豬源大腸埃希菌氯霉素類抗生素主要耐藥基因的檢測(cè)與分析

趙鳳菊，關(guān) 淼，李清竹，李井春，梁 喬，顧貴波

(遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽 110164)

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豬源大腸埃希菌氯霉素類抗生素主要耐藥基因的檢測(cè)與分析

趙鳳菊，關(guān) 淼，李清竹，李井春，梁 喬，顧貴波

(遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽 110164)

為查明遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌氯霉素類耐藥菌株主要耐藥基因的流行及分布情況，為豬大腸埃希菌病的防控提供科學(xué)依據(jù)，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)25株氯霉素類耐藥菌株進(jìn)行cat1、cmlA基因檢測(cè)，并對(duì)cat1和cmlA基因進(jìn)行序列分析。通過對(duì)耐藥基因的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，cat1、cmlA基因的檢出率分別為32%和84%，8株同時(shí)檢出cat1和cmlA基因。因此，在遼寧地區(qū)cmlA基因在豬源大腸埃希菌耐藥菌株中普遍存在，cmlA介導(dǎo)的泵出機(jī)制是遼寧地區(qū)氯霉素類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因；其次為cat1基因，與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的滅活有關(guān)。

大腸埃希菌；氯霉素類抗生素；耐藥基因；聚合酶鏈反應(yīng)；豬

大腸埃希菌是人類和動(dòng)物腸道正常菌群的主要成員，也是一種常見的人畜共患病病原，具有攜帶抗性質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移抗性的能力，在抗生素耐藥細(xì)菌種群的生態(tài)環(huán)境中起著重要的作用，嚴(yán)重威脅著人類和動(dòng)物健康[1]。氯霉素類藥物包括氯霉素、甲砜霉素及氟苯尼考，是一種廣譜抗生素，吸收快、體內(nèi)分布廣泛，在獸醫(yī)臨床上發(fā)揮著重要的作用，特別對(duì)大腸埃希菌和沙門菌等革蘭陰性菌有較強(qiáng)的抑菌作用[2]。但由于氯霉素和甲嵐霉素可以抑制哺乳動(dòng)物線粒體蛋白質(zhì)的合成，因此，包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家陸續(xù)禁止了它們?cè)讷F醫(yī)臨床上的使用[3-4]。而氟苯尼考因安全性和有效性在我國(guó)獸醫(yī)臨床上仍被廣泛使用，由于抗生素的不合理使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性，尤其是多重耐藥現(xiàn)象越來越嚴(yán)重?？股氐哪退幮云茐牧擞行е委熑祟惡蛣?dòng)物細(xì)菌性疾病的可能性，同時(shí)使用抗生素產(chǎn)生的選擇壓力有利于耐藥細(xì)菌的傳播，是未來的全球性主要威脅之一[5]。

在對(duì)遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌的耐藥性調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)豬源大腸埃希菌對(duì)氯霉素類藥物的耐藥率高達(dá)38.47%(25/65)。為了解氯霉素類耐藥基因cat1、cmlA在遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌中的流行和分布特點(diǎn)，對(duì)25株氯霉素類抗生素耐藥的菌株進(jìn)行PCR檢測(cè)，為獸醫(yī)臨床氯霉素類抗生素的合理使用及豬大腸埃希菌病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 25株對(duì)氯霉素類抗生素耐藥的豬源大腸埃希菌，由遼寧不同地區(qū)病死豬或患病豬的組織臟器、活豬糞便中分離得到，由遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)分別為20130608、20130708；水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(MH)、藥敏紙片,杭州市天及微生物試劑有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)分別為140506、140506；DNAzol提取試劑,Invitrogen產(chǎn)品；PrimeSTAR?HS DNA Polymerase with GD buffer、ExTaqDNA聚合酶、10×Ex-Taqbuffer、2.5 mmol/L dNTPs、DNA Marker DL 2 000、溴化乙錠,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；其他為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑。

1.1.3 PCR擴(kuò)增引物 根據(jù)GenBank上登錄的cat1、cmlA基因序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)并合成了兩對(duì)特異性引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌DNA模板的制備 挑取18 h～24 h培養(yǎng)的培養(yǎng)物，用1 mL無菌生理鹽水制備成一定濃度的菌懸液。吸取200 μL菌懸液至1.5 mL Eppendorf管中，加入800 μL DNAzol提取試劑，混勻后4℃、12 000 r/min離心10 min。吸取900 μL上清，置于另一1.5 mL Eppendorf管中，加入500 μL無水乙醇，混勻后4℃、12 000 r/min離心5 min。棄上清，無菌水配制的750 mL/L乙醇洗滌2次，干燥后用40 μL無菌水溶解沉淀，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列

1.2.2 耐藥基因檢測(cè)體系 采用25 μL反應(yīng)體系，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，ExTaq酶0.125 μL，滅菌水16.375 μL，模板 2 μL。

1.2.3 基因測(cè)序檢測(cè)體系 采用50 μL反應(yīng)體系，Prime STAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，2×Prime STAR GD buffer(Mg2+plus)25 μL， dNTP Mixture(2.5 mmol/L)8 μL，上、下游引物各1 μL(引物濃度為20 μmol/L)，模板5 μL，滅菌水補(bǔ)至50 μL。

1.2.4 PCR反應(yīng)條件 94℃ 5 min；94℃ 45 s，退火溫度(根據(jù)引物選擇合適退火溫度) 45 s，72℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定 選取5株cat1基因陽性樣品和16株cmlA基因陽性樣品，將其PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，并與NCBI基因庫進(jìn)行序列同源性比較。

2 結(jié)果

2.1 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

利用PCR檢測(cè)方法，通過對(duì)25株氯霉素類耐藥菌株進(jìn)行主要耐藥基因的檢測(cè)(表2)。結(jié)果表明，25株氯霉素類耐藥菌株中有4株未檢出，cat1、cmlA基因的檢出率分別為32%、84%；其中13株檢出cmlA基因，檢出率為52%，8株同時(shí)檢出cat1、cmlA基因，檢出率為32%。兩種耐藥基因在遼寧不同地區(qū)的分布存在差異，其中cmlA基因在遼寧5個(gè)不同地區(qū)的耐藥菌株中均有檢出，由此可見，cmlA基因在遼寧不同地區(qū)的耐藥菌株中普遍存在；同時(shí)cat1、cmlA兩種基因在除遼東以外其他地區(qū)的耐藥菌株中均有檢出，以遼西地區(qū)檢出率最高(表3)。

表2 25株大腸埃希菌中氯霉素類抗生素主要耐藥基因的分布

表3 不同地區(qū)大腸埃希菌氯霉素類抗生素主要耐藥基因攜帶情況

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定結(jié)果

將5株cat1基因陽性樣品測(cè)序結(jié)果與NCBI基因庫中cat1基因的同源性分析發(fā)現(xiàn)，1份樣品的同源性為99%，4份樣品的同源性為100%。16株cmlA基因陽性樣品測(cè)序結(jié)果與NCBI基因庫中cmlA基因的同源性分析發(fā)現(xiàn),3份樣品的同源性為99%，13份樣品的同源性為100%。

3 討論

細(xì)菌感染仍是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率的主要原因之一，由于多重耐藥菌株的出現(xiàn)使這種情況變得復(fù)雜，導(dǎo)致治療失敗[6]?？股厥怯糜谥委熂?xì)菌感染的藥物，由于藥物使用不當(dāng)和過度使用導(dǎo)致抗生素部分或完全失效，為疾病治療帶來巨大困難，在某些情況下無法醫(yī)治[7]。特別是動(dòng)物源耐藥菌和耐藥基因可以通過食物鏈傳給人類[8]，從而嚴(yán)重威脅到人類健康。因此，動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)不僅對(duì)動(dòng)物細(xì)菌病的科學(xué)防治至關(guān)重要，同時(shí)對(duì)控制人類細(xì)菌病耐藥性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

氯霉素類藥物的耐藥性產(chǎn)生機(jī)制主要有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶和泵系統(tǒng)兩種機(jī)制，但氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶機(jī)制所產(chǎn)生的耐藥性主要只針對(duì)氯霉素，而對(duì)氟苯尼考不起作用[9]。在對(duì)遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌氯霉素類主要耐藥基因的檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在遼寧地區(qū)cmlA基因在豬源大腸埃希菌耐藥菌株中普遍存在，cmlA介導(dǎo)的泵出機(jī)制是遼寧地區(qū)氯霉素類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因。其次為cat1基因，與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的滅活有關(guān)。

加強(qiáng)動(dòng)物源細(xì)菌的耐藥性監(jiān)測(cè)，掌握本地區(qū)細(xì)菌的主要耐藥機(jī)制，不僅利于本地區(qū)動(dòng)物疫病的綜合防控，降低細(xì)菌病造成的經(jīng)濟(jì)損失，為其他地區(qū)動(dòng)物疫病的防控提供參考，也可以控制耐藥菌株和耐藥基因通過食物鏈傳給人類，降低因細(xì)菌耐藥性而造成人類某些細(xì)菌病無藥可治的風(fēng)險(xiǎn)。因此，有必要加強(qiáng)動(dòng)物抗生素使用的管理，督促獸醫(yī)臨床合理用藥，避免或延緩細(xì)菌耐藥性及多重耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)。

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Detection and Analysis of Chloramphenicols Resistance Genes inEscherichiacolifrom Swine

ZHAO Feng-ju,GUAN Miao,LI Qing-zhu,LI Jing-chun,LIANG Qiao,GU Gui-bo

(LiaoningPreventionandControlCenterofAnimalEpidemicDiseases,Shenyang,Liaoning,110164,China)

To find out the prevalence and distribution of chloramphenicols major resistance genes ofEscherichiacolifrom swine in Liaoning area,and provide scientific basis for prevention and treatment of swineE.coliinfection, cat1 and cmlA genes of chloramphenicols resistant strains were detected by polymerase chain reaction (PCR),and the cat1 and cmlA gene sequences were analyzed.Through the detection of drug resistance genes,cat1 gene and cmlA gene detection rates were 32% and 84%,8 strains were detected for cat1,cmlA genes.Therefore,cmlA gene is widespread presence inEscherichiacolistrains from swine in Liaoning region,cmlA mediated pump mechanism is the main reason for chloramphenicol resistance in Liaoning area; the second is the cat1 gene,associated with the inactivation of chloramphenicol acetyltransferase.

Escherichiacoli; chloramphenicols; drug resistance gene; polymerase chain reaction；swine

2016-11-04

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201402573)

趙鳳菊(1978-)，女，河北廊坊人，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物人畜共患病的防控與研究。

S852.612;S859.796

A

1007-5038(2017)07-0049-03