孫夢桐，林洋，馬歡歡，呂欣然，白鳳翎，*，張平

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083；3.北鎮(zhèn)市溝幫子食品有限公司，遼寧錦州121013）

Nisin、山梨酸鉀復(fù)合抑制尹家雞翅中腐敗菌的研究

孫夢桐1，林洋1，馬歡歡1，呂欣然2，白鳳翎1，*，張平3

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083；3.北鎮(zhèn)市溝幫子食品有限公司，遼寧錦州121013）

應(yīng)用Nisin和山梨酸鉀復(fù)合控制尹家雞翅中的腐敗菌。采用微生物學(xué)方法分離雞翅中腐敗菌，利用牛津杯打孔法對腐敗菌進(jìn)行抑制研究，應(yīng)用復(fù)合制劑對產(chǎn)品進(jìn)行保鮮作用研究。從腐敗的尹家雞翅中分離獲得30株腐敗菌，初步鑒定大多數(shù)為革蘭氏陽性桿菌和球菌。Nisin在0.48 g/mL抑制28株腐敗菌的生長，山梨酸鉀在0.48 g/mL抑制27株腐敗菌的生長，0.16 g/mL Nisin和0.16 g/mL山梨酸鉀對30株腐敗菌均有抑菌作用。應(yīng)用0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸鉀在尹家雞翅中保鮮作用較好，在第7天時，細(xì)菌菌落總數(shù)比對照組下降4個數(shù)量級且具有較好的感官評定，雞翅中復(fù)合劑含量符合國家標(biāo)準(zhǔn)。尹家雞翅中添加復(fù)合濃度0.24 g/mL的Nisin和山梨酸鉀可使產(chǎn)品的貨架期延長至7 d。

Nisin；山梨酸鉀；復(fù)合；抑制；尹家雞翅；腐敗菌

熏雞于清光緒十五年聞名并延續(xù)至今，深受廣大消費者的青睞，其加工工藝堪稱一流[1]。尹家雞翅是其系列產(chǎn)品中一種低溫氣調(diào)包裝產(chǎn)品。因原料和加工環(huán)節(jié)的污染，使產(chǎn)品中微生物本底值很高，氣調(diào)保藏方式很難控制腐敗菌的生長繁殖，導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，因此保質(zhì)期一般在2 d～3 d。采用強(qiáng)烈的熱殺菌方式可有效控制產(chǎn)品中的腐敗菌，但容易導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降，一般采取添加防腐劑的方法控制產(chǎn)品中腐敗菌的生長繁殖。Nisin是一種源于乳酸菌的安全、無毒、高效生物防腐劑，能夠有效抑制明串珠菌、葡萄球菌等革蘭氏陽性菌的生長繁殖，特別是對芽孢桿菌抑菌效果較好[2-3]。山梨酸鉀可有效抑制食品中酵母、霉菌和需氧性細(xì)菌的生長繁殖，對革蘭氏陰性菌的作用效果明顯強(qiáng)于革蘭氏陽性菌[4]，廣泛使用于各種食品的防腐保鮮。Nisin和山梨酸鉀復(fù)合應(yīng)用具有提升抑菌強(qiáng)度和擴(kuò)大抑菌譜的優(yōu)勢，徐世明等[5]應(yīng)用0.035%Nisin、0.007%山梨酸鉀和0.180%乳酸鈉復(fù)配，成功使燒雞貨架期延長至20 d?？祽驯虻萚6]應(yīng)用0.05%Nisin、0.05%溶菌酶、2.00%乳酸鈉和1.00%雙乙酸鈉復(fù)配，使道口燒雞產(chǎn)品在常溫下貯藏期延長至20 d～25 d，經(jīng)二次殺菌可使貯藏期達(dá)到60 d。王雪鋒等[7]應(yīng)用0.02% Nisin、0.20%山梨酸鉀和4.00%乳酸鈉復(fù)合保鮮劑，將真空包裝熟叫花雞貯藏期延長至21 d。將Nisin與山梨酸鉀復(fù)合應(yīng)用于雞翅產(chǎn)品的防腐保鮮具有較好的協(xié)同作用，而添加乳酸鈉和雙乙酸鈉會影響產(chǎn)品的風(fēng)味，溶菌酶相對成本過高[8-11]。因此，本文應(yīng)用傳統(tǒng)微生物學(xué)方法從雞翅產(chǎn)品中分離腐敗菌，應(yīng)用Nisin和山梨酸鉀復(fù)合對腐敗菌進(jìn)行抑菌作用研究，并篩選最佳配比控制雞翅產(chǎn)品中腐敗菌生長，達(dá)到延長貨架期的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗原料

尹家雞翅：遼寧錦州北鎮(zhèn)市溝幫子食品有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

LB肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；平板計數(shù)瓊脂（PCA）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（VRBGA）、乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）、瓊脂培養(yǎng)基（STAA）、銅綠假單胞菌培養(yǎng)基（CN）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、麥康凱培養(yǎng)基（MAC)：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；Nisin：浙江銀象生物工程有限公司；山梨酸鉀：河南錦德化工實業(yè)有限公司；重鉻酸鉀、硫代巴比妥酸、98%硫酸、36%鹽酸、氫氧化鈉、山梨酸鉀（均為分析純)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器

DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺：東聯(lián)哈爾（北京）儀器制造有限公司；MOTIC BA300數(shù)碼顯微鏡：日本麥克奧迪（MOTIC）；GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；IKA Vortex GENIUS 3振蕩器：德國IKA公司；V3型全自動菌落計數(shù)儀：杭州迅數(shù)科技有限公司；超微量電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SPX-250智能生化培養(yǎng)箱：寧波海曙賽福實驗儀器廠；SP-722E型可見分光光度計：北京東南儀誠實驗室設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

在無菌條件下，取雞翅10.0 g剪碎后放入90 mL滅菌生理鹽水中，應(yīng)用IKA Vortex GENIUS 3振蕩器充分振蕩5 min，靜置20 min。

1.2.2 腐敗菌的分離鑒定

用接種環(huán)挑取經(jīng)過處理后的樣液，PCA、VRBGA、MRS、STAA、CN、PDA和MAC上劃線[12]，37℃培養(yǎng)48h，挑取平板上典型菌落進(jìn)行劃線分離純化兩次，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢。

1.2.3 抑菌試驗

將純化后的單菌落接種LB肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，用IKA Vortex GENIUS 3振蕩器振蕩2 min，混勻備用。參考文獻(xiàn)[13]采用牛津杯打孔法，將10 mL素瓊脂倒入無菌平板中，凝固后，將牛津杯放在素瓊脂表面。吸取125 μL 106CFU/mL菌懸液置于25 mL 45℃～50℃LB瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，倒入置有牛津杯的平板中（不要倒進(jìn)牛津杯的孔里）。待凝固后取出牛津杯，在牛津杯孔中分別加入125 μL的0.02、0.04、0.08、0.16、0.24、0.48 g/mL的Nisin和山梨酸鉀及復(fù)合濃度為0.02、0.04、0.08、0.16、0.24 g/mL的Nisin和山梨酸鉀，37℃培養(yǎng)48 h后，記錄抑菌效果，選出應(yīng)用抑菌濃度。

1.2.4 復(fù)合保鮮劑對尹家雞翅保鮮研究

1.2.4.1 樣品處理

選取抑菌試驗篩選的Nisin、山梨酸鉀和二者復(fù)合制劑，將樣品在不同濃度試劑中浸泡4 min，取出裝袋封口后4℃貯藏，分別在第1、3、5、7、9天時測細(xì)菌菌落總數(shù)，并以不添加試劑為對照。

1.2.4.2 細(xì)菌菌落總數(shù)的測定

按GB/T 4789.02-2012《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》的方法進(jìn)行測定。

1.2.4.3 感官評價

感官質(zhì)量評定指標(biāo)包括氣味、滋味、組織狀態(tài)、外觀及色澤，選取6名有經(jīng)驗的食品專業(yè)教師和學(xué)生采用Williams[14]9點評分法進(jìn)行雞翅的感官評分。9點評分分級為：9=極好，8=很好，7=好，6=次好，5=一般，4=一般以下，3=差，2=很差，1=極差，且評分≥5為可接受。

1.2.4.4 山梨酸鉀含量測定

按照GB 1886.39-2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑山梨酸鉀》對應(yīng)用山梨酸鉀試劑處理過的尹家雞翅進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 腐敗菌的分離與初步鑒定

尹家雞翅中分離菌株革蘭氏染色和菌落形態(tài)結(jié)果見表1。

表1列出了從各種選擇性培養(yǎng)基中挑取的30個典型菌落，其中，PCA 4個、VRBGA 10個、STAA 8個、CN 2個、MRS 4個、PDA和MAC各1個。革蘭氏陽性菌26個，占86.7%；革蘭氏陰性菌4個，占13.3%。球狀9個，占30.0%；桿狀和短桿狀21個，占70.0%。由此可見，導(dǎo)致尹家雞翅腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢菌群為革蘭氏陽性桿菌，主要包括假單胞菌、熱死環(huán)絲菌、乳酸菌和腸桿菌等，這與郭光平等[16]對非真空包裝燒雞中腐敗菌的初始菌相構(gòu)成的結(jié)果相似。

表1 尹家雞翅中分離菌株革蘭氏染色和菌落形態(tài)結(jié)果Table 1 Results of Gram staining and colony morphology of separate strains from Yinjia chicken wings

經(jīng)革蘭氏染色后的鏡檢結(jié)果如圖1所示。

MRS分離的菌株為革蘭氏陽性菌，呈現(xiàn)雙排列；MAC分離的是革蘭氏陰性桿菌，VRBGA分離的是革蘭氏陽性短桿菌；STAA分離的為革蘭氏陽性桿菌，形態(tài)大小各異。由此可以看出，導(dǎo)致尹家雞翅腐敗的主體細(xì)菌類群為革蘭氏陽性桿菌。

2.2 抑菌試驗結(jié)果

不同濃度Nisin和山梨酸鉀以及兩者復(fù)合制劑對30株分離菌的抑制作用結(jié)果見表2。

圖1 尹家雞翅中分離菌株的革蘭氏染色結(jié)果（1 000×）Fig.1 Gram staining results of separate strains from Yinjia chicken wings

表2 Nisin和山梨酸鉀對雞翅中腐敗菌的抑菌結(jié)果Table 2 Results of inhibition of spoilage bacteria using Nisin and potassium sorbate in chicken wings

從中可以看出，0.24 g/mL和0.48 g/mL的Nisin可分別抑制26株和28株分離菌的生長，不被抑制的菌株中PCA-1、VRBGA-7和VRBGA-8為革蘭氏陰性菌，對Nisin不敏感。只有菌株P(guān)CA-4對Nisin具有較強(qiáng)的抗性。0.24 g/mL和0.48 g/mL的山梨酸鉀分別可抑制26株和27株分離菌的生長，不被抑制的菌株中MRS-3、PCA-2、PCA-3為革蘭氏陽性球菌，STAA-1為革蘭氏陽性桿菌，可能是與山梨酸鉀抑菌能力有關(guān)。0.16 g/mL Nisin和山梨酸鉀和0.24 g/mL Nisin和山梨酸鉀復(fù)合可抑制全部30株腐敗菌的生長繁殖，說明Nisin和山梨酸鉀兩者的抑菌作用可以互補(bǔ)，具有協(xié)同作用效應(yīng)。依據(jù)抑菌效果，將0.48 g/mL的Nisin和0.48 g/mL的山梨酸鉀以及0.16、0.24 g/mL的Nisin和山梨酸鉀復(fù)合應(yīng)用到尹家雞翅產(chǎn)品進(jìn)行保鮮試驗。

不同劑量的Nisin、山梨酸鉀和兩者復(fù)合制劑對尹家雞翅中分離腐敗菌的抑菌效果圖如圖2所示。

圖2 不同試劑對雞翅中腐敗菌的抑菌結(jié)果Fig.2 Results of inhibition of spoilage bacteria from chicken wings using different preservative

從圖2a中可以看出，0.08 g/mL山梨酸鉀對菌株MRS-4生長具有一定的抑菌作用，隨著濃度的增大，抑菌圈逐漸增大清晰；b中0.08 g/mLNisin對菌株MRS-4具有很好的抑菌作用，0.16 g/mL時抑菌效果已達(dá)到最好；圖中c表明Nisin、山梨酸鉀復(fù)合試劑對菌株MRS-4的抑制效果在0.16 g/mL Nisin和0.16 g/mL山梨酸鉀制劑、0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸鉀制劑較好。

2.3 復(fù)合保鮮劑對尹家雞翅保鮮效果中菌落總數(shù)測定結(jié)果

應(yīng)用0.48 g/mL Nisin和0.48 g/mL山梨酸鉀以及0.16 g/mL，0.24 g/mL Nisin和山梨酸鉀復(fù)合對尹家雞翅進(jìn)行保鮮試驗，貯藏9 d后細(xì)菌菌落計數(shù)指標(biāo)結(jié)果如圖3所示。

圖3 應(yīng)用Nisin和山梨酸鉀制劑對尹家雞翅中腐敗菌的抑制結(jié)果Fig.3 Results of inhibition of spoilage bacteria using Nisin and potassium sorbate in Yinjia chicken wings

從圖3中可以看出，不同試劑處理的產(chǎn)品與對照組相比較，添加0.48 g/mL Nisin的尹家雞翅樣品在第3天至第5天細(xì)菌菌落總數(shù)比未添加試劑對照組下降3至5個數(shù)量級，第7天至第9天時，細(xì)菌菌落總數(shù)下降2個數(shù)量級，9 d后細(xì)菌菌落總數(shù)逐漸增大；添加0.48 g/mL山梨酸鉀的尹家雞翅樣品在第3、5、7天細(xì)菌菌落總數(shù)比未添加試劑對照組下降3、5、3個數(shù)量級，7 d后細(xì)菌菌落總數(shù)下降；添加0.16 g/mL Nisin和0.16 g/mL山梨酸鉀試劑的尹家雞翅樣品在第3、5、7天細(xì)菌菌落總數(shù)比未添加試劑的對照組分別下降3、5、1個數(shù)量級，7 d后細(xì)菌菌落總數(shù)下降；添加0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸鉀的尹家雞翅中的菌落總數(shù)在第3天至第5天比未添加試劑的對照組下降3個至5個數(shù)量級，在第7天細(xì)菌菌落總數(shù)比未添加試劑的對照組下降4個數(shù)量級。從整體來看，添加0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸鉀的尹家雞翅中的菌落總數(shù)從第1天至第7天始終比其他組的細(xì)菌菌落總數(shù)低，抑菌效果相對較好。

2.4 復(fù)合制劑對尹家雞翅保鮮效果中感官評定結(jié)果

將添加0.48 g/mL Nisin和0.48 g/mL山梨酸鉀以及0.16、0.24 g/mL Nisin和山梨酸鉀復(fù)合制劑的樣品分別在第1、3、5、7、9天進(jìn)行感官評定，感官評定結(jié)果如圖4所示。

圖4 Nisin和山梨酸鉀制劑處理尹家雞翅的感官評分結(jié)果Fig.4 Results of sensory score of Yinjia chicken wings using Nisin and potassium sorbate

可以看出，隨著貯藏時間增加，雞翅感官質(zhì)量下降，添加試劑的樣品感官評價更好。從0至第7天，感官質(zhì)量評分結(jié)果良好；7 d后感官質(zhì)量迅速下降；到第9天對照組的感官評價不可接受（≤5分），添加試劑的樣品感官評價較差。感官質(zhì)量從高到低依次是0.24 g/ mL的Nisin和0.24 g/mL的山梨酸鉀復(fù)合、0.48 g/mL山梨酸鉀、0.48 g/mL Nisin以及0.16 g/mL的Nisin和0.16 g/mL的山梨酸鉀復(fù)合。因此，說明添加0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸鉀復(fù)合在保持原有口感的條件下可將尹家雞翅的貯藏期從2 d延長至7 d，這與抑菌試驗、菌落總數(shù)測定結(jié)果相一致。

2.5 尹家雞翅中山梨酸鉀測定結(jié)果

應(yīng)用國標(biāo)方法測得尹家雞翅樣品中山梨酸鉀含量見表3，可以看出所有添加山梨酸鉀的樣品中山梨酸鉀殘留量不超過國家標(biāo)準(zhǔn)限量要求（0.075 g/kg）。

表3 尹家雞翅中山梨酸鉀測定結(jié)果Table 3 Results of the determination of potassium sorbate in Yinjia chicken wings

3 結(jié)論

尹家雞翅產(chǎn)品是一種低溫氣調(diào)包裝的即食禽類制品，由于原料和加工等原因?qū)е庐a(chǎn)品本身腐敗菌污染嚴(yán)重，采用氣調(diào)方式很難控制其腐敗菌的生長。本文應(yīng)用PCA、VRBGA、MRS、STAA、CN和MAC固體培養(yǎng)基經(jīng)分離純化篩選出30株腐敗菌菌株，進(jìn)而應(yīng)用Nisin和山梨酸鉀及二者復(fù)合試劑對30株腐敗菌進(jìn)行抑菌試驗，確定0.24 g/mL Nisin和0.24 g/mL山梨酸鉀復(fù)合制劑對尹家雞翅進(jìn)行保鮮試驗，結(jié)果顯示可使雞翅產(chǎn)品貨架期從2 d延長至7 d，且添加山梨酸鉀的雞翅中山梨酸鉀含量均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。本研究為Nisin和山梨酸鉀應(yīng)用于速食禽制品的防腐保鮮提供借鑒與參考。

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Properties of Inhibition of Spoilage Bacteria Using Nisin and Potassium Sorbate Combinations in Yinjia Chicken Wings

SUN Meng-tong1，LIN Yang1，MA Huan-huan1，Lü Xin-ran2，BAI Feng-ling1，*，ZHANG Ping3
（1.College of Food Science and Technology，Bohai University，F(xiàn)ood Safety Key Lab of Liaoning Province，National&Local Joint Engineering Research Center of Storage，Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products，Jinzhou 121013，Liaoning，China；2.College of Biological Science and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；3.Beizhen Gou-Bangzi Food Co.，Ltd.，Jinzhou 121013，Liaoning，China）

Application of Nisin with potassium sorbate complex agent control spoilage bacteria in Yinjia chicken wings.Spoilage bacteria were isolated from the chicken wings using the microbiological method，and the inhibition effect of Nisin with potassium sorbate complex agent on the spoilage bacteria was studied by the oxford cup method.Study on preservation of the product by using the complex agent.Thirty spoilage bacteria strains were isolated from Yinjia chicken wings，and preliminary identification of the majority of Gram-positive bacilli and cocci.Inhibition of the growth of 28 spoilage bacteria by 0.48 g/mL Nisin；Inhibition of the growth of 27 spoilage bacteria by 0.48 g/mL potassium sorbate；0.16 g/mL Nisin with potassium sorbate complex agent had bacteriostatic effect on 30 representative spoilage bacteria.The preservation effect of 0.24 g/mL Nisin with potassium sorbate complex agent on Yinjia chicken wings is better than that other concentration complex agent.The total bacteria count decreased 4 log units and maintained good sensory quality in treatment group than the control during 7 day storage，as well as the content of preservation meet the national standard in Yinjia chicken wings.Addition of 0.24 g/mL of Nisin and 0.24 g/mL of potassium sorbate combination in Yinjia chicken wings can make the shelf life be extended to 7 d.

Nisin；potassium sorbate；complex；inhibition；Yinjia chicken wings；spoilage bacteria

2016-12-11

孫夢桐（1992—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。

*通信作者：白鳳翎（1964—）男，教授，博士，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制和食品微生物學(xué)。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.16.039