楊 鵬，關(guān) 萍，陳興銀，張凱凱，彭昌琴，成 宇，石建明

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

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基于GenBank數(shù)據(jù)探討兜蘭屬植物DNA條形碼

楊 鵬，關(guān) 萍，陳興銀，張凱凱，彭昌琴，成 宇，石建明*

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

為篩選出適合兜蘭屬植物的DNA條形碼序列。本研究基于GenBank中下載的29種兜蘭屬植物的253條序列，利用遺傳距離法及分子系統(tǒng)學(xué)方法分析兜蘭屬植物候選條形碼。結(jié)果表明，在選取的3個(gè)候選序列片段中對(duì)兜蘭屬植物鑒定的成功率最高的是核糖體ITS(nrITS)序列，分辨率為62.96%，其次是葉綠體matK序列，分辨率為50%，最后是葉綠體rbcL序列，分辨率僅為21.43%，因此，本研究推薦nrITS序列作為兜蘭屬植物的DNA條形碼候選序列，葉綠體matK序列作為補(bǔ)充序列。

兜蘭；DNA條形碼；nrITS序列

兜蘭是蘭科(Orchidaceae)兜蘭屬(PaphiopedilumP)植物的統(tǒng)稱，多生長(zhǎng)于熱帶及亞熱帶林下，是蘭科植物中最具特色的一個(gè)類群，也是最具特色魅力的觀賞性花卉植物[1，2]。全世界兜蘭屬植物有96～100個(gè)種，主要分布在印度東部至我國(guó)南部、東南亞、菲律賓及馬來(lái)西亞群島地區(qū)[3]，由于具有極高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，導(dǎo)致人們對(duì)兜蘭野生資源進(jìn)行了毀滅性的采挖，加之生境破壞等原因，野生兜蘭的數(shù)量急劇減少，分布區(qū)逐漸萎縮，使得兜蘭野生種均被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》[4]。近年來(lái)，人們?yōu)榱吮Ｗo(hù)兜蘭種植資源，兜蘭的雜交種也隨之增加，加之相互引種，導(dǎo)致人們對(duì)兜蘭屬植物鑒定增加了一大難度[5]。

DNA條形碼技術(shù)(DNA barcoding)是用DNA保守片段對(duì)物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確鑒定的一種新興技術(shù)[6]，該技術(shù)由加拿大圭爾夫大學(xué)(University of Guelph)教授Hebert等[7]于2003年首次提出后并受到廣泛的關(guān)注，現(xiàn)已成為生物分類和鑒定的研究熱點(diǎn)，在物種鑒定方面顯示了廣闊的應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)兜蘭屬植物DNA條形碼的研究尚處于探索階段，Parven等[8]通過(guò)對(duì)印度8種瀕危兜蘭植物的rpoB、rpoC1、rbcL、matK、和nrITS6個(gè)序列進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明matK基因?qū)τ《葹l危兜蘭植物的條形碼研究具有較高的分辨率；Guo等[9]對(duì)金星兜蘭(OrchidaceaeVenusSlipper)植物的DNA條形碼研究表明，matK+ atpF-atpH能較好的區(qū)分該植物；Min等[10]等通過(guò)對(duì)韓國(guó)89種蘭科植物的rbcL、matK、atpF-atpH IGS，psbK-psbI IGS和trnH-psbA 5個(gè)序列進(jìn)行研究，結(jié)果表明trnH-psbA IGS 基因?qū)n國(guó)蘭科植物的分辨率最高。本研究基于Genebank中的數(shù)據(jù)對(duì)兜蘭屬部分植物的nrITS序列、葉綠體matK序列及rbcL編碼基因進(jìn)行對(duì)比分析，旨在選出鑒別兜蘭屬植物的最適DNA條形碼候選片段，為解決兜蘭屬植物的分子鑒定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的27種兜蘭屬植物的117條核糖體ITS序列、22種兜蘭屬植物的78條葉綠體matK序列及14種兜蘭屬植物的58條葉綠體rbcL編碼序列，其物種名稱及GenBank登錄號(hào)見(jiàn)表1。

表1 不同物種及序列的GenBank登錄號(hào)

續(xù)表1

編號(hào)名稱拉丁學(xué)名GenBank登錄號(hào)nrITSmatKrbcL14波瓣兜蘭PaphiopediluminsigneAJ564369 AY643448JQ929329 AY643449JQ660898 JQ929381KP312049 KP312050HQ998574 HQ998573HQ998572 HQ99857115麻栗坡兜蘭PaphiopedilummalipoenseEF156125 FJ712272JX088554 JQ929336HQ123427JQ929388 KF361653KP311996-16硬葉兜蘭PaphiopedilummicranthumAY643432 EF156128FJ712270 JX088561JQ929338-HQ998561 HQ998562HQ998563 HQ99856417飄帶兜蘭PaphiopedilumparishiiEF156140 JQ660868JX088555 JQ929340JQ660891 JQ929392KP312026-18菲律賓兜蘭PaphiopedilumphilippinenseAY643475 EF156141EF156142 JQ929341AJ564356JQ929393 KP312014KP312015HQ998557 HQ998558HQ99855919黃花兜蘭PaphiopedilumprimulinumAY643438 EF156143JQ929342 JQ929343JQ929394 KP312030JQ929395-20白旗兜蘭PaphiopedilumspicerianumAY643450 EF156145JX088545 JQ929347HQ998509 HQ998507HQ998506 HQ998505HQ998586 HQ998584HQ998583 HQ998582HQ998581 HQ99858021天倫兜蘭Paphiopedilumtranlienia?numEF156151 FJ712267GU461602 JX088556-KP311810 KU183630KU183630 KU18363222越南兜蘭PaphiopedilumvietnamenseAY643433 EF156158GU461603--23紫毛兜蘭PaphiopedilumvillosumEF156159 FJ712268JQ660875 JX088563JQ929354JQ660899 KP312057JQ929405HQ998595 HQ998594HQ998593 HQ99859224彩云兜蘭PaphiopedilumwardiiAY643469 EF156161JX088546 JQ929356--25秀麗兜蘭PaphiopedilumvenustumHQ998471 HQ998472HQ998473 HQ998474HQ998475HQ998513 HQ998512HQ998511 HQ998510HQ998591 HQ998590HQ998589 HQ998588HQ99858726卷萼兜蘭Paphiopedilumappletonia?numKC692113 KC692112KC692111 JQ929306JQ929362 KC692115KC692116 KC692140KP312059KP311833 KP311834KP311836 KP31183527杏黃兜蘭PaphiopedilumarmeniacumJX088560 JX088560JX088560 AY643431EU490698 JQ660906KP311994-28虎斑兜蘭Paphiopedilumtigrinum-KP312033 KP312054KP312055KP311835 KP311856KP31185729巨瓣兜蘭Paphiopedilumbellatulum--KP311803 KP311804KU183624

1.2 數(shù)據(jù)分析

采用Clustal X軟件對(duì)下載的序列進(jìn)行比對(duì)[11]，采用MEGA 7軟件的K2P模型分別計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離[12]，并對(duì)序列信息進(jìn)行分析，用office excel 2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行構(gòu)建遺傳距離間隔(barcoding gap)柱狀圖，并用MEGA 7軟件采用鄰接法(Neighbor Joining)對(duì)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選序列特征及信息位點(diǎn)

通過(guò)MEGA 7軟件對(duì)兜蘭屬植物的核糖體ITS、葉綠體matK及rbcL編碼序列的信息分析結(jié)果見(jiàn)表2，可以看出，G+C含量比例最大的是核糖體ITS序列，rbcL編碼序列次之，matK序列中G+C含量比例最小；從變異位點(diǎn)及信息位點(diǎn)來(lái)看，其大小依次為：nrITS>matK>rbcL；而堿基轉(zhuǎn)換與顛換比最大是nrITS序列，最小的是matK序列。

表2 候選序列堿基組成及變異信息率

2.2 候選序列的Barcoding Gap評(píng)估

從不同候選序列種內(nèi)與種間距離頻率分布圖可以看出(圖1、圖2、圖3)，三個(gè)候選序列都沒(méi)有明顯的Barcoding Gap。在nrITS序列片段中，種內(nèi)遺傳距離大部分集中在0.00～0.01區(qū)域，而種間遺傳距離多集中于0.03以上區(qū)域，且種內(nèi)與種間的遺傳距離重疊區(qū)域不大，在matK序列片段中，種內(nèi)遺傳距離大部分集中在0.00～0.01區(qū)域，種間的遺傳距離主要集中在0.02以下區(qū)域，而rbcL片段中，種內(nèi)和種間的遺傳距離都主要集中在0.01以內(nèi)，幾乎不存在Barcoding Gap，由此可見(jiàn)，nrITS序列符合DNA條形碼候選序列要求。

圖1 基于nrITS序列種內(nèi)及種間的遺傳距離頻率分布

2.3 系統(tǒng)聚類分析

通過(guò)鄰接法及k2-p模型對(duì)三個(gè)候選片段構(gòu)建的聚類樹(shù)圖可以看出(圖4、圖5、圖6)，基于nrITS構(gòu)建的聚類樹(shù)能準(zhǔn)確鑒定17種兜蘭屬植物，鑒定成功率高達(dá)62.96%。基于matK序列構(gòu)建的聚類樹(shù)中，能準(zhǔn)確將11種兜蘭屬植物鑒定出來(lái)，鑒定成功率為50%。而基于14種兜蘭屬植物的rbcL基因構(gòu)建的聚類結(jié)果顯示，僅有卷萼兜蘭(P.appletonianum)、帶葉兜蘭(P.hirsutissimum)和綠葉兜蘭(P.hangianum)能準(zhǔn)確鑒定，其分辨率僅為21.42%，由此可見(jiàn)，三個(gè)序列的鑒別能力為nrITS>matK>rbcL。

圖2 基于matK序列種內(nèi)及種間的遺傳距離頻率分布

圖3 基于rbcL序列種內(nèi)及種間的遺傳距離頻率分布

3 結(jié)論與討論

DNA條形碼作為一種分子診斷技術(shù)現(xiàn)在已被普遍應(yīng)用到物種鑒定[13，14]，其結(jié)果客觀性強(qiáng)且操作較簡(jiǎn)便，大大提高了非專業(yè)人員進(jìn)行物種鑒定的效率和準(zhǔn)確性，成為分類學(xué)家非常有力的工具[15]。理想的條形碼基因片段應(yīng)該滿足以下幾個(gè)特點(diǎn)：種間變異明顯大于種內(nèi)變異；一個(gè)或少數(shù)基因片段即可準(zhǔn)確鑒定物種；重復(fù)性好；穩(wěn)定性高；操作簡(jiǎn)便，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；有統(tǒng)一的管理平臺(tái)等[16，17]。本研究結(jié)果表明，在選擇的3個(gè)候選序列中，nrITS序列對(duì)兜蘭屬植物的鑒定成功率最好，且滿足理想的DNA條形碼要求，故在候選序列中推薦nrITS序列為兜蘭屬植物首選的DNA條形碼序列，這與Parven等[8]研究不一致，究其原因可能與Parven選取的兜蘭物種數(shù)量不足有一定關(guān)系。

圖4 基于nrITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖5 基于matK序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖6 基于rbcL序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

葉綠體matK保守性好，但其通用性差，且部分植物中對(duì)matK基因的擴(kuò)增率極低[18，19]。據(jù)報(bào)道[20，21]，matK序列因進(jìn)化速率低等特點(diǎn)可以適用于屬級(jí)水平DNA條形碼研究，鄭司浩等[22]對(duì)半夏屬及其偽品進(jìn)行鑒定研究表明，matK序列能較好的鑒別半夏及其偽品；生書晶等[23]利用matK序列成功鑒定出何首烏及其偽品，本研究結(jié)果表明，基于matK序列對(duì)兜蘭屬植物的鑒定率為61.5%，雖然matK序列在種內(nèi)的變異最小，但種間的變異不大，且在DNA barcoding圖中出現(xiàn)種內(nèi)及種間的遺傳距離頻率分布重疊區(qū)域太大，綜合其考慮，本研究推薦matK序列作為兜蘭屬植物的DNA條形碼候選序列的補(bǔ)充序列。

rbcL序列被作為DNA條形碼的候選序列以來(lái)，備受學(xué)者的關(guān)注，但Kress等[24]研究表明，在有花植物中，rbcL序列進(jìn)化速率較慢，不適合作為種水平上的物種鑒定標(biāo)記。本研究結(jié)果表明，rbcL序列在兜蘭屬植物中的種間及種內(nèi)的遺傳距離差異均不大，表明兜蘭屬植物中rbcL序列存在相對(duì)穩(wěn)定，很難通過(guò)rbcL序列將其鑒別，由此可見(jiàn)，rbcL序列也不適用于兜蘭屬植物候選DNA條形碼。

關(guān)于植物DNA條形碼技術(shù)的研究一直處于探索之中，植物DNA條形碼不像動(dòng)物那樣，COⅠ基因作為動(dòng)物的DNA條形碼序列已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)可[25]。近年來(lái)，很多學(xué)者提出了以序列片段組合的方式作為候選片段對(duì)植物DNA條形碼的研究[26]，Xie等[27]對(duì)我國(guó)22個(gè)屬74種有毒植物的DNA條形碼研究結(jié)果表明，推薦用nrITS+matK+rbcL組合作為其DNA條形碼的候選片段；Yang等[28]基于matK、rbcL及trnH-psbA 3個(gè)序列對(duì)菖蒲(Acoruscalamus)的DNA條形碼研究，結(jié)果表明，matK+rbcL+trnH-psbA 3個(gè)片段組合對(duì)菖蒲的鑒定成功率最高； Saarela等[29]對(duì)490種維管束植物DNA條形碼的研究結(jié)果表明，rbcL序列與matK序列組合研究對(duì)維管束植物的鑒定效果最好，由于本研究中所采用的網(wǎng)上數(shù)據(jù)每條序列對(duì)應(yīng)的種類數(shù)和樣本數(shù)均不相同，不是平行數(shù)據(jù)，所以未將nrITS、matK及rbcL序列的數(shù)據(jù)聯(lián)合起來(lái)進(jìn)行分析，許多研究結(jié)果表明[30-31]，nrITS、matK及rbcL等序列的組合對(duì)蘭科植物的鑒定成功率較高，因此預(yù)計(jì)這一組合在兜蘭屬植物的鑒定中將會(huì)發(fā)揮較好的作用。

[1] Braemg，Chiron G. Paphiopedilum[M]. Paris：Tropicalia，1988.

[2] Guo YY，Huang LQ，Liu ZJ，etal.Promise and Challenge of DNA Barcoding inVenus Slipper (Paphiopedilum)[J].PlosOne，2016，11(1)：1-13.

[3] Zeng S，Huang W，Wu K，etal.In vitro propagation of Paphiopedilum orchids[J].CriticalReviewsinBiotechnology，2016，36(3)：521-534.

[4] Luo Y，Jia JS，Wang CL. A general review of the conservation status of Chinese orchids [J].ChineseBiodiversity，2003，11(1)：70-77.

[5] 曾宋君，田瑞雪，陳之林，等.兜蘭屬植物雜交育種研究進(jìn)展[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2010，18(2)：459-468.

[6] 李永青，焦 婷，吳建平，等.禾本科8種牧草DNA條形碼通用序列篩選[J].草業(yè)科學(xué)，2016，33(9)：1702-1710.

[7] Hebert PDN，Ratnasingham S，Waard JR.Barcoding animal life： cytochrome coxidase subunit 1 divergences among closely related species[J].ProcBiolSci，2003(270)：96-99.

[8] Parveen I，Singh HK，Raghuvanshi S，etal.DNAbarcoding of endangered IndianPaphiopedilumspecies[J].MolecularEcologyResources，2011，12(1)：82-90.

[9] Guo YY，Huang LQ，Liu ZJ，etal.Promise and Challenge of DNA Barcoding inVenus Slipper (Paphiopedilum)[J].PlosOne，2016，11(1)：1-13.

[10] Min KH，Sang-Hun O，Shankar BG，etal.DNA barcoding of Orchidaceae in Korea[J].MolecularEcologyResources，2014，14(3)：499-507.

[11] Tamura K，Dudley J，Nei M，etal.MEGA4： molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J]MolecularBiologyandEvolution，2007，24(8)：1596-1599.

[12] Thompson JD，Gibson TJ，Plewniak F，etal. The CLUSTAL_X windows interface： flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].NucleicAcidsResearch，1997，25(24)：4876-82.

[13] TaberletP，CoissacE，Pompanon F，etal.Power and limitations of the chloroplasttrnL (UAA) intron for plant DNA barcoding [J].NucleicAcidsRes，2007，35(3)：e14.

[14] Kress WJ，Erickson DL.A two-locus global DNAbarcode for land plants： the codingrbcLgene complementsthe non-codingtrnH-psbAspacer region[J].PlosOne2007，2(6)：e508.

[15] 王 柯，陳科力，劉 震，等.錦葵科植物DNA條形碼通用序列的篩選[J]. 植物學(xué)報(bào)，2011，46(3)：276-284.

[16] Slabbinck B，Dawyndt P，Martens M，etal.TaxonGap： a visualization tool for intra-and inter-species variation amongindividual biomarkers[J].Bioinformatics，2008，24(6)：1464-75.

[17] Chase MW，Salamin N，Wilkinson M，etal.Land plants and DNAbarcodes： short-term and long-term goals[J].PhilosTransRSocLondBiolSci，2005，360(1462)：1889-95.

[18] Fazekas AJ，Burgess KS，Kesanakurti PR，etal.Multiple multilocus DNA barcodes fromthe plastid genome discriminate plant species equally well[J].PLoSOne2007，3(7)：e2802.

[19] Yu J，Xue JH，Zhou SL. New universalmatKprimers for DNA barcoding angiosperms[J].JournalofSystematicsandEvolution，2011，49(3)：176-181.

[20] 任保青，陳之端.植物DNA條形碼技術(shù)[J].植物學(xué)報(bào)，2010，45(1)：1-12.

[21] Tallei TE，Kolondam B J.DNA Barcoding of Sangihe Nutmeg ( Myristica fragrans ) usingmatKGene[J]HayatiJournalofBiosciences，2015，22(1)：1-7.

[22] 鄭司浩，魏文龍，任偉光，等. 基于DNA條形碼的半夏屬及其偽品分子鑒別[J].植物學(xué)報(bào)，2014，49(6)：710-719.

[23] 生書晶，嚴(yán) 萍，鄭傳進(jìn)，等. 何首烏及其常見(jiàn)混淆品的matK基因序列分析及鑒別[J].中藥材，2010，33(11)：1707-1711.

[24] Kress WJ，Wurdack KJ，Zimmer EA，etal.Use of DNA barcodes to identify flowering plants[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofScience，2005，102(23)，8369-8374.

[25] IftikharR，Ashfaq M，Rasool A，etal.DNA Barcode Analysis of Thrips(Thysanoptera) Diversity in Pakistan RevealsCryptic Species Complexes[J].PlosOne，2016，11(1)，e0146014.

[26] Li DZ，Liu JQ，Chen ZD.Plant DNA barcoding in China[J].JournalofSystematicsandEvolution，2011(49)：165-168.

[27] Xie L，Wang YW，Guan SY，etal.Prospects and Problems for Identification of PoisonousPlants in China using DNA Barcodes[J].BiomedEnvironSci，2014，27(10)：794-806.

[28] Yang HQ，Dong YR，Gu ZJ，etal.A Preliminary Assessment ofmatK，rbcLandtrnH-psbA as DNA Barcodes for Calamus (Arecaceae) Species in China with a Note on ITS[J].AnnalesBotaniciFennici，2012，49(5-6)：319-330.

[29] Saarela J M，Sokoloff P C，Gillespie L J，etal.DNA barcoding the Canadian Arctic flora： core plastid barcodes (rbcL+matK) for 490 vascular plant species[J].PlosOne，2013，8(10)：e77982-e77982.

[30] 黃明忠. 基于matK基因和ITS序列的海南野生蘭科植物DNA條形碼探討[D].?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2010.

[31] Min KH，Sang-Hun O，Shankar B G，etal.DNA barcoding of Orchidaceae in Korea[J].MolecularEcologyResources，2014，14(3)：499-507.

Study on the DNA Barcode Sequence ofPaphiopedilumBased on Data from GenBank

YANGPeng，GUANPing，CHENXing-yin，ZHANGKai-kai，PENGChang-qing，CHENGYu，SHIJian-ming*

(CollegeoflifeSciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025China)

In order to screen the DNA barcode sequence of Paphiopedilum [Asparagales: Orchidaceae], we downloaded 253 sequences of 29 species of Paphiopedilum from GenBank. The candidate barcodes of Paphiopedilum were analysed by genetic distance method and molecular phylogenetic method. The results showed that the highest success rate is by the nrITS sequence with a resolution of 62.96%, followed by the matK sequence with a resolution of 50%, and lastly by the rbcL sequence with a resolution of only 21.43%. Therefore, we recommend the nrITS sequence be used as Paphiopedilum DNA barcoding sequence, and the matK sequence as a supplement sequence.

Paphiopedilum；DNA barcode；nrITSsequence

2017-03-03；

2017-05-15

貴州省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目([2013]2124)。

Q949.71+8.43

A

1008-0457(2017)04-0021-06 國(guó)際

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.04.004

*通訊作者：石建明(1962-)，男，博士，副教授，主要研究方向：植物學(xué)及植物生物技術(shù)研究；E-mail：guanp508@163.com。