許丁帆,劉艷軍*,丁鼎,季核亮,黃俊軒,武春霞,李建科
(1.天津農(nóng)學院 園藝園林學院,天津 300384;2.天津市耕耘種業(yè)股份有限公司,天津 300408)
花椰菜別名花菜、菜花,是十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種,營養(yǎng)價值高,風味鮮美,適應(yīng)性廣,是我國廣泛種植的主要蔬菜之一[1]。我國是世界上花椰菜種植面積最大、總產(chǎn)最高、發(fā)展最快的國家[2]。花椰菜具有明顯的雜種優(yōu)勢,利用雜種優(yōu)勢是花椰菜育種的重要途徑之一[3]。生產(chǎn)上利用雜種優(yōu)勢已選育出較多的花椰菜,但人工雜交制種需要消耗大量的人力物力,嚴重阻礙花椰菜育種的發(fā)展。且雜交育種會受到季節(jié)氣候、母株材料等因素的影響,選育一個新品種往往需要6~8 a,育種周期較長[4]。
人工種子能夠快速固定雜種優(yōu)勢,大大縮短育種年限,使得優(yōu)良性狀快速得以應(yīng)用。我國在人工種子的研制和研究上取得了較快的進展,其研究主要集中在仙茅[5]、垂盆草[6]、杜鵑[7]、大花蕙蘭[8]等藥用植物和觀賞植物上,關(guān)于蔬菜人工種子的研究相對較少,蔬菜中胡蘿卜、芹菜、萵苣、姜等人工種子已有應(yīng)用[9]。關(guān)于花椰菜人工種子的研究少有報道,花椰菜人工種子的研制可省去人工去雄這一環(huán)節(jié),快速固定F1代優(yōu)良性狀,且不受季節(jié)影響,能夠有效縮短花椰菜育種年限、降低人工成本,具有較強的應(yīng)用價值。制作人工種子的關(guān)鍵是人工種胚的研制,胚狀體、愈傷組織、不定芽等是人工種胚的理想材料[10]。本研究采用花椰菜成熟種子為外植體,直接誘導產(chǎn)生胚狀體,并通過胚狀體增殖的方式獲得大量穩(wěn)定均一的胚狀體,為人工種子胚的研制奠定基礎(chǔ),從而克服采用體細胞直接誘導胚狀體效率低和遺傳穩(wěn)定性差的缺點。
供試花椰菜種子品種為雪劍4號,由天津市耕耘種業(yè)有限公司提供。
1.2.1 花椰菜種子的消毒
選取顆粒飽滿的花椰菜種子,用體積分數(shù)為70%的乙醇溶液潤濕種子表面,再用體積分數(shù)為40%的安替福民溶液消毒10 min,無菌水沖洗3次,每次沖洗5 min。沖洗后用無菌水浸泡2 h,備用。
1.2.2 花椰菜胚狀體的誘導
在無菌濾紙上,用解剖刀將種子表皮損害并刻傷子葉、下胚軸,分別接種到不同花椰菜胚狀體誘導培養(yǎng)基上。胚狀體誘導培養(yǎng)基采用MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別添加不同濃度的BA、2,4-D、NAA和蔗糖,采用7.0 g·L-1瓊脂粉固化,高壓滅菌前調(diào)節(jié)pH至5.8。每個處理接種5瓶,每瓶接種6粒種子,重復3次。
培養(yǎng)條件。于(24±2)℃條件下,采用相同培養(yǎng)基每15 d繼代培養(yǎng)1次,避光培養(yǎng)45 d,然后移至連續(xù)光照條件下培養(yǎng),光照強度為2 000 lx,培養(yǎng)溫度不變,再經(jīng)2次繼代培養(yǎng)后(繼代周期15 d),統(tǒng)計每種培養(yǎng)基上外植體的誘導情況。胚狀體的判斷采用顯微觀察及胚狀體萌發(fā)試驗的方法進行確定,即將誘導出的胚狀體放到MS培養(yǎng)基上,經(jīng)過短時間培養(yǎng)可很快獲得再生植株。
1.2.3 花椰菜胚狀體的增殖培養(yǎng)
誘導出的花椰菜胚狀體呈聚合塊狀,用鑷子將其分成約3 mm見方的顆粒,轉(zhuǎn)接到胚狀體增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別添加不同濃度配比的2,4-D與BA,附加7.0 g·L-1瓊脂粉、30.0 g·L-1蔗糖,pH值5.8。重復3次,每處理接種5瓶,每瓶接種5塊胚狀體顆粒。培養(yǎng)條件為連續(xù)光照,光照強度為2 000 Lx,培養(yǎng)溫度為(26±2)℃。處理每20 d繼代培養(yǎng)1次,60 d后統(tǒng)計每種增殖培養(yǎng)基獲得花椰菜胚狀體的生長情況。
將花椰菜種子刻傷后,經(jīng)過暗培養(yǎng)階段,部分種子吸水膨脹,有的種子子葉長出,有的種子下胚軸長出;將其轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)條件后,部分種子子葉或下胚軸附近出現(xiàn)小的凸起,再經(jīng)1次繼代培養(yǎng),凸起增大,逐漸出現(xiàn)顆粒狀誘導物,經(jīng)鏡檢和萌發(fā)試驗確定部分培養(yǎng)基上的誘導物為胚狀體。
由表1可知,當培養(yǎng)基中加入2.0 mg·L-1BA和2.0 mg·L-12,4-D時,僅能誘導產(chǎn)生愈傷組織,且愈傷組織結(jié)構(gòu)松散,生長速度快,鏡檢觀察此類愈傷組織多為液泡較大的薄壁細胞,一般很難誘導產(chǎn)生胚狀體;當培養(yǎng)基中加入4.0 mg·L-1BA和2.0 mg·L-12,4-D時,外植體表面產(chǎn)生質(zhì)地較硬、結(jié)構(gòu)緊密的綠色愈傷組織,鏡檢發(fā)現(xiàn)此類愈傷組織已經(jīng)組織化,內(nèi)部出現(xiàn)維管組織。不斷提高培養(yǎng)基中BA的濃度,當BA≤8.0 mg·L-1時,胚狀體誘導率隨著BA濃度的增加而提高,但胚狀體結(jié)構(gòu)緊密、生長速度較慢;當BA濃度>8.0 mg·L-1,胚狀體誘導率降低,且胚狀體玻璃化嚴重。為此,試驗在8.0 mg·L-1BA的基礎(chǔ)上附加了少量的NAA,誘導出的胚狀體結(jié)構(gòu)松散且生長速度較快,但此時胚狀體誘導率較低。為了獲得較高的胚狀體誘導率和高質(zhì)量的胚狀體,試驗調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓,當采用8%蔗糖時,花椰菜種子胚狀體誘導率顯著提高,達43.33%,同時胚狀體結(jié)構(gòu)松散、生長速度較快,在短時間內(nèi)生長穩(wěn)定。綜上試驗結(jié)果,選擇MS+8.0 mg·L-1BA+2.0 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-1NAA+8%蔗糖培養(yǎng)基,可獲得理想的花椰菜胚狀體。
表1 花椰菜在不同培養(yǎng)基上胚狀體誘導結(jié)果
將誘導出的胚狀體繼代培養(yǎng)于MS+8.0 mg·L-1BA+2.0 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-1NAA+8%蔗糖上,胚狀體出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象,且結(jié)構(gòu)緊密。為此,調(diào)整培養(yǎng)基激素與蔗糖濃度,在新的胚狀體增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng),經(jīng)過2次繼代培養(yǎng)后不同培養(yǎng)基上胚狀體增殖情況明顯不同。
由表2可知,在培養(yǎng)基中單獨使用一定濃度BA時,花椰菜胚狀體結(jié)構(gòu)變得緊密,并隨著繼代次數(shù)的增加,胚狀體不再具備發(fā)育成苗的能力。當BA濃度為4.0 mg·L-1時,胚狀體玻璃化現(xiàn)象嚴重,最終褐化死亡。當在培養(yǎng)基中單獨使用2,4-D時,胚狀體上出現(xiàn)愈傷組織,并且隨著2,4-D濃度增加,愈傷組織生長速度加快,結(jié)合鏡檢觀察這些愈傷組織均為含大液泡的薄壁細胞。當培養(yǎng)基中BA與2,4-D混合使用時,情況變得較為復雜,這主要取決于二者的比值。當采用較高的BA/2,4-D比值時,胚狀體保持較好,并在適宜的濃度下可以穩(wěn)定增殖;當BA/2,4-D比值較低時,胚狀體不能增殖并逐漸喪失發(fā)育能力,逐漸轉(zhuǎn)變成愈傷組織。因此,選擇MS+4.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-12,4-D+3%蔗糖的培養(yǎng)基進行花椰菜胚狀體增殖的效果最好。
表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對花椰菜胚狀體增殖的影響
植物體胚發(fā)生主要有兩種途徑:一種為直接發(fā)生途徑,即直接在外植體上不經(jīng)愈傷組織階段形成胚狀體,其來源細胞可以是外植體表皮、亞表皮、合子胚等;另一種是在外植體上誘導胚性愈傷組織,再由胚性愈傷組織誘導胚狀體,即間接發(fā)生途徑[11-12]。通過不同體胚發(fā)生途徑獲得的胚狀體在遺傳穩(wěn)定性方面差異較大。一般間接發(fā)生途徑相對直接發(fā)生途徑容易,但直接發(fā)生途徑具有速度快、培養(yǎng)程序簡單的特點,同時還能避免間接發(fā)生途徑中由于經(jīng)愈傷組織階段體細胞無性系變異頻率較高的特點[13]。為此,本試驗選擇花椰菜成熟的合子胚為外植體,直接誘導產(chǎn)生胚狀體。其主要優(yōu)勢為,花椰菜成熟種子本身含有一定數(shù)量的胚性細胞,相對于成熟組織細胞直接誘導胚狀體容易,其原因是胚性細胞實際沒有經(jīng)脫分化和再分化的環(huán)節(jié),而是由胚性細胞直接發(fā)育成胚狀體。如果采用體細胞進行胚狀體的誘導,必須使得體細胞脫分化后再次轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚M織細胞,然后進一步發(fā)育成胚狀體,這一過程,受植物基因型、生理狀態(tài)等影響較大培養(yǎng)條件和營養(yǎng)供應(yīng)較難摸索;同時,采用合子胚為外植體直接誘導胚狀體,可避免細胞在脫分化與再分化過程中因使用大量外源激素,尤其是高濃度2,4-D的使用發(fā)生的遺傳變異。因此,選擇含胚性細胞的外植體以直接發(fā)生途徑獲得的胚狀體是人工種胚的理想材料。
人工種子胚的分割是人工種子制作的關(guān)鍵步驟之一,采用松散型的人工種胚可減少分割時造成的機械損傷,理想的人工種胚材料應(yīng)該是松散型的,而胚狀體增殖一般都會形成難以分離的較大顆粒,在制作人工種子胚時容易造成機械損傷,從而導致種子的出芽率下降現(xiàn)象。本試驗為誘導理想的松散型花椰菜人工種子胚,通過在培養(yǎng)基中加入少量2,4-D的方式,獲得結(jié)構(gòu)松散的胚狀體聚集團。但需要注意一定采用較低濃度的2,4-D。有研究表明,2,4-D易引起培養(yǎng)物發(fā)生染色體變異[14]。同時,試驗為獲得穩(wěn)定增殖且保持松散結(jié)構(gòu)的胚狀體,研究了不同BA與2,4-D比值對胚性材料增殖的主要影響。結(jié)果顯示,采用較高濃度BA和低濃度2,4-D對于胚狀體增殖培養(yǎng)較為理想。普遍認為,BA有利于胚狀體的增殖[15-16],可維持細胞增殖的趨勢,是誘導胚狀體產(chǎn)生次生胚狀體的主要因素,這與初步誘導胚狀體時采用8.0 mg·L-1BA的原理相同,但持續(xù)高濃度的BA也會導致次生胚狀體生長速度過快,胚狀體老化嚴重,這時配合使用一定濃度的2,4-D,可適度減緩胚性增殖這一過程,使得次生胚在形成過程中容易產(chǎn)生外部皮層結(jié)構(gòu),從而容易從母體上分離。
本試驗為獲得理想的花椰菜人工種子胚,選用花椰菜成熟種子為外植體,在高濃度BA和高濃度蔗糖配合使用條件下,獲得花椰菜初生胚狀體,然后再用含較高濃度BA與低濃度2,4-D的胚狀體增殖培養(yǎng)基,獲得了生長穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)松散的胚狀體培養(yǎng)體系,這對于花椰菜人工種子的研制具有重要意義,同時也為其他植物品種的人工種子的研制提供參考。關(guān)于花椰菜胚狀體同步化控制、萌發(fā)性試驗及其包埋與貯藏技術(shù)有待進一步研究。