李亞麗，孫艷美，張寧，王方娜，高健

(河北省人民醫(yī)院，石家莊050071)

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1例疑診Leigh綜合征患兒及其父母線(xiàn)粒體相關(guān)基因突變觀察

李亞麗，孫艷美，張寧，王方娜，高健

(河北省人民醫(yī)院，石家莊050071)

目的 觀察并分析1例疑診Leigh綜合征患兒及其父母的線(xiàn)粒體相關(guān)基因突變情況。方法 發(fā)育落后合并肌張力異常、疑診Leigh綜合征的患兒1例，3歲，患兒就診時(shí)其母孕14周。采集患兒及其父母的外周血2 mL，提取血液基因組DNA，采用高通量測(cè)序分析檢測(cè)患兒線(xiàn)粒體病相關(guān)基因，并觀察其父母基因突變情況。根據(jù)檢測(cè)出的患兒線(xiàn)粒體相關(guān)基因突變位點(diǎn)，在患兒母親孕18周時(shí)抽取羊水，采用PCR法檢測(cè)胎兒是否存在相同突變位點(diǎn)，分析胎兒患病的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果 測(cè)得患兒過(guò)量位點(diǎn)蛋白1(SURF1)基因有兩個(gè)突變位點(diǎn)c.655G>T(p.E219X)和c.324-1G>C，c.655G>T來(lái)源于母親、c.324-1G>C來(lái)源于父親，為復(fù)合雜合突變，確診患兒為疑診Leigh綜合征?；純耗赣H羊水PCR檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)胎兒為c.324-1G>C突變，無(wú)c.655G>T突變，為雜合突變攜帶者，胎兒出生后隨訪(fǎng)至1歲，孩子身體健康，能平穩(wěn)獨(dú)自行走。結(jié)論 發(fā)現(xiàn)Leigh綜合征患兒SURF1基因的兩個(gè)突變位點(diǎn)c.655G>T(p.E219X)、c.324-1G>C，是患兒發(fā)育落后、肌張力異常的致病基因；患兒父母均為雜合基因突變攜帶者，遺傳方式是常染色體隱性遺傳，母親每次受孕其胎兒患病概率為25%。

線(xiàn)粒體肌病；Leigh綜合征；過(guò)量位點(diǎn)蛋白1基因；基因突變；常染色體隱性遺傳

線(xiàn)粒體是真核細(xì)胞中的一種細(xì)胞器，它是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要場(chǎng)所，為細(xì)胞95%的活動(dòng)提供所需能量，并且它還參與細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過(guò)程，有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的能力。線(xiàn)粒體有自身的遺傳物質(zhì)和遺傳體系，線(xiàn)粒體基因約編碼人類(lèi)2%的蛋白質(zhì)[1]。線(xiàn)粒體肌病是由于線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能異常造成細(xì)胞呼吸鏈及能量代謝障礙的臨床綜合征，當(dāng)其伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀時(shí)稱(chēng)為線(xiàn)粒體腦肌病。線(xiàn)粒體肌病較常見(jiàn)的一種臨床類(lèi)型是Leigh綜合征(LS)，多發(fā)生于嬰幼兒或兒童期，起病較隱匿，呈慢性進(jìn)行性的肌張力倒退、伴隨運(yùn)動(dòng)和智力發(fā)育遲緩，部分患者可出現(xiàn)呼吸衰竭、運(yùn)動(dòng)障礙而危及生命。早期診斷和治療LS非常重要。該病臨床表現(xiàn)多樣，單純依靠臨床表現(xiàn)和一般實(shí)驗(yàn)室檢查很難準(zhǔn)確診斷，目前診斷該病的金標(biāo)準(zhǔn)是基因診斷[2～4]。本研究回顧分析了對(duì)1例臨床疑似LS患兒的分子遺傳學(xué)研究過(guò)程，發(fā)現(xiàn)了過(guò)量位點(diǎn)蛋白1(SURF1)基因的兩個(gè)新的突變位點(diǎn)，明確了診斷和病因，并對(duì)其母孕期進(jìn)行了產(chǎn)前診斷，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 疑似LS患兒1例，女，3歲，發(fā)育落后。生后9個(gè)月始能獨(dú)坐，1歲3個(gè)月可以扶走，扶走時(shí)雙下肢抬起困難，至今不能獨(dú)自站立和行走；僅能簡(jiǎn)單發(fā)音“爸爸、媽媽”；1歲3個(gè)月運(yùn)動(dòng)倒退，四肢無(wú)力，嘔吐、喂養(yǎng)困難，易哭鬧、睡眠差，血乳酸3.0 mm/L；頭MRI檢查示雙側(cè)基底節(jié)區(qū)及腦干異常信號(hào)，部分病變彌散受限。根據(jù)患兒臨床癥狀和檢驗(yàn)結(jié)果疑診LS?；純焊改竿g(25歲)，身體均健康，否認(rèn)家族中有遺傳病史?；純耗赣H25歲，23歲足月順產(chǎn)此患兒，為第1次孕產(chǎn)，患兒生后Apgar評(píng)分正常?；純耗赣H現(xiàn)孕14周，為避免再次生育此類(lèi)患兒，要求行產(chǎn)前診斷。

1.2 線(xiàn)粒體相關(guān)基因突變觀察 采集患兒及其父母的外周血2 mL(EDTA抗凝)，按照血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA(天根試劑盒)。以電泳和NanoDrop超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度。提取1 500 ng的基因組DNA，超聲打斷成平均300 bp的長(zhǎng)度，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建；連接8 bp的index標(biāo)簽和接頭到打斷的DNA上；連接好接頭的片段化DNA與內(nèi)分泌疾病捕獲芯片進(jìn)行雜交捕獲；捕獲后的文庫(kù)質(zhì)量和濃度通過(guò)片段分析和定量PCR進(jìn)行評(píng)估。上illumina HiSeq X ten平臺(tái)測(cè)序，基因組中佝僂病相關(guān)基因的測(cè)序數(shù)據(jù)量在2 G左右，平均測(cè)序深度在100 X。測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)NextGENe軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾和比對(duì)分析。篩選的突變點(diǎn)在數(shù)據(jù)庫(kù)(dbSNP、ExAC和1000 genome projects)中比對(duì)來(lái)確定人群攜帶率，進(jìn)一步判斷其致病性；通過(guò)SIFT、Polyphen-2 and mutation taster等軟件進(jìn)行突變點(diǎn)保守性及致病性分析，預(yù)測(cè)其致病性。對(duì)疑似致病的突變位點(diǎn)，通過(guò)一代測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果借助Mutation Surveyor v4.0軟件與參考序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3 患兒母親羊水細(xì)胞中線(xiàn)粒體相關(guān)基因突變觀察 患兒母親于孕18周時(shí)抽取羊水，采用PCR法檢測(cè)胎兒是否存在相同突變位點(diǎn)，進(jìn)行產(chǎn)前診斷。于產(chǎn)后1年對(duì)胎兒出生后的情況進(jìn)行隨訪(fǎng)。

2 結(jié)果

測(cè)得患兒SURF1基因有兩個(gè)突變位點(diǎn)c.655G>T(p.E219X)和c.324-1G>C，c.655G>T來(lái)源于母親、c.324-1G>C來(lái)源于父親，為復(fù)合雜合突變(見(jiàn)圖1、2)，確診患兒為L(zhǎng)S?；純耗赣H羊水PCR檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)胎兒存在c.324-1G>C突變，未發(fā)現(xiàn)c.655G>T突變，為雜合突變攜帶者(見(jiàn)圖1、2)?；純耗赣H足月順產(chǎn)一男嬰，現(xiàn)已1歲，身體健康，能平穩(wěn)獨(dú)自行走。

注：1為患兒樣本；2為患兒父親樣本；3為患兒母親樣本；4為羊水細(xì)胞樣本；黑色箭頭示SURF1基因突變位點(diǎn)c.655G>T(p.E219X)；白色箭頭處SURF1基因不存在突變位點(diǎn)c.655G>T(p.E219X)。

圖1 SURF1基因突變位點(diǎn)c.655G>T(p.E219X)

3 討論

LS最早由英國(guó)學(xué)者[5]發(fā)現(xiàn)并描述其神經(jīng)病理學(xué)特征。LS是多種酶缺陷導(dǎo)致的線(xiàn)粒體呼吸鏈氧化磷酸化障礙，引起退行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，其特征是腦干、基底節(jié)和脊髓后柱區(qū)有對(duì)稱(chēng)性局灶壞死，故又稱(chēng)為亞急性壞死性腦脊髓病[6，7]。LS病因復(fù)雜，臨床發(fā)病率約1/40 000。LS按患者發(fā)病年齡可分為三種類(lèi)型，即新生兒型、經(jīng)典嬰兒型、青少年型。其中以嬰兒型最常見(jiàn)，臨床表現(xiàn)不一，包括運(yùn)動(dòng)和智力低下(包括舞蹈癥)、肌張力減退、痙攣、小腦共濟(jì)失調(diào)等，發(fā)病后2年內(nèi)病死率高[8～10]。LS患者血清或腦脊液中乳酸含量增高[11～12]。祝小芬等[13]研究認(rèn)為靜息時(shí)乳酸升高、運(yùn)動(dòng)后即刻超過(guò)正常值3倍可作為擬診LS的參考。LS頭部MRI檢查特征性表現(xiàn)是基底節(jié)尤其殼核區(qū)可見(jiàn)多灶性、雙側(cè)對(duì)稱(chēng)性的腦軟化灶。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)LS患者丘腦、基底節(jié)、腦室、大腦導(dǎo)水管周?chē)图顾韬笾鶇^(qū)有對(duì)稱(chēng)性局灶壞死，呈海綿狀囊樣空腔，并伴有脫髓鞘改變、血管增生和神經(jīng)膠質(zhì)增生[14]。LS具有復(fù)雜的臨床表現(xiàn)和基因調(diào)控機(jī)制，為嚴(yán)重的致死性遺傳病，且目前無(wú)有效治療措施，故產(chǎn)前診斷是一項(xiàng)重要預(yù)防措施。

注：1為患兒樣本；2為患兒父親樣本；3為患兒母親樣本；4為羊水細(xì)胞樣本；黑色箭頭示SURF1基因存在突變位點(diǎn)c.324-1G>C，c.655G>T；白色箭頭處SURF1基因不存在突變位點(diǎn)c.324-1G>C，c.655G>T。

圖2 SURF1基因突變位點(diǎn)c.324-1G>C，c.655G>T

LS主要有3種遺傳方式：線(xiàn)粒體遺傳(又稱(chēng)母系遺傳)，由線(xiàn)粒體基因突變引起；常染色體隱性遺傳；X-連鎖遺傳。后兩種遺傳方式是核基因突變所致，其中常染色體隱性遺傳最為常見(jiàn)，約占60%。目前發(fā)現(xiàn)約10種類(lèi)型核基因突變引起線(xiàn)粒體病，包括呼吸鏈復(fù)合物亞基及組裝因子突變，維持線(xiàn)粒體基因穩(wěn)定性的突變，線(xiàn)粒體蛋白組合裝置缺陷，線(xiàn)粒體脂質(zhì)環(huán)境缺陷，線(xiàn)粒體運(yùn)輸裝置缺陷，輔酶Q10缺乏，線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)學(xué)缺陷，凋亡缺陷，丙酮酸脫氫酶缺陷和線(xiàn)粒體鐵代謝障礙[3]。呼吸鏈復(fù)合物亞基及組裝因子突變基因達(dá)51個(gè)[15]。研究[16，17]發(fā)現(xiàn)常染色體隱性遺傳與4種呼吸鏈酶缺陷有關(guān)，即復(fù)合物Ⅰ(NADH還原酶)、復(fù)合物Ⅱ(琥珀酸脫氫酶)、復(fù)合物Ⅳ(COX)、復(fù)合物Ⅴ(ATP合成酶)。其中最為常見(jiàn)是復(fù)合物Ⅳ的缺陷。COX復(fù)合物由13個(gè)多肽亞單位組成，其中10個(gè)由核基因編碼(SURF1、SCO1、SCO2、COX10、COX15、COX20、LRPPRC、FASTKD2、TACO1、PET100等)，其余3個(gè)由線(xiàn)粒體基因編碼[18，19]。LS最常見(jiàn)的致病基因是SURF1，位于9q34.2，有9個(gè)外顯子，全長(zhǎng)4 695 bp。SURF1基因編碼的蛋白含有300個(gè)氨基酸殘基(AA)，有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(61～79AA、274～290AA)。SURF1蛋白在COX復(fù)合物的裝配前期中發(fā)揮十分重要的作用。迄今國(guó)外報(bào)道已發(fā)現(xiàn)40多例LS患者存在SURF1基因突變[20]；國(guó)內(nèi)共報(bào)道了6例，1例為622delA和653 -654delCT缺失，5例為外顯子7的604位G>C雜合錯(cuò)義突變。

本研究中患兒發(fā)育落后，不能獨(dú)走，扶走時(shí)雙下肢抬起困難，2歲后活動(dòng)能力有倒退；血乳酸3.0 mmol/L；頭部MRI檢查示雙側(cè)基底節(jié)區(qū)及腦干異常信號(hào)，部分病變彌散受限，符合LS的臨床特征，擬診斷為L(zhǎng)S。進(jìn)行二代測(cè)序篩查基因發(fā)現(xiàn)患兒SURF1基因有c.655G>T(p.E219X)及c.324-1G>C復(fù)合雜合突變，與PubMed文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)、美國(guó)生物技術(shù)信息中心(NCBI)所屬的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)、人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(HGMD)中已公布的SURF1基因突變位點(diǎn)相比，這兩個(gè)突變均未見(jiàn)報(bào)道。上述兩個(gè)突變中，前者為無(wú)義突變，后者為剪切突變，理論上均具有致病性。故我們認(rèn)為這兩種缺失突變?yōu)樾碌闹虏⊥蛔儭鬟f分析表明，患兒母親存在SURF1基因c.655G>T雜合突變，父親有SURF1基因c.324-1G>C雜合突變，明確了診斷和致病基因，不僅為患兒的治療提供了準(zhǔn)確依據(jù)，而且根據(jù)患兒致病SURF1基因及其父母基因比對(duì)，發(fā)現(xiàn)患兒父母親均為致病基因攜帶者，遺傳方式是常染色體隱性遺傳，故患兒父母再次生育時(shí)，其子女患病概率為25%，需進(jìn)行產(chǎn)前診斷。本例患兒母親在孕18周時(shí)進(jìn)行羊水細(xì)胞PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)胎兒有c.324-1G>C突變，沒(méi)有c.655G>T突變，為雜合突變攜帶者，理論上不具致病性，故保留此胎兒，產(chǎn)后隨訪(fǎng)至1歲，孩子未出現(xiàn)異常。

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