中藥消除致病性大腸桿菌耐藥性的研究

韋嬪 譚艾娟 呂世明 王學君

摘要：為了解黃連、金銀花、艾葉、魚腥草和五倍子5種中藥對豬源致病性大腸桿菌的抑菌效果以及對慶大霉素耐藥性的消除情況，采用試管二倍稀釋法測定5種中藥的最小抑菌濃度，通過影印培養(yǎng)法篩選出耐藥性消除菌落并計算其消除率。結果表明，除魚腥草外，黃連、金銀花、艾葉、五倍子表現(xiàn)出明顯的抑菌效果，亞抑菌濃度的黃連、金銀花、艾葉、五倍子作用24 h后對致病性大腸桿菌慶大霉素耐藥性的消除率分別為5.34%、2.67%、10.01%、12.53%；作用 48 h 后其消除率分別為7.27%、3.47%、10.93%、13.68%。黃連、金銀花、艾葉和五倍子能消除致病性大腸桿菌對慶大霉素的耐藥性。

關鍵詞：中藥；致病性大腸桿菌；耐藥性；消除

中圖分類號： S852.61+2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0127-02[HS）][HT9.SS]

致病性大腸桿菌是獸醫(yī)臨床感染中最常見的病原菌之一，每年因其引起的疾病給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。為防治疾病，許多養(yǎng)殖場廣泛且不規(guī)范地使用抗菌藥物，導致細菌的耐藥問題越來越嚴重，最后不得不通過加大用藥劑量、增加藥物種類來治療大腸桿菌病，從而陷入“應用抗菌藥物→耐藥→加大劑量和種類→高度耐藥和多重耐藥→治療無效和殘留增加”的惡性循環(huán)，最終危及養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和人類健康。因此，[JP+1]如何解決細菌耐藥性的問題成為人們關注的焦點，我國中藥資源豐富，已有研究證實許多中藥具有抗菌作用，且可以降低或消除細菌耐藥性[1-2]。因此，本試驗研究黃連、金銀花等5種常見中藥的抑菌效果以及對致病性大腸桿菌耐藥性的消除，旨在篩選出對耐藥致病性大腸桿菌具有強抑菌作用的中藥，為中草藥在臨床上治療由耐藥性致病菌引起的傳染性疾病和進一步進行中藥逆轉[JP]細菌耐藥性研究提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗藥物及試劑

黃連、金銀花、魚腥草、艾葉、五倍子，購于西安海佳生物科技有限公司。卡那霉素（KAN）、慶大霉素（GEN）、氧氟沙星（OFL）、環(huán)丙沙星（CIP）、頭孢唑林（CEF）、四環(huán)素（TET）、地美環(huán)素（DMCT）、磺胺嘧啶（SD），購于大連美侖生物技術有限公司。MH瓊脂、伊紅美蘭瓊脂和LB培養(yǎng)基，均購于上海博微生物科技有限公司；氯化鈉（NaCl），分析純，購于南匯彭德公社營房化工廠；十二烷基硫酸鈉（SDS），分析純，購于廣東順德化學生物研究所。

1.2試驗菌株

采樣于貴州省規(guī)模養(yǎng)豬場共5株，且經(jīng)鑒定的致病性大腸桿菌EC1、EC2、EC3、EC4、EC5，由貴州大學藥理實驗室提供。它們對卡那霉素、慶大霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢唑林、四環(huán)素、地美環(huán)素、磺胺嘧啶8種抗菌藥物的MIC值見表1。大腸桿菌質控菌株ATCC25922，購于中國獸藥監(jiān)察所。

1.3中藥藥液的制備

將黃連、金銀花、魚腥草、艾葉、五倍子5種中藥按劉玉慶等的方法[3]煎煮提取后濃縮藥液，使各藥液中生藥含量均為 1 g/mL，110 ℃滅菌20 min，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4中藥提取液對致病性大腸桿菌MIC值的測定

采用改良的肉湯二倍稀釋法[4-5]測定各中藥藥液對受試菌的最小抑菌濃度（MIC）。取11個滅菌離心管并編號，每管先加入無菌LB肉湯培養(yǎng)基2.0 mL，然后于第1個離心管加中藥提取液2.0 mL，混勻后取出2.0 mL放入第2個離心管中，依次類推作倍比稀釋，直至第9個離心管取出2.0 mL棄去，第10個離心管不加中藥作為無藥物空白對照，第11管不加藥物和菌液做空白對照。取100 μL受試菌稀釋液（菌液濃度為1×106 CFU/mL）分別加至1～10號離心管內，置于 37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后用無菌棉拭子分別蘸取各管內少量肉湯，涂布在LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃再培養(yǎng)18～24 h。以平板上無細菌生長的最低藥物濃度為該種中藥對該菌株的最小抑菌濃度（MIC）。

1.5耐藥性的消除試驗

分別制備含中藥的濃度為1/2 MIC的LB肉湯，再分別加入稀釋好的菌液，37 ℃恒溫培養(yǎng)24、48 h，同設不加藥物的空白組和SDS對照組；然后再轉種分離于LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)待長出單個菌落后，隨機挑取300個菌落，按照影印培養(yǎng)法[6-7]用無菌牙簽分別對應點種含慶大霉素的MH瓊脂平板及不含藥物的MH瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

[HTK]1.6耐藥性消除子的篩選與鑒定[HT]

挑取在含慶大霉素平板上不生長且在不含藥物的平板上生長的菌落，在LB固體培養(yǎng)基上傳代后，再接種于含慶大霉素平板上進行檢測證實，即為消除子。根據(jù)耐藥性消除菌落數(shù)與檢測菌落總數(shù)之比，計算大腸桿菌耐藥性消除率[8]。

2結果與分析

2.1耐藥性的測定結果

在質控菌株ATCC25922對臨床常用的8種抗菌藥物均敏感的情況下，5株致病性大腸桿菌不僅對GEN耐藥，還對KAN、TET、CEF、CIP、OFL、DMCT、SD都呈不同程度的耐藥，致病性大腸桿菌的耐藥情況比較嚴重。

2.3耐藥性消除結果

由表3可知，5種中藥中五倍子對菌株耐藥性的平均消除率最高，作用24 h后，平均消除率為12.53%，其最高消除率可達22.33%；其他中藥的消除率依次是艾葉10.01%、黃連5.34%、金銀花2.67%；五倍子作用48 h后其平均消除率為13.68%，最高消除率可達24.41%，其他中藥的消除率依次是艾葉10.93%、黃連7.27%、金銀花3.47%，4種中藥對致病性大腸桿菌慶大霉素耐藥性的消除率均高于SDS對照組；未經(jīng)藥物處理的空白對照耐藥菌株的耐藥性自發(fā)消除率為0.00，說明細菌耐藥性在短時間內自然丟失的概率極低。

3討論

細菌的耐藥性問題越來越受關注，本試驗選取的5株致病性大腸桿菌對臨床常用的8種抗菌藥物全部耐藥，這與獸醫(yī)[CM（25]臨床大量不合理使用藥物密切相關。我國中藥資源豐富血類中藥，五倍子是斂肺澀腸類中藥。本試驗中，除魚腥草外，其余4種中藥均有較好的抑菌作用。對致病性大腸桿菌中藥最小抑菌濃度的測定結果表明，黃連、金銀花、艾葉和五倍子抑菌效果明顯，但是不同中藥對同1株細菌的最小抑菌濃度不同，抑菌效果也不同，這可能與中藥含有的有效成分不同有關。五倍子、艾葉和黃連對臨床大腸桿菌抑菌效果較強，這與黃玲等所報道的結果[9]一致；金銀花在體外對致病性大腸桿菌有抑菌作用與陳希文等的報道[10]一致，卻與劉榮欣等的報道結果[11]不同；魚腥草在所配制的500 mg/mL濃度下無抑菌作用，這與杜銀忠所報道的結果[12]一致。目前關于中藥體外抑菌作用的研究報道較多，但報道結果之間有差異，產(chǎn)生這種差異可能與中藥的產(chǎn)地、采收季節(jié)、提取方法和試驗用的菌株等不同有關。

耐藥性消除試驗結果顯示，五倍子、艾葉、黃連對臨床致病性大腸桿菌耐藥性具有較高的消除率，金銀花的消除率相對較低，但均高于SDS對照組。不同的中藥對致病性大腸桿菌耐藥性的消除率有很大的差異，五倍子作用48 h后的平均消除率為13.68%，而金銀花為3.47%，這可能是因為不同的中藥含有不同的有效抑菌成分、各個中藥成分具有不同的藥理作用的原因。同種中藥對不同菌株耐藥性消除率也不同，具有較大的波動范圍，黃連作用48 h后對EC1耐藥性的消除率為3.33%，對EC2卻為11.67%，這可能是由于不同的耐藥菌株其對抗菌藥物的耐藥機制不同而引起的差異。對比中藥作用24、48 h致病性大腸桿菌耐藥性消除率的差異可以看出，作用時間直接影響著中藥消除耐藥性的效果，隨著作用時間的延長，其消除率均有所提高，這是由于中藥作用機理比較復雜，中藥所含有的各種成分比較多，作用比較緩慢。陰性對照組的大腸桿菌耐藥性消除率為0.00%，表明耐藥致病性大腸桿菌其耐藥性短時間內自然丟失的概率極低。許多中草藥具有抑菌或抗菌作用，而且不易產(chǎn)生耐藥性，毒副作用小。因此，篩選開發(fā)出抑菌效果好、耐藥性消除率高的中草藥，對于控制細菌耐藥性的傳播與中藥的開發(fā)利用都具有十分重要的意義。但中藥消除細菌耐藥性的機制比較復雜，據(jù)目前報道主要是通過消除耐藥質粒、影響外排泵、影響細胞膜和細胞壁

[HT][FL）]

[KH*4D]

等，具體作用機制還有待進一步研究。

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