李季++戴雪梅++孫芳++黃天帶++華玉偉++黃華孫

摘 要 利用5′缺失設(shè)計(jì)一系列引物，擴(kuò)增HbFCA啟動(dòng)子質(zhì)粒，獲得5個(gè)啟動(dòng)子缺失片段，用這些片段分別替換PBI121載體中的CaMV35S啟動(dòng)子，得到5個(gè)HbFCA的5′缺失表達(dá)載體，即pA、pB、pC、pD和pE。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化，對(duì)組培瓶內(nèi)生根較好的煙草葉片GUS染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長度為最小片段的276 bp的pE可以較好地實(shí)現(xiàn)HbFCA啟動(dòng)子的功能。對(duì)橡膠樹體細(xì)胞胚瞬時(shí)表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，pE片段也能啟動(dòng)表達(dá)，有較好的GUS活性，可以實(shí)現(xiàn)HbFCA啟動(dòng)子的功能。

關(guān)鍵詞 橡膠樹 ；HbFCA ；啟動(dòng)子 ；5′端缺失分析法 ；核心結(jié)構(gòu)域

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.07.013

5' Deletion Analysis of HbFCA Promoter from Hevea brasiliensis

in Transgenic Tobacco

LI Ji DAI Xuemei SUN Fang HUANG Tiandai HUA Yuwei HUANG Huasun

（Rubber Research Institute， CATAS & Ministry of Agriculture Key Laboratory

of Rubber Biology， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract Using the 5' end serial deletion analysis method， five HbFCA promoter deletion fragments which had different distances from transcription start site were amplified by PCR， and they were used to replace the CaMV35S promoter of PBI121 carrier to obtain 5 HbFCA 5'deletion expression vectors， i.e. pA， pB， pC， pD and pE. The expression vectors were transformed into tobacco by using agrobacterium-meditated leaf disc method， and the well-rooted transformed tobacco plants in tissue culture vessels were directly detected with GUS staining. The results showed that the pE 267 bp， the shortest among the fragments， had promoter activity. The transient expression analysis of somatic embryo of rubber tree showed that the fragment pE also had better GUS staining， and could function as a HbFCA promoter.

Keywords rubber tree ； HbFCA ； promoter ； 5' deletion analysis method ； functional domain

橡膠樹轉(zhuǎn)基因體系已相對(duì)完善[1-2]，載體構(gòu)建時(shí)多使用外源組成型啟動(dòng)子（如CaMV35S[3-5]）。但外源性啟動(dòng)子存在著表達(dá)效率低下，多呈瞬時(shí)表達(dá)，穩(wěn)定表達(dá)較少[6-9]，容易引起外源基因的多拷貝整合[10]或轉(zhuǎn)基因沉默[11]，以及影響外源基因的表達(dá)水平和表達(dá)模式[12]等問題。因此，選擇一個(gè)橡膠樹內(nèi)源的，高效的組成型表達(dá)啟動(dòng)子已成為橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

FCA基因的功能具有多樣性，除與開花調(diào)控外，還與種子休眠、種子千粒重和纖維產(chǎn)量的相關(guān)[13]。擬南芥FCA啟動(dòng)子在多個(gè)組織中均能啟動(dòng)FCA基因的表達(dá)[14]。橡膠樹HbFCA啟動(dòng)子具有典型的真核生物核心啟動(dòng)子區(qū)域，共有28種順式調(diào)控元件，在橡膠樹葉片、莖段、樹根和胚狀體等組織均能啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，具有組成型啟動(dòng)子的特點(diǎn)[15]。

啟動(dòng)子缺失分析是研究啟動(dòng)子及其調(diào)控元件功能的一種重要、有效的方法。本研究在已獲得的橡膠樹HbFCA啟動(dòng)子全長的基礎(chǔ)上，通過5′端缺失等實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)其核心序列結(jié)構(gòu)區(qū)域進(jìn)行相關(guān)分析鑒定，為通過系統(tǒng)改造獲得啟動(dòng)活性更強(qiáng)、序列長度更短、具有更廣泛應(yīng)用價(jià)值的橡膠樹內(nèi)源組成型表達(dá)啟動(dòng)子奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

煙草本生煙，大腸桿菌菌株DH5α，PBI121載體（含CaMV35S啟動(dòng)子和GUS報(bào)告基因），根癌農(nóng)桿菌EHA105均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

prime STAR Max酶、PUC18載體和T4 DNA連接酶購于Takara公司，膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購于OMEGA公司。Taq DNA聚合酶、dNTPs、FastDigestr HindⅢ和FastDigest XbaⅠ購于Fermentas公司。DNA提取試劑盒購于TIANGEN公司（DP320）。DL 2 000 Marker購于Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 含有不同長度的HbFCA啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建

以HbFCA啟動(dòng)子預(yù)測結(jié)果為依據(jù)，根據(jù)常見的CAAT-box、TATA-box以及甲基茉莉酸順式作用元件及光效應(yīng)元件等位置，將其5′依次截短，設(shè)計(jì)引物FCA-L1-2、FCA-L2-2、FCA-L3-2、FCA-L4-2、FCA-L5-2和FCA-R，其中FCA-L1-2/FCA-R為啟動(dòng)子全長擴(kuò)增引物。前5個(gè)引物的5′端引入Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)，F(xiàn)CA-R的5′端引入XbaⅠ酶切位點(diǎn)，以PHbFCA為模板，引物FCA-L1-2/FCA-R、FCA-L2-2/FCA-R、FCA-L3-2/FCA-R、FCA-L4-2/FCA-R、FCA-L5-2/FCA-R，prime STAR Max酶擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為15 μL，其中2×primeSTAR Max Premix 7.5 μL，左右引物（10 μmol/L）各0.5 μL，ddH2O 4.5 μL，模板（50 ng/μL）2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?8℃預(yù)變性4 min，98℃變性10 s，62℃退火15 s，72℃延伸5 s/Kb，72℃終延伸10 min。長度分別為2 137、1 502、974、506和276 bp。Hind Ⅲ/XbaⅠ酶切上述PCR產(chǎn)物，回收備用，PUC18載體同樣利用Hind Ⅲ/XbaⅠ雙切，T4 DNA連接酶連接，挑取單克隆，測序，選擇正確的菌液保菌，提取質(zhì)粒后Hind Ⅲ/XbaⅠ雙切，溶液回收產(chǎn)物備用，PBI121利用Hind Ⅲ/XbaⅠ雙切，切除CaMV 35s啟動(dòng)子，回收大片段分別與上述5個(gè)質(zhì)粒酶切產(chǎn)物進(jìn)行T4 DNA連接酶連接，PCR檢測陽性菌株，完成構(gòu)建植物表達(dá)載體pA、pB、pC、pD和pE（圖1）。將重組載體通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101菌株備用。

1.2.2 煙草遺傳轉(zhuǎn)化與陽性植株篩選

本生煙的遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤侵染法，篩選培養(yǎng)基中添加激素為2.25 mg/L的BAP和0.3 mg/L的NAA，抗生素為500 mg/L的Carb和100 mg/L的Kan，生根培養(yǎng)基中添加1 mg/L的IBA、500 mg/L的Cef和50 mg/L的Kan，經(jīng)培養(yǎng)獲得每個(gè)載體的轉(zhuǎn)化植株。陽性植株篩選不進(jìn)行傳統(tǒng)的PCR檢測，而是在獲得的再生植株中，選擇生根較好的植株直接在組培瓶內(nèi)進(jìn)行取樣GUS染色，染色結(jié)果陽性的植株煉苗，移栽至花盆內(nèi)繼續(xù)生長，收獲種子備用。

1.2.3 GUS染色陽性植株P(guān)CR檢測

待花盆內(nèi)的煙草穩(wěn)定后，選擇相應(yīng)葉片進(jìn)行DNA提取，PCR檢測，抗生素基因檢測反應(yīng)體系為15 μL，各成分組成詳見[16]?；驒z測用PrimeSTAR Max DNA 聚合酶，反應(yīng)體系和程序詳見1.2.1。ddH2O作為空白對(duì)照，本生煙基因組DNA為陰性對(duì)照，含有啟動(dòng)子片段的載體為陽性對(duì)照（表1）。

1.2.4 橡膠樹瞬時(shí)表達(dá)檢測

挑選新鮮次生胚狀體至體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)3 d。測量過夜培養(yǎng)的農(nóng)桿菌OD600值，用未添加鐵鹽、CaCl2，蔗糖濃度30 g/L，去除Phytagel，添加100 μmol/L As的愈傷誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基調(diào)至OD600=0.5作為侵染菌液，置三角瓶待用。將預(yù)培養(yǎng)3 d的胚狀體放入農(nóng)桿菌懸浮液，扎好封口膜，然后放至真空干燥器，用2XZ-4型旋片式真空泵（浙江臨海）抽真空5 min，倒掉菌液，放入加了過濾布的離心管800 r/min離心30 s，取出后置無菌濾紙放工作臺(tái)吹干，期間用無菌三角濾紙吸干胚狀體彎曲處多余菌液，20℃共培養(yǎng)5 d。每個(gè)菌液檢測6個(gè)胚狀體，GUS染色，重復(fù)2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbFCA啟動(dòng)子缺失載體構(gòu)建及鑒定

利用5對(duì)不同引物，分別對(duì)HbFCA啟動(dòng)子質(zhì)粒PCR擴(kuò)增，分別獲得與預(yù)期一致的片段大小見圖2。經(jīng)測序驗(yàn)證，該序列完全正確。通過酶切連接的方式，將5個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入切掉GUS基因的CaMV35s啟動(dòng)子的PBI121載體中，其中PCR檢測結(jié)果如圖3所示，經(jīng)驗(yàn)證與預(yù)期片段大小一致，因此表明啟動(dòng)子缺失片段載體構(gòu)建成功，分別命名為pA、pB、pC、pD和pE。

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草植株的獲得及陽性植株鑒定

將5個(gè)構(gòu)建好的缺失表達(dá)載體及對(duì)照載體PBI121分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101菌株中，轉(zhuǎn)化煙草，選擇生根較好的植株組培瓶內(nèi)取樣GUS染色，結(jié)果如圖4。5個(gè)缺失載體和對(duì)照PBI121均能很好地染色，且均較藍(lán)，初步判斷最小的缺失片段pE具有啟動(dòng)子活性，葉片表面具有大面積藍(lán)色。

2.3 轉(zhuǎn)基因陽性植株P(guān)CR檢測

以煙草葉片基因組DNA為模板，卡那霉素（Npt-f/r）和GUS基因引物（Gus-f/r）對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，啟動(dòng)子擴(kuò)增引物進(jìn)行高保真酶擴(kuò)增，電泳檢測，部分檢測結(jié)果如圖5、6。結(jié)果表明，PCR檢測結(jié)果與GUS染色結(jié)果一致。

2.4 橡膠樹瞬時(shí)表達(dá)檢測

按照1.2.4的方法對(duì)橡膠樹體細(xì)胞胚進(jìn)行5個(gè)缺失載體與對(duì)照PBI121載體瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證（圖7），結(jié)果表明，最小片段pE具有啟動(dòng)子活性，胚狀體呈藍(lán)色。5個(gè)缺失載體較PBI121均較弱，表現(xiàn)在染色程度較淺，但5個(gè)載體間差異不大。

3 討論

啟動(dòng)子5′缺失分析是研究啟動(dòng)子表達(dá)特性和調(diào)控元件功能最常用的方法之一[17]。本研究中以HbFCA啟動(dòng)子預(yù)測結(jié)果為依據(jù)，根據(jù)常見的順式作用元件及光效應(yīng)元件等位置，構(gòu)建了5個(gè)缺失載體，與對(duì)照載體同時(shí)轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)轉(zhuǎn)化的煙草葉片GUS組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)5個(gè)缺失載體均能激活GUS基因的表達(dá)，但表達(dá)強(qiáng)度有差異，其中PBI121表達(dá)最強(qiáng)，HbFCA全長啟動(dòng)子片段表達(dá)與PBI121較為一致，但其他片段GUS染色均較PBI121載體弱，而對(duì)T1代植株GUS蛋白組織染色及系統(tǒng)的定量分析將會(huì)更好的與組成型表達(dá)35s啟動(dòng)子進(jìn)行比較[18-20]，因此本研究下一階段準(zhǔn)備對(duì)煙草T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS定性的分析。瞬時(shí)表達(dá)是快速研究基因表達(dá)等的重要手段[21]，本研究中橡膠樹次生體胚瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示，PBI121中的CaMV35s啟動(dòng)子作為雙子葉植物常用的組成型表達(dá)啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的GUS染色結(jié)果，但HbFCA啟動(dòng)子一系列缺失載體表達(dá)均較弱，且各片段之間表達(dá)差別不大，考慮可能是因?yàn)镠bFCA基因在橡膠樹體細(xì)胞胚中的表達(dá)活性本來就不高（見圖7中pA在橡膠樹胚狀體中瞬時(shí)表達(dá)檢測結(jié)果和孫芳[22]HbFCA基因在愈傷胚、根、葉片、樹皮、花及膠乳中的表達(dá)結(jié)果）。預(yù)測發(fā)現(xiàn)，最小片段pE啟動(dòng)子區(qū)域含有的均為光效應(yīng)元件、甲基茉莉酸應(yīng)答順式調(diào)控元件、熱應(yīng)答順式作用元件、水楊酸應(yīng)答順式作用元件、晝夜調(diào)控順式元件以及-79和-107 bp的TATA-box和-26 bp的CAAT-box。叢明等[23]利用橡膠樹組培苗葉片瞬時(shí)表達(dá)比較306和378 bp的REF啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)，二者均具有明顯的乳管表達(dá)活性，分析發(fā)現(xiàn)，REF啟動(dòng)子的重要功能元件都集中在啟動(dòng)子第73位點(diǎn)之后。

常規(guī)的轉(zhuǎn)基因煙草檢測是將獲得的轉(zhuǎn)化植株移栽到穴盆內(nèi)，取葉片進(jìn)行分子檢測，選擇陽性植株進(jìn)行GUS染色[24]。而本研究中利用在組培瓶內(nèi)選取生根較好的植株進(jìn)行GUS染色來判斷陽性植株，這樣一方面直觀的獲得具有GUS基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因陽性植株，另一方面減輕轉(zhuǎn)基因植株鑒定的工作量。不過該方法可能會(huì)漏掉一些分子檢測為陽性，但是不表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，但這些植株對(duì)后期的啟動(dòng)子功能分析起不到相應(yīng)的作用。

內(nèi)源型啟動(dòng)子由于其內(nèi)源的調(diào)控序列能更好更充分地發(fā)揮其調(diào)控能力，在驅(qū)動(dòng)外源基因的高效穩(wěn)定表達(dá)中比外源啟動(dòng)子更有優(yōu)勢。與此同時(shí)，使用植物自身基因的啟動(dòng)子可以降低外源基因在該植物轉(zhuǎn)基因個(gè)體中的拷貝數(shù)[10]，且可有效避免基因沉默現(xiàn)象[25]。本研究中獲得這個(gè)HbFCA啟動(dòng)子在橡膠樹葉片、根、莖和胚狀體中具有組成型啟動(dòng)子的特點(diǎn)，但在膠乳和樹皮中表達(dá)相對(duì)較低。因此為獲得橡膠樹內(nèi)源組成型高表達(dá)載體，筆者認(rèn)為可以將這個(gè)啟動(dòng)子的核心結(jié)構(gòu)域與膠乳和樹皮中表達(dá)較高的啟動(dòng)子進(jìn)行人工串聯(lián)，獲得人工合成的橡膠樹內(nèi)源組成型表達(dá)啟動(dòng)子，為橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

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