劉鑫雅，李丹陽，趙利梅，盧士宇，盧文成，梁昌友，倪俊卿，馬亞賓2,

（1.河北品元畜禽育種有限公司，石家莊 050000；2.河北省種畜禽質(zhì)量監(jiān)測站DHI（奶牛生產(chǎn)性能測定）中心，石家莊 050061；3.河北省畜牧良種工作站，石家莊 050061；4.遵化市農(nóng)業(yè)畜牧水產(chǎn)局，遵化 064200；5.唐山市豐南區(qū)錢營鎮(zhèn)人民政府，豐南 053301）

河北省規(guī)模奶牛場夏季乳房炎致病菌感染情況分析

劉鑫雅1,2，李丹陽1,2，趙利梅1,2，盧士宇1,2，盧文成4，梁昌友5，倪俊卿3，馬亞賓2,3

（1.河北品元畜禽育種有限公司，石家莊 050000；2.河北省種畜禽質(zhì)量監(jiān)測站DHI（奶牛生產(chǎn)性能測定）中心，石家莊 050061；3.河北省畜牧良種工作站，石家莊 050061；4.遵化市農(nóng)業(yè)畜牧水產(chǎn)局，遵化 064200；5.唐山市豐南區(qū)錢營鎮(zhèn)人民政府，豐南 053301）

本試驗(yàn)在河北省345個(gè)參加DHI的奶牛場中，隨機(jī)抽取27個(gè)奶牛場，選擇患有乳房炎且臨床癥狀明顯的50頭泌乳牛，利用自動(dòng)實(shí)時(shí)PCR分析系統(tǒng)將純化的細(xì)菌DNA擴(kuò)增至檢測水平，使用熒光定量儀對(duì)16種引起乳房炎的主要病原菌進(jìn)行鑒定和定量。結(jié)果顯示，在6月份和8月份的兩次監(jiān)測中，引起奶牛臨床乳房炎的16 種主要致病菌全部被檢出，其中檢出率最高的是葡萄球菌屬，檢出率達(dá)42.42%、100% ；其次為含β-內(nèi)酰胺酶基因的葡萄球菌和酵母菌，檢出率分別為41.03%、92.85%和33.33%、64.28%；牛棒狀桿菌和黏質(zhì)沙雷菌，6月份未檢出，8月份檢出率較低。結(jié)果表明，試驗(yàn)?zāi)膛龅南募灸膛ＥR床乳腺炎是由兩種或幾種致病菌混合感染引起的，其中葡萄球菌屬和β-內(nèi)酰胺酶基因的葡萄球菌檢出率最高。

奶牛；乳腺炎；致病菌；分析

奶牛乳房炎是由物理、化學(xué)或微生物等因素刺激奶牛乳腺所發(fā)生的一種炎癥反應(yīng)[1]，其中多種病原微生物的感染是主因，是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)最嚴(yán)重的一種疾病。國外報(bào)道奶牛乳房炎的發(fā)病率為25%～60%，數(shù)據(jù)顯示，我國奶牛乳房炎的發(fā)病率為20%～75%，其中臨床乳房炎發(fā)病率為9.7%～55.6%，隱性乳房炎的發(fā)病率高達(dá)61.03%～79.62%[2]。奶牛乳房炎不僅導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量和奶品質(zhì)降低、淘汰率增加[3,4]，而且病原性乳房炎患牛的奶還含有大量的毒素、病原微生物及藥物殘留，食用后會(huì)引起嘔吐、腹瀉、發(fā)熱、過敏等反應(yīng)，影響人類健康[3～5]。

為更好地防控奶牛乳房炎，避免不合理用藥造成的損失，本試驗(yàn)通過自動(dòng)實(shí)時(shí)PCR分析系統(tǒng)將純化的細(xì)菌DNA擴(kuò)增至檢測水平，應(yīng)用熒光定量儀對(duì)16種主要乳房炎致病菌進(jìn)行了鑒定和定量監(jiān)控分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

以在河北省DHI中心實(shí)驗(yàn)室連續(xù)參加測定的345個(gè)規(guī)模化牧場為對(duì)象，隨機(jī)選擇27個(gè)牧場為試驗(yàn)牛場，選擇6月份和8月份參測且具有臨床乳房炎特征的泌乳牛50頭為試驗(yàn)動(dòng)物，其中6月份選擇牧場：邯鄲1個(gè)、石家莊12個(gè)；8月份選擇牧場：邢臺(tái)2個(gè)、廊坊3個(gè)、保定5個(gè)、石家莊2個(gè)、張家口1個(gè)、滄州1個(gè)；共計(jì)采集牛奶樣品150份。

1.2 器材與試劑

器材：取樣器，由北京鑫塔興農(nóng)科技有限公司生產(chǎn)；金屬孵育器、離心機(jī)、移液槍、振蕩器均由賽默飛世爾生物化學(xué)制品（中國）有限公司生產(chǎn)；短時(shí)離心機(jī)，由威泰克（Wealtec）有限公司生產(chǎn)；QIAamp提取柱、離心管（15mL、1.5mL）、96孔PCR反應(yīng)板、8聯(lián)管光學(xué)平蓋均由北京牧欣科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；Thermo Scientific 奶牛乳腺炎病原菌PCR 分析系統(tǒng)由賽默飛世爾生物化學(xué)制品（中國）有限公司生產(chǎn)。

試劑：小抽試劑盒、PCR試劑盒均由北京牧欣科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；乙醇（100%）由天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 樣品采集

采集奶樣35～40mL（取樣瓶中不含防腐劑），每個(gè)樣品采集3份，4℃保存，48h內(nèi)送至DHI實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 DNA 提取

按小抽試劑盒操作說明進(jìn)行DNA提取。

1.3.3 PCR 反應(yīng)體系配制

取4支1.5mL離心管，分別標(biāo)記R1、R2、R3、R4，用于配制4個(gè)不同PCR反應(yīng)體系；在4支離心管中各加入350μL PCR 預(yù)混液；對(duì)應(yīng)4支離心管上的編號(hào)，依次分別加入各反應(yīng)的引物混合液（PathoProof Primer Mix 1～4）180μL/支；將R1～R4管渦旋振蕩混勻，離心10s；取一塊96孔PCR反應(yīng)板，配制PCR反應(yīng)體系，陽性組的后4個(gè)孔做陰性對(duì)照；在對(duì)應(yīng)的每個(gè)反應(yīng)孔中加入5μL已提取好的DNA，陰性對(duì)照加入5μL滅菌水。

1.3.4 熒光定量 PCR

取8聯(lián)管光學(xué)平蓋，將所有盛有試劑的反應(yīng)管封閉；將96孔板置于板式離心機(jī)，3 000r/min，離心3min；將離心后的96孔板置熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測反應(yīng)。

1.3.5 病原菌監(jiān)測種類

金黃色葡萄球菌、葡萄球菌屬（包括所有主要的凝固酶陰性葡萄球菌）、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、大腸桿菌、腸球菌屬（包括糞腸球菌和屎腸球菌）、克雷伯菌屬（包括產(chǎn)酸克雷伯菌和肺炎克雷伯菌）、黏質(zhì)沙雷菌、牛棒狀桿菌、化膿隱秘桿菌和吲哚嗜胨菌（消化鏈球菌屬）、含β- 內(nèi)酰胺酶基因的葡萄球菌、牛支原體、支原體屬、酵母菌、原壁菌屬，共計(jì)16種。

1.3.6 結(jié)果判定

判定標(biāo)準(zhǔn)：按多種病原菌在混合生長情況下存在比例進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

圖1 2016年6月份、8月份乳房炎病原菌監(jiān)測情況

由表1和圖1可以看出，2016年6月份、8月份16種奶牛乳房炎致病菌監(jiān)測情況顯示，葡萄球菌屬（包括血漿凝固酶陰性葡萄球菌）的檢出率最高，6月份的檢出率為42.42%，8月份的檢出率為100%；其次是含β-內(nèi)酰胺酶基因的葡萄球菌，檢出率分別為92.85%、41.03%；酵母菌6月份檢出率為33.33%，8月份檢出率為64.28%；大腸桿菌8月份的檢出率比6月份高，達(dá)到64.28%。

3 討論

表1 2016年6月份、8月份乳房炎病原菌監(jiān)測情況

奶牛乳房炎病原菌感染因素主要包括以下幾點(diǎn)[6～8]：不同乳區(qū)，年齡和胎次，產(chǎn)奶量和泌乳時(shí)間，季節(jié)和壞境因素，擠奶技術(shù)，飼養(yǎng)管理和遺傳因素等。引起奶牛乳房炎的病原微生物達(dá)130多種，其中最常見的有20多種，包括細(xì)菌、霉菌、病毒和支原體等。根據(jù)來源和傳播方式不同，通常分為傳染性微生物和環(huán)境性微生物[9]。本試驗(yàn)監(jiān)測的16種乳房炎致病菌中，葡萄球菌屬、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和支原體屬屬于傳染性微生物，其危害比較大，感染后即使本身不發(fā)病，也會(huì)形成傳染源[10]。這類微生物根植于乳腺，可通過擠奶工的手、清潔布、擠奶器械等傳播。牛乳房鏈球菌、大腸桿菌和克雷伯氏菌屬于環(huán)境性微生物，這類微生物廣泛存在于奶牛體表皮膚及其周圍環(huán)境中，在擠奶、擠奶間歇期和干奶期時(shí)，乳腺均可感染。

從本次監(jiān)測結(jié)果可以看出，河北省7個(gè)市27個(gè)奶牛場的150份乳房炎牛奶樣品中，傳染性微生物的檢出率最高，尤其是8月份的葡萄球菌屬檢出率高達(dá)100%；環(huán)境性微生物的檢出率較高，尤其是8月份的大腸桿菌檢出率達(dá)到64.28%。奶牛乳房炎致病菌檢出率較高的牧場，在牧場衛(wèi)生、擠奶操作、奶廳管理設(shè)備維護(hù)等方面存在較大問題。酵母菌檢出率也比較高，可能是由于河北地區(qū)在6～8月中下旬處于雨季，長期不能放牧而導(dǎo)致棚臺(tái)陰暗、潮濕，從而滋生酵母菌。

奶牛乳房炎通常是由兩種或多種致病菌感染引起的，其防控關(guān)鍵在于切斷傳染源，控制感染，針對(duì)致病菌選擇有效的治療方案。同時(shí)，查找擠奶過程控制環(huán)節(jié)的不足，及時(shí)改進(jìn)，規(guī)范奶牛場管理、操作程序，改善奶牛場衛(wèi)生環(huán)境，也是有效降低乳房炎發(fā)病幾率的重要措施。

[1] 肖定漢.奶牛病學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2002.

[2] 李宏勝,郁杰,李新圃,等.奶牛乳房炎類型與病原菌感染之間相關(guān)性的研究[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2004, 26(6):146-149.

[3] 袁永隆, 張禮華, 劉純傳,等.我國奶牛乳房炎常見病原菌的區(qū)系調(diào)查[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 1992, 25(4):70-76.

[4] 李宏勝,郁杰,李新圃,等.奶牛乳房炎類型與病原菌感染之間相關(guān)性的研究[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2004, 25(6):80-84.

[5] 史冬艷,郝永清,張愛榮,等.奶牛金黃色葡萄球菌性乳房炎研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2010,3(7):82-86.

[6] 馬啟才.奶牛隱性乳房炎的流行病學(xué)調(diào)查[J]. 畜牧與飼料科學(xué),2009,10:168-169.

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[8] 王玲,李宏盛,王正兵,等.規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖區(qū)奶牛乳房炎的調(diào)查及病因分析[J]. 中國乳業(yè),2010, 10:50-53.

[9] 余四九. 獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2013.

[10] 許丹寧,侯振中,樊衛(wèi)東. 奶牛隱性乳房炎的流行病學(xué)調(diào)查及病原菌的分離鑒定[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī), 2015,9:40-41.

Analysis of Infection Situation of Pathogenic Bacteria Causing Dairy Cow Mastitis in Dairy Farms in Hebei Province in Summer

LIU Xin-ya1,2, LI Dan-yang1,2, ZHAO Li-mei1,2, LU Shi-yu1,2, LU Wen-cheng4, LIANG Chang-you5,
NI Jun-qing3, MA Ya-bin2,3
(1.Hebei Pinyuan Livestock Varieties Breeding Co.,Ltd, Shijiazhuang 050000; 2.Hebei Provincial Station for Quality Control of Livestock Varieties, Shijiazhuang 050061; 3.Hebei Provincial Station for Livestock Varieties Producing and Spreading, Shijiazhuang 050061; 4.Agricultural Bureau of Livstock and Aquatic Products of Zunhua, Zunhua 064200; 5.The People’s Government of Qianying Town in Fengnan of Tangshan City, Fengnan 053301)

A total of 27 dairy farms were randomly selected from 345 dairy farms which participated in DHI test in Hebei province. Then 50 cows with mastitis and signifcant clinical performance were selected, and the purifed bacterial DNA was amplified to the detection level for 16 pathogenic bacteria identification and quantification using real time PCR. Two monitoring results in June and August showed that, 16 major pathogens that caused cow mastitis were all positive, the highest detection rate was Staphylococcus, and the detection rate was 42.42%, 100%,respectively; followed by β-lactamase gene Staphylococci and yeast, the detection rate of which was 41.03%,92.85%, 33.33%, and 64.28%; both Corynebacterium and Serratia marcescens were negative in June and positive in August, but the detection rate was low. Clinical cow mastitis in summer is caused by mixed infection of two or more pathogens, Staphylococcus and β-lactamase gene Staphylococcus aureus showed the highest detection rate.

Dairy cows; Mastitis; Pathogens; Analysis

S858.23

A

1004-4264（2017）07-0043-03

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.07.011

2017-01-26

農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)技術(shù)試驗(yàn)與示范——河北省奶牛生產(chǎn)性能測定補(bǔ)貼項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：HBCT2013080206；HBCT2013080301）；奶牛精細(xì)化管理關(guān)鍵技術(shù)試驗(yàn)與示范項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：冀農(nóng)科15020）。

劉鑫雅（1992-），女，本科，現(xiàn)從事奶牛生產(chǎn)性能測定技術(shù)推廣工作。

倪俊卿（1963-），女，研究員。