丁邦菊，湯洪敏，2，*

（1.貴州民族大學民族醫(yī)藥學院，貴州貴陽550025；2.貴州民族大學貴州民族醫(yī)藥研究院，貴州貴陽550025）

竹蓀菌絲中鄰苯二甲酸二丁酯含量的測定與分析

丁邦菊1，湯洪敏1，2，*

（1.貴州民族大學民族醫(yī)藥學院，貴州貴陽550025；2.貴州民族大學貴州民族醫(yī)藥研究院，貴州貴陽550025）

測定不同生長時間竹蓀菌絲中鄰苯二甲酸二丁酯（DBP，Dibutyl Phthalate）的含量，探討竹蓀菌絲對DBP是否存在富集作用。通過外標法，并做加標回收試驗，以培養(yǎng)液及空白培養(yǎng)液作為對照，用乙酸乙酯為溶劑，超聲波輔助提取溶劑法提取竹蓀菌絲干品中的DBP，并應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對其進行分析測定。結(jié)果表明：（1）DBP標準線性回歸方程為y=26 021x-74 798，R2=0.999 9，證明方法在5.0 μg/mL～100.0 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。實際樣品加標回收率為95.4%～105.0%，平均回收率為98.9%，RSD為3.4%。（2）在空白培養(yǎng)液中檢測出一定含量的DBP，其濃度為19.30 μg/mL。不同培養(yǎng)時間的培養(yǎng)液中DBP的濃度在17.71μg/mL～20.50 μg/mL范圍，相應(yīng)培養(yǎng)時間的竹蓀菌絲中DBP的含量在28.86 mg/kg～33.52 mg/kg范圍。竹蓀菌絲在培養(yǎng)過程中，能產(chǎn)生和釋放一定量的DBP，并也能一定程度地富集環(huán)境中的DBP。

竹蓀；菌絲；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）

竹蓀（Dictyophora indusiata），是食用真菌[1]。其營養(yǎng)豐富，具備藥食同源的價值。主要分布于云南、四川、貴州、湖南省市。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，竹蓀具有調(diào)脂降壓、抑制腫瘤細胞生長的作用、抗氧化、增強免疫、保肝[2]等功效。目前，對竹蓀的研究主要集中在栽培技術(shù)與加工[3-4]，竹蓀營養(yǎng)含量分析[5]，活性成分與藥效，提取工藝及其分離純化鑒定等[6-7]方面。其中，對竹蓀化學成分的研究中，已有文獻報道竹蓀中含有鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)[8-10]。鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）是鄰苯二甲酸酯類（PAEs，Phthalate Esters）的一類重要化合物，工業(yè)上被廣泛用于塑料制品的生產(chǎn)，還用作農(nóng)藥、殺蟲劑、化妝品、香料等生產(chǎn)材料。DBP在各類環(huán)境中廣泛存在，為優(yōu)先控制污染物。對人群健康的危害主要表現(xiàn)在三方面，即急性毒性；致畸、致癌、致突變作用；生殖發(fā)育毒性[11]。但有報道在真菌中存在天然的DBP[12]，對蚊蟲具有一定的驅(qū)避作用[13]，并且生物對PAEs類具有一定的富集與降解作用[14-15]。

目前，對DBP的研究主要集中于水、土壤、食品以及對人體的毒性作用，而對藥用植物、真菌中的DBP研究較少。關(guān)于對竹蓀菌絲中DBP的富集作用研究未見報道，因此，本課題研究旨在通過有機溶劑對不同生長時間竹蓀菌絲進行提取，采用GC-MS分析測定，外標法定量。并做相應(yīng)空白對照，確定不同生長時間竹蓀菌絲、培養(yǎng)液及空白培養(yǎng)液中DBP的含量。并對三者中DBP含量進行分析比較，判斷竹蓀菌絲對DBP是否具有富集作用，對竹蓀產(chǎn)品的質(zhì)量保證和拓展開發(fā)潛能具有重要現(xiàn)實意義，為進一步帶動竹蓀種質(zhì)的多方向開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

竹蓀菌絲：貴州省榕江縣野生竹蓀轉(zhuǎn)接保存菌絲；培養(yǎng)基：綜合馬鈴薯液體培養(yǎng)基。

鄰苯二甲酸二丁酯標準品：分析純，天津市富精細化工有限公司；乙酸乙酯（色譜純）、葡萄糖（分析純）：天津市優(yōu)譜化學試劑有限公司；甲醇、丙酮、硫酸鎂：分析純，重慶川江化學試劑廠；磷酸二氫鉀：分析純，重慶茂業(yè)化學試劑有限公司；維生素B1：生化試劑，天津市光復精細化工研究所。

1.2 主要儀器

Agilent7890/5975C-GC/MSD氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

依據(jù)王鑫等[16]對食品中鄰苯二甲酸酯類污染物的分析研究中的文獻方法，略加改進。準確移取鄰苯二甲酸二丁酯標品1.00 mL，用乙酸乙酯逐步稀釋制備成105 μg/mL的標準儲備液，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)所需濃度再逐級用乙酸乙酯進行稀釋。以DBP系列標準液濃度（x）為橫坐標，平均響應(yīng)值（y）為縱坐標繪制標準曲線，并計算回歸方程。

1.3.2 樣品的制備

1.3.2.1 竹蓀菌絲的培養(yǎng)與干品制備

通過打孔法將菌絲定量接種于250 mL三角瓶50 mL綜合馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，25℃、110 r/min恒溫搖床上分別培養(yǎng)15、30、45 d，同時并作空白培養(yǎng)液對照。按培養(yǎng)時間依次取出，并抽濾菌絲，濾液（即培養(yǎng)液，取100 mL）用無菌棕色廣口瓶儲存，于4℃冰箱中貯存?zhèn)溆?。竹蓀菌絲經(jīng)蒸餾水重復洗3遍，抽濾，于30℃的干燥箱中烘干至恒重，研磨，分別獲15、30、45 d培養(yǎng)的竹蓀菌絲干品0.97、1.13、1.04 g。

1.3.2.2 竹蓀菌絲干品DBP的提取

分別準確稱取15、30、45d竹蓀菌絲干品粉末0.5g（精確到0.000 1 g）至20 mL具塞磨口玻璃試管，加入5.0 mL乙酸乙酯，振蕩混勻，浸置30 min，在60℃的超聲條件下提取40 min，收集提取液，再加入5.0 mL乙酸乙酯重復提取2次，每次20 min，合并提取液，室溫下氮氣吹干，乙酸乙酯定容至1.0 mL，待GC-MS進行分析測定，外標法定量，然后進行樣品含量計算。

1.3.2.3 空白培養(yǎng)液、培養(yǎng)液中DBP的提取

取0、15、30、45 d空白培養(yǎng)液與培養(yǎng)液，分別于80℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干，移至50 mL具塞磨口錐形瓶中，按竹蓀菌絲干品相同步驟處理（提取過程中用到分液漏斗，將乙酸乙酯提取液與培養(yǎng)液分離），其測定分析方法同上。

1.3.3 氣相色譜條件

色譜柱：Agilent 19091S-433HP－5MS（325℃：30 m× 0.25 μm×0.25 μm）；進樣口溫度230℃；升溫程序：初始柱溫190℃，保持2 min，以10℃/min升溫至250℃，保持5 min，后運行5 min，升至260℃，共運行13 min；載氣（He，純度≥99.999%），流速1 mL/min；進樣量：1.0 μL；分流比10∶1。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電子離源；電子能量70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，乙酸乙酯提取物溶劑延遲2.50 min，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～500。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

以DBP標準溶液濃度x為橫坐標，平均響應(yīng)值y為縱坐標繪制標準曲線（見圖1），DBP標準線性回歸方程為y=26 021x-74 798，R2=0.999 9，證明DBP標準溶液濃度在5.0 μg/mL～100.0 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖1 DBP標準曲線Fig.1 Standard curve of DBP

2.2 測定結(jié)果

經(jīng)GC-MS對空白培養(yǎng)液中的DBP進行了5次平行分析測定。空白培養(yǎng)液中的DBP濃度為19.30μg/mL。

對不同時間的培養(yǎng)液以及竹蓀菌絲中的DBP分別進行5次平行分析測定。測定試驗用外標法進行定量，其測定結(jié)果見表1與表2。

表1 培養(yǎng)液中DBP的檢測結(jié)果Table 1 The results of DBP from culture medium

表2 不同生長時間竹蓀菌絲提取液中DBP的檢測結(jié)果Table 2 Analytical results of DBP from extracts of Dictyophora myceliums in different time

不同培養(yǎng)時間培養(yǎng)液的DBP的濃度在17.71μg/mL～20.50 μg/mL范圍內(nèi)，其中30 d含量最高。培養(yǎng)液中DBP含量的波動變化受菌絲的生長影響。而在不同培養(yǎng)時間菌絲中的DBP的含量在28.86 mg/kg～33.52 mg/kg范圍，其中生長30 d的菌絲中的DBP含量最低。

2.3 樣品加標回收率與精密度試驗

以30 d竹蓀菌絲干粉樣品減半量進行添加回收試驗。按100%的供試品溶液濃度添加DBP標準溶液，其中添加濃度為10.87 μg/mL。按照試驗相同條件及其步驟，平行測定9次，外標法定量。計算回收率及其精密度（RSD），其測定結(jié)果如表3所示。樣品加標回收率為95.4%～105.0%，其平均回收率為98.9%，RSD為3.4%。結(jié)果表明，該方法能夠滿足樣品的測定要求。

表3 竹蓀菌絲樣品中DBP添加回收試驗結(jié)果及RSD（n=9）Table 3 Recoveries and RSDs of DBP spiked into Dictyophora mycelium（n=9）

3 結(jié)論與討論

DBP屬于PAEs中的一類重要化工原料，廣泛用于農(nóng)藥、殺蟲劑、化妝品、香料等的生產(chǎn)中。因此，試驗過程中應(yīng)盡量避免PAEs類化合物的污染。為了試驗結(jié)果的準確度，試驗前按試驗提供的GC-MS分析條件，進行了試劑空白試驗，后續(xù)試驗中所測得的試驗均為扣除空白值。試驗結(jié)果表明：空白培養(yǎng)液、不同培養(yǎng)時間的培養(yǎng)液以及竹蓀菌絲提取液中均含有DBP。

3.1 空白培養(yǎng)液中DBP含量及來源分析

在空白培養(yǎng)液提取液中被檢測到較高的DBP含量，濃度達19.30 μg/mL。可能是培養(yǎng)基原料中的帶入，以及試驗過程中培養(yǎng)基透氣封口膜和一次性過濾器的使用之故。

3.2 培養(yǎng)液中DBP的含量及變化分析

由于空白培養(yǎng)液本身存在一定的DBP物質(zhì)，所以培養(yǎng)液中也含有一定的DBP含量，濃度在17.71～20.50 μg/mL范圍，且與空白培養(yǎng)基的DBP濃度相比呈現(xiàn)降升降的趨勢，說明在菌絲培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液中DBP含量受菌絲生長的影響。

3.3 竹蓀菌絲中DBP的含量及變化分析

竹蓀菌絲中含有較高的DBP含量，含量在28.86mg/ kg～33.52 mg/kg范圍，含量呈現(xiàn)升降升的趨勢。表現(xiàn)為竹蓀菌絲生長初期對環(huán)境中（培養(yǎng)基）的DBP具有一定的富集作用。隨著竹蓀菌絲生長的進行，本身也能夠產(chǎn)生一定量的DBP，并通過釋放到環(huán)境中（培養(yǎng)基）中，致使培養(yǎng)基的DBP含量升高，可能為實現(xiàn)環(huán)境的趨避作用。菌絲生長后期，通過自生產(chǎn)生和對培養(yǎng)基中DBP的富集，致使菌絲中DBP的濃度反彈升高，導致菌絲中的DBP濃度遠大于培養(yǎng)液中的DBP濃度?？赡苁巧L后期為實現(xiàn)趨避作用加強自生保護所致。

綜上所述，竹蓀菌絲在培養(yǎng)過程中，能產(chǎn)生一定量的DBP，并能可釋放一定濃度到環(huán)境中，也能一定程度地富集環(huán)境中的DBP，環(huán)境中和菌絲體內(nèi)DBP類代謝物的增加，能提高菌絲本身對蚊蟲等的驅(qū)避作用。竹蓀菌絲產(chǎn)生和富集DBP的生物學功能，可作為制備綠色環(huán)保的生物驅(qū)避劑原料來源，拓展人們對竹蓀資源的開發(fā)利用范圍。

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Determination and Analysis of Dibutyl Phthalate in Mycelium of Dictyophora

DING Bang-ju1，TANG Hong-min1，2，*
（1.College of National Medicine，Guizhou Minzu University，Guiyang 550025，Guizhou，China；2.Guizhou Institute of Ethnic Medicine，Guizhou Minzu University，Guiyang 550025，Guizhou，China）

To study the effects of Dictyophora mycelium on the accumulation of dibutyl phthalate（DBP），and determine the content of DBP from it in different growth stages.Through the external standard method and standard addition recovery experiment，the medium and blank medium as control groups，the DBP was separated from dried Dictyophora mycelium by ultrasonic-assisted solvent extraction method with ethyl acetate，and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）.The results showed that：（1）The regressione equation of calibration curve was y=26 021x-74 798，the correlative coefficient was 0.9999，and proof method had good linearity within 5.0 μg/mL-100.0 μg/mL range.The actual recoveries were 95.4%-105.0%，the average recovery was 98.9%，and relative standard deviation was 3.4%.（2）A certain amount of DBP was detected from the extracts of blank medium，and its concentration was 19.30 μg/mL.The concentration of DBP from medium in different time was in the range of 17.71 μg/mL-20.50 μg/mL，and the concentration of DBP in the Dictyophora mycelium was 28.86 mg/kg-33.52 mg/kg during the corresponding culture time.Dictyophora mycelium can produce and release a certain amount of DBP during the culture process，and also enrich the DBP in the environment.

Dictyophora；mycelium；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；DBP

2016-11-20

國家自然基金項目地方基金項目（31160013）；貴州民族大學科研基金資助項目（201415）

丁邦菊（1992—），女（侗），在讀碩士，研究方向：民族傳統(tǒng)醫(yī)藥。

*通信作者：湯洪敏（1969—），女（漢），教授，博士，研究方向：種質(zhì)資源保護。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.028