陳玉文 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司福州350014

不同接毒方法對豬圓環(huán)病毒2型增殖的影響

陳玉文 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司福州350014

本試驗(yàn)對比了不同的接毒方法，觀察豬圓環(huán)病毒2型的繁殖情況。試驗(yàn)分為同步接毒（A組、B組）和異步接毒（C組、D組）：同步接毒A組為在消化分裝好的細(xì)胞懸液中同步接入5%（V/V）的PCV2種毒，B組為在消化分裝好的細(xì)胞懸液中同步接入3%（V/V）的PCV2種毒，24 h后再接種2%種毒；異步接毒C組為在生長良好、培養(yǎng)24 h的單層細(xì)胞中接種5%（V/V）的PCV2種毒，D組為在生長良好、培養(yǎng)48 h的PK15單層細(xì)胞中接種5%（V/V）的PCV2種毒。四組均在接種后培養(yǎng)72 h收獲，進(jìn)行病毒含量檢測。試驗(yàn)結(jié)果顯示：A組的病毒含量為107.0～7.25TCID50/mL，B組病毒含量為106.75～7.0TCID50/mL，C組的病毒含量為106.4～6.5TCID50/mL，D組的病毒含量為106.25～6.5TCID50/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用同步接毒法的病毒含量明顯高于異步接毒法，在細(xì)胞懸液中同步一次性接入5%種毒，病毒的增殖量最高。

豬圓環(huán)病毒2型同步接毒異步接毒病毒含量

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV2）主要引起斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎-腎病綜合征（PDNS）、增生性壞死性肺炎（PNP）、豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）、繁殖障礙、腸炎、仔豬先天性震顫等，其中以PMWS最為嚴(yán)重。該病毒在各養(yǎng)豬國家廣泛流行，與PCV2感染相關(guān)的豬，其病死率10%～30%不等，較嚴(yán)重的豬場在暴發(fā)該病時(shí)死淘率高達(dá)40%，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，受到國內(nèi)外學(xué)者的高度重視，對該病的研究特別是對其疫苗的研究正日益受到關(guān)注。PCV2屬圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus），是一種小而無囊膜、二十面體、共價(jià)閉合、環(huán)狀的單股DNA病毒，病毒粒子直徑平均為17 nm，分子量為0.58× 106Da，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒[1]。PCV2適于在具有旺盛增殖能力并處于有絲分裂過程中的細(xì)胞上復(fù)制，其DNA的復(fù)制依賴細(xì)胞周期中S期表達(dá)的細(xì)胞蛋白[2]。PCV2在原代胎豬腎細(xì)胞、恒河猴腎細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞以及一些豬傳代細(xì)胞系（PT、PET）上不能生長。PCV2可在PK15細(xì)胞上良好生長，把PCV2接種到無PCV污染的單層PK15細(xì)胞上能夠獲得較好的病毒復(fù)制增殖，但不產(chǎn)生細(xì)胞病變。本研究通過不同接毒方法對豬圓環(huán)病毒2型在PK-15細(xì)胞上的增殖試驗(yàn)，進(jìn)而為生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗過程中提高病毒培養(yǎng)滴度提供參考。

1 材料與試劑

1.1 細(xì)胞、毒株P(guān)K15細(xì)胞和PCV2（DBN-SX07株）由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司保存、提供。種毒的毒價(jià)為106.5TCID50/mL。

1.2 主要試劑MEM培養(yǎng)基和新生牛血清購自GIBCO公司；D-氨基葡萄糖購自SIGMA公司。

2 方法與步驟

2.1 細(xì)胞準(zhǔn)備選擇1瓶細(xì)胞狀態(tài)良好、培養(yǎng)72 h的健康PK15細(xì)胞，用0.25%胰酶進(jìn)行消化，消化后按一定的比例進(jìn)行分裝，分裝至T75方瓶中，共分裝8瓶等量的細(xì)胞，隨機(jī)選取其中4瓶置CO2培養(yǎng)箱中37℃繼續(xù)培養(yǎng)，用于異步接毒，另4瓶用于同步接毒。

2.2 試驗(yàn)分組

2.2.1 同步接毒A組取消化分裝好的PK15細(xì)胞懸液2瓶，按5%（V/V）的接種量接種PCV2（DBN-SX07株）種毒，置37℃下培養(yǎng)24 h后，棄去生長液，加入含2%新生牛血清和3 mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM細(xì)胞維持液，置37℃下繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收獲。

2.2.2 同步接毒B組取消化分裝好的PK15細(xì)胞懸液2瓶，按3%（V/V）的接種量接種PCV2（DBNSX07株）種毒，置37℃下培養(yǎng)24 h后，棄去生長液，加入含2%新生牛血清和3 mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM細(xì)胞維持液，同時(shí)按2%（V/V）的接種量接種PCV2（DBN-SX07株）種毒，置37℃下繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收獲。

2.2.3 異步接毒C組選取生長良好培養(yǎng)24 h的PK15單層細(xì)胞2瓶，棄去生長液，加入含2%新生牛血清和3 mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM細(xì)胞維持液，同時(shí)按5%（V/V）的接種量接種PCV2（DBN-SX07株）種毒，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收獲。

2.2.4 異步接毒D組選取生長良好培養(yǎng)48 h的PK15細(xì)胞2瓶，棄去生長液，加入含2%新生牛血清和3 mmol/L的D-氨基葡萄糖鹽酸的MEM細(xì)胞維持液，同時(shí)按5%（V/V）的接種量接種PCV2（DBN-SX07株）種毒，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收獲。

2.3 病毒液的處理將A、B、C、D組收獲的病毒液交替放置于-15℃和室溫下，反復(fù)凍融3次，凍結(jié)保存、備用。

2.4 病毒含量檢測使用消化后分散均勻的PK15細(xì)胞液適當(dāng)比例稀釋后，將每組病毒液作10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋度接種于96孔培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度6孔，100 μL/孔，同時(shí)設(shè)立陰性對照。置37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。采用IFA法統(tǒng)計(jì)病毒感染孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒TCID50/mL。

3 結(jié)果

按照上述試驗(yàn)方法與步驟進(jìn)行接毒培養(yǎng)試驗(yàn)并重復(fù)3次，收獲病毒液的病毒含量檢測結(jié)果見表1。試驗(yàn)結(jié)果表明，同步接毒A組和B組的病毒含量高于異步接毒C組和D組的病毒含量。同步接毒A組的病毒含量高于B組，異步接毒C組與D組的病毒含量沒有明顯差異。

4 討論

1）關(guān)于PCV2在體外細(xì)胞培養(yǎng)的有些研究表明，PCV2在體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，不會導(dǎo)致細(xì)胞病變，病毒在細(xì)胞的增殖能力較差，主要原因可能是PCV2病毒的復(fù)制過程要依賴細(xì)胞聚合酶，這種酶主要在細(xì)胞繁殖S周期中合成，縮短了病毒的增殖期[3]。PK15細(xì)胞為增殖旺盛的細(xì)胞，第2～4 d為明顯的指數(shù)生長期，生產(chǎn)曲線為較典型的“S”型，群體倍增時(shí)間為21.08 h[4]。本試驗(yàn)在PK15細(xì)胞上采用同步接毒法培養(yǎng)的PCV2病毒含量明顯高于異步接毒法，是否可以說明同步接毒使PCV2病毒在細(xì)胞增殖過程的S期（合成期）,充分利用了所需的細(xì)胞聚合酶，從而提高病毒的復(fù)制數(shù)量，有待進(jìn)一步探討。

表1 不同接毒方法收獲病毒液的病毒含量

2）在本試驗(yàn)過程中采用了D-氨基葡萄糖處理細(xì)胞，用此方法的目的是增強(qiáng)病毒的增殖能力。早期國外Tischer等[5]在對PCV1細(xì)胞培養(yǎng)特征研究中發(fā)現(xiàn)，D-氨基葡萄糖處理可顯著增強(qiáng)病毒的增殖能力，這種生化試劑可能提高細(xì)胞S期合成的聚合酶量或延長聚合酶合成時(shí)間，但其作用機(jī)制尚未闡明。

3）從本試驗(yàn)的結(jié)果看，PCV2病毒在PK15細(xì)胞上的增殖能力與接毒的方法有很大關(guān)系。同步接毒法的病毒含量明顯高于異步接毒法，并且采用在細(xì)胞懸液中同步一次性接入種毒的方法，病毒的增殖量最高。

[1]王一平,郭龍軍,唐青海,等.豬圓環(huán)病毒2型疫苗的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,43(9):1337-1345.

[2]李紅園,魏麗娟,魏占勇,等.豬圓環(huán)病毒2型研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2014(11):56-60.

[3]劉長明,張超范,危艷武,等.豬圓環(huán)病毒2型細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)毒株的培育和鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,28(3):248-252.

[4]魏園園,馬忠仁,王家敏,等.PK15細(xì)胞的生物學(xué)特性和質(zhì)量評價(jià)研究[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(5):61-65.

[5]Tischer I,Peters D,Rasch R,et al.Replication of porcine circovirus:Induction by glucosamine and cell cycle dependence[J].Arch Virol,1987,96:39-57.

Study on replication effect of porcine circovirus 2 by difference inoculation

Chen Yuwen
(Fuzhou Dabeinong Biotechnology Co.Ltd.,Fuzhou 350014)

The experiment containing synchronous inoculation(A group,B group)and asynchronous inoculation(C group,D group)was designed.A group was that PCV2 of 5%volume concentration was inoculated instantly after digesting PK-15 cells.B group is that firstly,PCV2 of 3%volume concentration was inoculated instantly after digesting cells and then 2%PCV2 was inoculated after 24 h culturing cells.Respectively,C group and D group represented that 5%PCV2 was inoculated after 24 h culturing cells and after 48 h culturing cells.Cells of all groups were harvested after 72 h and then PCV2 levels were detected by immunofluorescence method.The results showed that from A group to D group,PCV2 content was 107.0～7.25TCID50/mL,106.75～7.0TCID50/mL,106.4～6.5TCID50/mL and 106.25～6.5TCID50/mL,respectively.Overall,PCV2 levels of synchronous inoculation were better than asynchronous inoculation and effect of inoculating 5%PCV2 once instantly after digesting PK-15 cells was the best.

Porcine circovirus 2 Synchronous inoculation Asynchronous inoculation Virus content

A

1003-4331（2017）04-0021-02