陜西楊凌某蛋雞場(chǎng)禽戊型肝炎病毒的檢測(cè)

拓曉玲，劉寶元，陳宜陽(yáng)，孫亞妮，趙 欽，周恩民

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)陜西科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，陜西楊凌 712100)

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陜西楊凌某蛋雞場(chǎng)禽戊型肝炎病毒的檢測(cè)

拓曉玲，劉寶元，陳宜陽(yáng)，孫亞妮，趙 欽，周恩民*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)陜西科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，陜西楊凌 712100)

2014年-2015年陜西楊凌地區(qū)部分商品蛋雞場(chǎng)產(chǎn)蛋量下降了10%～40%，剖檢部分雞只發(fā)現(xiàn)肝臟腫大出血。為確診該疫情的病因，從發(fā)病的6個(gè)蛋雞場(chǎng)采集了337份血清和268份糞便，利用間接ELISA和套式RT-PCR分別對(duì)血清中的禽戊型肝炎病毒(HEV)抗體和糞便中的禽HEV RNA進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。ELISA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，168份血清為禽HEV抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性率為49.85%；套式RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，63份糞便為禽HEV RNA基因片段陽(yáng)性，陽(yáng)性率為23.51%?；蚱蔚男蛄型葱苑治霭l(fā)現(xiàn)，楊凌地區(qū)的禽HEV分離株與國(guó)內(nèi)的同源性為93.0%～99.2%；進(jìn)化樹分析表明，其與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的分離株在同一進(jìn)化分支上，同屬禽HEV基因3型。

禽戊型肝炎病毒；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；套式RT-PCR；序列分析

禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)是雞的大肝大脾病(Big liver and spleen disease,BLS)或肝炎脾大綜合征(Hepatitis-splenomegaly syndrome,HSS)的主要病原。該病毒感染主要引起30周齡～72周齡的蛋雞和肉種雞的產(chǎn)蛋量下降(10%～40%)和死淘率升高(1%～4%)，部分發(fā)病雞腹部充血、卵巢退化，偶有肝脾腫大[1]。此外，禽HEV還可以引起雞的亞臨床感染，感染雞只僅出現(xiàn)糞便排毒和病毒血癥，并不表現(xiàn)其他臨床癥狀。但當(dāng)外界環(huán)境和飼料發(fā)生變化或與其他病原混合感染時(shí)，雞群會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)蛋率下降和死淘率升高，從而給雞場(chǎng)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，該病已先后在許多國(guó)家有過(guò)暴發(fā)的報(bào)道[2-9]，是危害養(yǎng)禽業(yè)尤其是蛋雞和種雞養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要疾病之一。

1997年，楊德吉等[10]首先從血清學(xué)方面證實(shí)了我國(guó)雞群中禽HEV感染的存在。2010年，Zhao Q等[7]從患有HSS的病雞中分離獲得我國(guó)首例禽HEV。目前，血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病毒感染在我國(guó)雞群中已廣泛存在[11-12]。2014年-2015年陜西省楊凌地區(qū)的部分商品化蛋雞場(chǎng)發(fā)生了不明原因的產(chǎn)蛋量下降(10%～30%)和死淘率升高(2%)，給養(yǎng)雞場(chǎng)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。臨床剖檢發(fā)現(xiàn)部分雞只肝臟出血和腫大，懷疑該疫情可能是由禽HEV感染引起的雞大肝大脾病。為了進(jìn)一步明確該疫情是否由禽HEV感染引起，本研究從發(fā)病的6個(gè)蛋雞場(chǎng)采集了337份血清和268份糞便，然后利用間接ELISA和套式RT-PCR分別對(duì)血清中的抗禽HEV抗體和糞便樣品中的禽HEV RNA進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 Superscript Ⅱ反轉(zhuǎn)錄酶和TRIzol試劑，Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品； Transtaq High Fidelity DNA聚合酶、EasyPure Quick Gel Extraction試劑盒等常規(guī)的分子生物學(xué)試劑，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；pMD18-T Vector，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 樣品來(lái)源 對(duì)楊凌地區(qū)發(fā)病的6個(gè)蛋雞場(chǎng)進(jìn)行樣品采集(表1)，A雞場(chǎng)分別采集50份血清樣品和40份糞便樣品；B雞場(chǎng)分別采集52份血清樣品和36份糞便樣品；C雞場(chǎng)分別采集48份血清樣品和35份糞便樣品；D雞場(chǎng)分別采集60份血清樣品和50份糞便樣品；E雞場(chǎng)分別采集65份血清樣品和55份糞便樣品；F雞場(chǎng)分別采集62份血清樣品和52份糞便樣品。

1.2 方法

1.2.1 臨床樣品處理 將糞便樣品用無(wú)菌PBS(0.01 mol/L ,pH 7.2)按照質(zhì)量體積比制成10%懸浮液，4℃、3 500 r/min離心10 min，吸取200 μL上清液提取總RNA用于禽HEV RNA的檢測(cè)。將采集的血液樣品先放置37℃ 1 h,然后3 000 r/min離心10 min，吸取血清用于檢測(cè)禽HEV抗體。

表1 楊凌地區(qū)6個(gè)商品化蛋雞場(chǎng)血清和糞便樣品的檢測(cè)結(jié)果

1.2.2 禽HEV抗體檢測(cè) 間接ELISA檢測(cè)收集的血清樣品中的禽HEV抗體[11]。具體方法簡(jiǎn)述如下：利用原核表達(dá)的截短的禽HEV ORF2蛋白為包被抗原，封閉洗滌后，加入100 μL待檢的血清稀釋樣品(1∶50稀釋)，室溫孵育1 h洗滌后，加入100 μL稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗雞二抗(1∶6 000)，孵育洗滌后，加入TMB顯色，3 mol/L濃硫酸終止反應(yīng)，自動(dòng)酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)。

1.2.3 禽HEV RNA檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[13]，合成擴(kuò)增ORF2部分序列的套式PCR引物，目的片段分別為278 bp和242 bp。首先按照TRIzol和Superscript Ⅱ反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)的使用說(shuō)明書，從200 μL糞便懸液中進(jìn)行總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄。然后按照Transtaq High Fidelity DNA 聚合酶(TransGen Biotech)說(shuō)明書進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，最后取5 μL PCR產(chǎn)物于10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4 序列測(cè)定與分析 按照EasyPure Quick Gel Extraction試劑盒的說(shuō)明書對(duì)擴(kuò)增的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，然后與pMD18-T Vector連接，篩選陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。利用DNA Star軟件將獲得的序列與GenBank上禽HEV的參考序列進(jìn)行同源性和進(jìn)化樹分析。所用參考序列的GenBank登錄號(hào)為KP221201、GQ398042、AY870827、FM872317、FM872312、AY870829、EU919193及FM872314。

2 結(jié)果

2.1 血清樣品中禽HEV抗體的檢測(cè)

利用間接ELISA對(duì)6個(gè)蛋雞場(chǎng)收集到的血清樣品進(jìn)行禽HEV抗體的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)337份血清樣品中168份禽HEV抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)到49.85%，不同場(chǎng)之間的陽(yáng)性率為41.67%～58.33%(表1)。

2.2 糞便樣品中禽HEV RNA的檢測(cè)

應(yīng)用TRIzol法對(duì)6個(gè)雞場(chǎng)收集的糞便樣品提取總RNA，然后利用禽HEV的特異性檢測(cè)引物進(jìn)行病毒 ORF2部分基因片段的擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，收集的268份糞便樣品中，63份出現(xiàn)了預(yù)期大小242 bp的目的片段，陽(yáng)性率為23.51%。不同雞場(chǎng)陽(yáng)性率為18.00%～28.85%(表1)。

2.3 序列分析

將63份陽(yáng)性PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序后，序列比較發(fā)現(xiàn)，同一雞場(chǎng)陽(yáng)性樣品的序列同源性為99.6%～100%，為同一禽HEV分離株；不同雞場(chǎng)的同源性為94.2%～98.8%。對(duì)獲得的6個(gè)雞場(chǎng)的禽HEV ORF2基因的部分序列分別命名為China 15-YL-1、China 15-YL-2、China 15-YL-3、China 15-YL-4、China 15-YL-5及China 15-YL-6。然后利用DNA Star軟件的MegAlign程序，將6個(gè)序列與GenBank上參考序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示其與國(guó)內(nèi)的禽HEV參考序列(China-908和China 09-G57)的同源性為93.0%～99.2%，與澳大利亞、美國(guó)、西班牙、德國(guó)及匈牙利等國(guó)的參考序列的同源性為73.4%～97.6%(表2)。

利用DNA Star軟件包里的Clustal W程序構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示6株禽HEV楊凌分離株與我國(guó)其他省份地區(qū)及歐洲和美國(guó)部分分離株在同一進(jìn)化分支上，同屬于禽HEV基因3型(圖1)。

3 討論

血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，禽HEV感染在我國(guó)雞群中已廣泛存在[11-12]，并嚴(yán)重影響著我國(guó)蛋雞和種雞產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。2013年，陜西省西安和咸陽(yáng)等地區(qū)的部分蛋雞場(chǎng)中也檢測(cè)到了禽HEV感染的存在，但其對(duì)當(dāng)?shù)仞B(yǎng)雞場(chǎng)的危害并沒(méi)有引起相關(guān)從業(yè)人員的足夠重視。2014年-2015年楊凌部分商品化蛋雞場(chǎng)暴發(fā)了產(chǎn)蛋率下降和死淘率升高的疫情，給養(yǎng)殖場(chǎng)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。通過(guò)對(duì)發(fā)病雞只的剖檢觀察以及對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)禽流感和新城疫疫苗免疫的問(wèn)卷調(diào)查，懷疑該疫情可能是由禽HEV感染引起的雞大肝大脾病。隨后，收集了6個(gè)發(fā)病雞場(chǎng)的血清和糞便樣品進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室的診斷，結(jié)果顯示6個(gè)雞場(chǎng)均存在禽HEV的感染，并且糞便中病毒RNA的檢出證實(shí)禽HEV的感染在上述雞場(chǎng)中正在發(fā)生。此外，禽HEV抗體和RNA在6個(gè)蛋雞場(chǎng)的檢出說(shuō)明了該病毒的感染在楊凌地區(qū)的蛋雞場(chǎng)中已廣泛流行，并給蛋雞產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，必須引起當(dāng)?shù)叵嚓P(guān)養(yǎng)殖從業(yè)人員的注意。

表2 禽HEV ORF2基因序列與GenBank中部分禽HEV序列同源性分析

圖1 禽HEV部分ORF2基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹

利用DNA Star分析軟件對(duì)獲得的6個(gè)禽HEV楊凌分離株的ORF2部分基因片段與GenBank中參考序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示其與國(guó)內(nèi)的禽HEV參考序列(China-908和China 09-G57)的同源性最高，可能屬于同一來(lái)源。此外，進(jìn)化樹結(jié)果顯示，本研究的禽HEV分離株與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的同屬于基因3型，進(jìn)一步說(shuō)明了我國(guó)不同地區(qū)的養(yǎng)雞場(chǎng)中仍主要存在基因3型禽HEV的感染[7]，是否存在其他基因型仍需要進(jìn)一步的流行病學(xué)調(diào)查。

盡管已有報(bào)道禽HEV的垂直傳播，但是目前仍認(rèn)為糞-口途徑的水平傳播是該病的主要傳播途徑。此次楊凌地區(qū)不同蛋雞場(chǎng)暴發(fā)了雞大肝大脾病，其傳染源或暴發(fā)原因仍需進(jìn)一步的流行病學(xué)調(diào)查。目前，仍嚴(yán)重低估了禽HEV的感染對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的危害，其相關(guān)的綜合防控技術(shù)的研究也比較滯后，尚無(wú)特效疫苗和治療藥物。發(fā)病的養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)該及時(shí)清理糞便，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，定期對(duì)雞舍及其活動(dòng)場(chǎng)地進(jìn)行消毒；其次減少應(yīng)激，避免雞群免疫力下降；最后雞群飼喂保肝護(hù)肝藥物，增強(qiáng)群體免疫力。

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Detection of Avian Hepatitis E Virus in Laying Hen Farms in Yangling Shaanxi Province

TUO Xiao-ling,LIU Bao-yuan,CHEN Yi-yang,SUN Ya-ni,ZHAO Qin,ZHOU En-min

(CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA&FUniversity，ScientificObservingandExperimentalStationofVeterinaryPharmacologyandDiagnosis,MinistryofAgriculture,Shaanxi,Yangling,712100,China)

In 2014-2015,many laying hen flocks in Yangling of Shaanxi province had a decrease in egg production (10%-40%) in laying hens.Some necropsied laying hens showed liver hemorrhage and enlarged.To determine the causative agent of the disease,the 337 serum and 268 fecal samples were collected from 6 laying hen flocks.Subsequently,anti-avian hepatitis E virus (HEV) IgG antibodies in serum samples by indirect ELSIA and avian HEV RNA by nested RT-PCR (RT-nPCR) were tested.The results of indirect ELISA showed that the 168 serum samples were positive for anti-avian HEV IgG antibodies and the positive rate was 49.85%.The results of RT-nPCR showed that the 63 fecal samples were positive for avian HEV RNA and the total positive rate was 23.51%.Comparisons of the sequences from the positive fecal samples showed that they shared 93.0%-99.2% identities with the isolates from other provinces of China.Phylogenetic analysis showed that these strains were located in the same branch with other isolates in China and they all belonged to genotype 3 avian HEV.

Avian hepatitis E virus; ELISA; nested RT-PCR; sequence analysis

2016-11-22

“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0500800)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372464，31402233，31672583)

拓曉玲(1984-)，女，陜西安塞人，獸醫(yī)碩士，主要從事畜禽疫病的診斷。*通訊作者

S852.657；S858.31

B

1007-5038(2017)07-0120-04