧化性溶血的保護作用，結果表明憂遁草提取物在清除DPPH自由基具有良好的效果，同時還發(fā)現(xiàn)憂遁草提取物具有抗溶血的作用。Yong YK[27]等對DPPH自由基、NO自由基清除力，以及過氧化氫自由基的清除各個方面的抗氧化差異研究對比了憂遁草提取物的抗氧化能力強弱。Shiuan J等[28]研究結果表明憂遁草清除SOD活性較差，Ghasemzadeh A等[29]研究發(fā)現(xiàn)特定生長期憂遁草抗氧化活性明顯高于其他生長期。

本文通過不同抗氧化實驗方法評估產自揭陽和海南的憂遁草甲醇提取物的還原力，清除羥自由基的能力，以及清除二苯代苦味?；杂苫―PPH）能力和ABTS法來評價二者的體外抗氧化活性差異，并采用標準品水溶性維生素E（torlox）作為對照，揭示了憂遁草提取物的抗氧化活性，為憂遁草進一步開發(fā)利用提供了參考資料。

1 試驗材料

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要試劑 詳見表1。

1.1.2 主要儀器 詳見表2。

2 實驗內容與方法

2.1 憂遁草粗提物的提取 將憂遁草鮮葉置于80℃的烘箱中烘干8h，待其質量不再變化時，用中藥粉碎機將其粉碎，用甲醇以1∶15的比例在55℃下萃取3h，共萃取3次，將萃取液置于55℃的旋轉蒸發(fā)儀中蒸發(fā)，直至得到質量不再變化的浸膏。將浸膏移至50mL離心管中，用錫箔紙避光，4℃保存，備用。

2.2 還原力的測定 抗氧化物質能將Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+與鐵氰化鉀反應生成可溶性藍色配合物K4Fe[Fe（CN）6]，該配合物的最大吸收波長在于700nm處。如果該物質的還原力越強，生成的K4Fe[Fe（CN）6]越多，其吸光度將越大。本實驗中采用磷酸緩沖液（0.2mol/L pH6.6）和K3Fe[Fe（CN）6]（1%）各250μL，加入待測液200μL搖勻后，于50℃恒溫水浴鍋中反應30min，其后加入三氯乙酸（10%）250μL，4000r/min離心10min后，取上清液250μL，與蒸餾水250μL和Fecl3（0.1%w/v）50ul混合后，以磷酸緩沖液做參比，于700nm處測量吸光值。吸光值越大，則代表該物質的還原力越大[30]。

2.3 清除ABTS自由基能力的測定 準確稱量19.2mgABTS和6.7mg的K2SO8分別溶于5mL的超純水中配置成7.4mmol/L的ABTS的儲備液以及2.6mmol/LK2SO8儲備液的，完全溶解后，用錫箔紙避光反應12h，其后用無水乙醇將其吸光值調至0.7±0.02備用[31]。于96孔板中加入190μL的ABTS，其后往孔中添加10μL不同濃度的樣品液，靜置6min后，在734nm下測量其吸光值。

清除率（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100

式中：A0—空白對照的吸光度，AX—加入提取物吸光度，AX0—不加ABTS的本底吸光度。

2.4 清除DPPH自由基能力的測定 1，1-二苯基-2-苦基肼基自由基分子在519nm有最大的吸光值，當DPPH自由基被清除，其最大吸收波長吸光度A值會與之減小。DPPH方法由于其溶液配置和使用方法均較為簡單，因而被廣泛的應用于各類抗氧化實驗中。準確稱量DPPH 8mg溶于50mL的乙醇中，配制濃度為0.4mmol/L的DPPH工作液體，在96孔板中加入90μLDPPH反應液，其次向孔板中加入不同濃度的樣品10μL，將其避光反應30min后，于519nm處測量其吸光值[32]。

清除率（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100

式中：A0—空白對照的吸光度，AX—加入提取物吸光度，AX0—不加DPPH的本底吸光度。

2.5 清除羥自由基能力的測定 本實驗采用Fenton反應產生羥自由基，選擇過氧化氫作為氧化劑，在Fe2+催化下產生OH·，反應機理為：Fe2+ + H2O2—Fe3+ + OH- +OH·。在96孔板中，依次加入9mmol/LFeSO4溶液，9mmol/L水楊酸-乙醇溶液，不同濃度提取液和8.8mmol/L的H2O2各50μL。將其用錫箔紙避光置于37℃水浴鍋中反應30min，使用蒸餾水做空白對照，于510nm處測定吸光值[33]。

清除率由以下公式計算得出：

清除率（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100

式中：A0—對照組的吸光度；AX—加入憂遁草提取物吸光度；AX0—不加H2O2的本底吸光度。

2.6 數(shù)據(jù)分析 本實驗的數(shù)據(jù)均使用Excel和SPSS處理分析。

3 結果與分析

3.1 憂遁草提取物提取效率 本實驗中憂遁草的采用的萃取溶劑為甲醇，經過測量可得，海南憂遁草的提取率為6.42%，揭陽憂遁草的提取率為7.73%。Yong YK等研究表明，在不同的烘干溫度下，烘干溫度高的提取率大于低溫，不同溫度下黃酮的提取率為80℃>60℃>50℃>40℃，在不同的萃取溶劑中，僅有冷水的萃取效率大于甲醇[34]。故本實驗選取的烘干溫度，以及萃取溶劑較為合理，達到較為理想的提取效果。

3.2 憂遁草提取物的還原力 還原力的大小代表一個抗氧化劑的電子供應能力的強弱。還原力較強的抗氧化劑不僅可以供應電子使Fe3+還原為Fe2+，同時也可以參與自由基的反應。樣品在700nm處的吸光值的大小則代表了該物質還原力的強弱。本實驗以torlox為標品，對比比較不同產地憂遁草提取物的還原能力的大小。實驗結果表明，產自海南的憂遁草的還原力略低于產自揭陽憂遁草還原力，如圖1、2可知，提取物的還原吸光值力隨濃度升高而慢慢提高，呈現(xiàn)了較好的量效關系，在樣品濃度為1mg/mL的時，兩者吸光值并未達到1，在濃度為2mg/mL時，產自海南的憂遁草提取物還原力為0.87，產自海南的憂遁草還原力為1.069，標準品torlox在濃度為0.25mg/mL時，其吸光值超過1。實驗結果說明憂遁草具有一定的還原力，但相比于標準品，其還原能力較弱。

3.3 憂遁草提取物清除ABTS自由基能力 ABTS法是一種常見的檢測物質抗氧化的方法，以其檢測方法簡單，檢測結果靈敏而被大量應用于抗氧化能力測試實驗中，本實驗結果如圖3所示：海南憂遁草提取物達到50%清除率的濃度為0.485mg/mL，略高于產自揭陽的憂遁草提取物0.262mg/mL，而對照組中的torlox則在0.107mg/mL時對ABTS自由基的清除率即可達到50%。2種憂遁草提取物的對ABTS自由基的最高清除率均小于torlox，torlox的最大清除率可以達到95%，而2種憂遁草的最大清除率90%，比標準品略低5個百分點，實驗結果證明兩地的憂遁草提取物對ABTS自由基的清除效果較好。

3.4 憂遁草提取物清除DPPH自由基能力 由圖4可知，產地不不同的憂遁草對DPPH自由基的清除能力有一定的差異，產自海南的憂遁草提取物的清除能力稍弱與產自揭陽的憂遁草提取物，且兩種提取物的對DPPH自由基的清除能力均小于torlox，經過SPSS計算得知，產自海南的憂遁草提取物的IC50為0.893mg/mL，而產自揭陽的憂遁草IC50為0.685mg/mL，此時對照組torlox的IC50為0.278mg/mL。各個樣品與清除率間體現(xiàn)了較好的量效關系，即隨著提取物的濃度增強，其清除率也不斷的增強，在提取物濃度為2mg/mL時，兩種提取物的清除率均達到最大，最大清除率約為86%。

3.5 憂遁草提取物清除羥自由基能力 本方法采用Feton反應產生羥自由基，然后在體系中加入水楊酸以捕捉羥自由基使其反應產生有色物質，其后加入憂遁草提取物和torlox，與水楊酸競爭，使有色產物生成量減少，根據(jù)顏色的不同，即可在酶標儀下檢測出其吸光值的變化，進而評價該提取物的抗氧化能力。實驗結果顯示，torlox和提取物均有清除羥自由基的能力，結果如圖5所示，加入憂遁草提取液溶液后，能夠有效地清除羥自由基，加入的提取物物濃度不同，清除羥自由基的能力不同；實驗結果表明，揭陽憂遁草提取物的IC50為0.801mg/mL低于而海南憂遁草提取物的0.932mg/mL，證明了前者對自由基的清除能力大于后者，同時，torlox的IC50為0.362mg/mL。從圖中的曲線可以看出，不同濃度的憂遁草均具有一定的清除自由基的能力。且清除能力與樣品的濃度呈量效關系，憂遁草提取物在2mg/mL時的最大清除率僅為70%，而torlox在1mg/mL的清除率為89%。

4 討論與結論

4.1 討論 由于不同的抗氧化方法之間的原理存在一定的差異性，因此，物質的抗氧化能力不僅會受不同的反應原理的影響，也會因為同一種方法采用的不同濃度以及配比方式的不同而導致實驗結果的差異，在不同的抗氧化結果中，許多研究者采用了不同標準品對照，也使得抗氧化的實驗結果之間難以比較[34]。采用不同的方法評估同一種物質的抗氧性是非常必要的，因為單一的抗氧化檢測方法難以體現(xiàn)某種抗氧化物質的抗氧化活性[35]。在本實驗中，實驗者采取了多種實驗方法評估不同產地憂遁草的抗氧化活性，并采用torlox作為參照，對比評估不同產地憂遁草的抗氧化活性。本實驗中，為了準確的評估和對比來自不同產地的憂遁草提取物的抗氧化能力，采用4個方法評估其抗氧化能力，實驗結果表明，2種憂遁草的提取物均有較好的抗氧性，產自揭陽的憂遁草提取物較之于產自海南的憂遁草提取物總體上顯示出了更好的抗氧化結果，在4個評價方法中，2種提取物對ABTS與DPPH自由基的清除能力更強，而在羥自由基與還原力的方法測評上表現(xiàn)稍差，實驗結果較為全面地體現(xiàn)了憂遁草的抗氧化能力，表明憂遁草具有較好的抗氧化能力。

4.2 結論 還原力的測定結果顯示產自海南的憂遁草的還原力略低于產自揭陽憂遁草還原力。在濃度為2mg/mL時，產自海南的憂遁草提取物700nm處吸光度為0.87，產自揭陽的憂遁草的吸光度為1.069。ABTS自由基清除能力的測定中，海南憂遁草的IC50為0.494mg/mL，揭陽憂遁草IC50為0.262mg/mL，實驗結果表明，2種憂遁草對ABTS自由基清除效果好，該方法測試靈敏度較高。在DPPH自由基清除能力的測定結果顯示，產自海南的憂遁草提取物IC50分別為0.895mg/mL，產自揭陽憂遁草提取物IC50為0.685mg/mL，該結果能夠較好的評價其抗氧化性。本實驗中還采用了羥自由基的清除能力對憂遁草的抗氧化性進行評價，通過將2種不同產地的憂遁草提取物和torlox的清除率對比發(fā)現(xiàn)，該方法檢測靈敏度效果不明顯，海南憂遁草的IC50為0.932mg/mL，揭陽憂遁草IC50為0.801mg/mL，標準品torlox IC50為0.362mg/mL。

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（責編：張宏民）