HPLC法測(cè)定大鼠血漿中奧拉西坦的濃度

任靜華 劉宏達(dá) 譚顯惠 馮會(huì)英

摘要：目的：建立大鼠血漿中奧拉西坦?jié)舛鹊臋z測(cè)方法。方法：取大鼠18只，禁食不禁水12小時(shí)，分別按200 mg·kg-1的劑量一次性灌胃奧拉西坦溶液，所有大鼠分別于給藥后0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12 h眼內(nèi)眥取血0.5 mL。采用高效液相色譜法檢測(cè)其血藥濃度。色譜條件：色譜柱：Diamonsil RP C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（3.2：96.8，V/V）；流速：0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；內(nèi)標(biāo)：阿昔洛韋。結(jié)果：奧拉西坦保留時(shí)間為3.7 min，內(nèi)標(biāo)阿昔洛韋保留時(shí)間為7.4 min，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0217 X +0.1058（r=0.9992），其檢測(cè)濃度的線性范圍為2～100 μg·mL-1。最低定量限及最低檢測(cè)限分別為0.005μg·mL-1和0.001μg·mL-1。低、中、高三種濃度的方法回收率分別為（102.25±8.51）%，（96.29±2.76）%和（98.14±1.62）%，其RSD值分別為8.32%，2.87%和1.65%；日內(nèi)精密度RSD值分別為13.03%，2.87%和1.65%；日間精密度RSD值分別為12.60%，5.42%和3.72%；奧拉西坦的血漿樣品40℃低溫避光存放5天或反復(fù)凍融3次性質(zhì)穩(wěn)定，血漿樣品處理后放置4 h對(duì)測(cè)定無影響。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，非常適用于測(cè)定大鼠血漿中的奧拉西坦的含量。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；奧拉西坦；血藥濃度；大鼠

奧拉西坦（oxiracetam），又名奧拉酰胺，腦復(fù)智，是一環(huán)GABA類促智藥。研究顯示，奧拉西坦可以改善記憶與智能障礙患者的記憶力和學(xué)習(xí)功能[1]，還能保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，改善大腦物質(zhì)和能量代謝?？捎糜诶夏晷园V呆、多梗死性癡呆和用于神經(jīng)癥、腦外傷、腦炎等引起的腦功能不全、記憶力障礙，為臨床廣泛應(yīng)用的促智藥。

目前已經(jīng)報(bào)道過的血清奧拉西坦?jié)舛鹊臏y(cè)定方法，流動(dòng)相配制大多比較繁瑣，血漿樣品處理復(fù)雜，成本較高[2-16]。本研究擬建立大鼠血漿中奧拉西坦?jié)舛鹊腍PLC測(cè)定方法，為奧拉西坦大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究提供方法學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜系統(tǒng)，包括515泵、486紫外檢測(cè)器、Empower Application 操作平臺(tái)（美國(guó)Waters公司）；Diamonsil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，美國(guó)Waters公司）；冷凍離心機(jī)（GL-20G-Ⅱ，上海安亭科學(xué)儀器廠）；渦旋混合器（XW-80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥

奧拉西坦對(duì)照品（石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司，純度99.60%，批號(hào)128101207）；注射用奧拉西坦（石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司，批號(hào)262120318，規(guī)格1 g）；阿昔洛韋對(duì)照品（湖北易泰藥業(yè)有限公司，批號(hào)20080620 含量100.7%）；乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司，批號(hào)111203）；

1.3 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，清潔級(jí)，體重（300±10）g，由山西省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（晉）2009-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil RP C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（3.2：96.8，V/V）；流速：0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；內(nèi)標(biāo)：阿昔洛韋。

2.2 血漿樣品處理

取冷凍血漿樣品室溫自然解凍，10000 r·min-1離心5 min，取上清液200 μL于帶塞離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液（濃度100 μg·mL-1阿昔洛韋溶液）20 μL混勻，加乙腈300 μL沉淀蛋白，渦旋振蕩1 min，10000 r·min-1離心5 min，取上清液400 μL于離心管中，40 ℃水浴下氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，進(jìn)樣。

2.3溶液的制備

奧拉西坦儲(chǔ)備液的配制：精密稱取奧拉西坦對(duì)照品約200 mg，置于100 mL量瓶中，蒸餾水稀釋定容，制備成濃度為2mg·mL-1的奧拉西坦儲(chǔ)備液，4℃保存待用。

奧拉西坦對(duì)照品溶液的配制：分別精密量取奧拉西坦儲(chǔ)備液12.5 mL，7.5 mL，5 mL，2.5 mL，1.25 mL，0.625 mL，0.25 mL于25 mL量瓶中，蒸餾水定容，得到濃度依次為1000，600，400，200，100，50，20 μg·mL-1的系列奧拉西坦對(duì)照品溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密稱量阿昔洛韋約10 mg于50 mL量瓶中，蒸餾水溶解定容，配制成濃度約為200 μg·mL-1的儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液25 mL于50 mL量瓶中稀釋成濃度為100 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。

奧拉西坦灌胃液的配制：稱取注射用奧拉西坦2.0 g，用蒸餾水溶解，置于50 mL量瓶中，蒸餾水定容，制備成濃度為40 mg·mL-1的奧拉西坦溶液。

2.4專屬性試驗(yàn)

取奧拉西坦對(duì)照品溶液直接進(jìn)樣，另取空白血漿、內(nèi)標(biāo)阿昔洛韋，奧拉西坦血漿樣品分別按“2.2”項(xiàng)下處理并測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，在該色譜條件下，在選定色譜條件下，奧拉西坦峰、內(nèi)標(biāo)峰、血漿內(nèi)源性雜質(zhì)峰均分離良好，奧拉西坦保留時(shí)間為3.7 min，內(nèi)標(biāo)阿昔洛韋保留時(shí)間為7.4 min，結(jié)果見Fig. 1。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取冷凍空白血漿7份，室溫自然解凍，分別精密吸取180 μL，加入系列濃度的奧拉西坦對(duì)照品溶液20 μL混勻，使血漿中奧拉西坦的濃度依次為100，60，40，20，10，5，2 μg·mL-1。按照“2.2 血漿樣品處理”方法處理并測(cè)定。以測(cè)得的奧拉西坦峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）對(duì)血漿藥物濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0217 X +0.1058（r=0.9992），奧拉西坦在2～100 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。。

2.6 最低定量限及最低檢測(cè)限

配制約1μg·mL-1的奧拉西坦對(duì)照品溶液，以倍比稀釋法稀釋后，直接注入色譜儀進(jìn)行測(cè)定，直至S/N≥10，該進(jìn)樣量即為最低定量限，S/N≥3，該進(jìn)樣量為最低檢測(cè)限。該方法的最低定量限及最低檢測(cè)限分別為0.005μg·mL-1和0.001μg·mL-1。

2.7 方法回收率

取空白血漿15份，分為3組，每組5份，分別制備濃度為5 μg·mL-1，20 μg·mL-1，60 μg·mL-1的奧拉西坦模擬血漿樣品，按照“2.2 血漿樣品處理”方法進(jìn)行處理并測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出低、中、高不同濃度的奧拉西坦的模擬血漿樣品的方法回收率分別為（102.25±8.51）%，（96.29±2.76）%和（98.14±1.62）%，其RSD值分別為8.32%，2.87%和1.65%。

2.8 精密度

2.8.1 日內(nèi)精密度

取空白血漿15份，分為3組，每組5份，制備濃度分別為5 μg·mL-1，20 μg·mL-1，60 μg·mL-1的奧拉西坦模擬血漿樣品，按照“2.2 血漿樣品處理”方法在一日內(nèi)進(jìn)行處理并測(cè)定，計(jì)算出日內(nèi)精密度。三種不同濃度的奧拉西坦的模擬血漿樣品的RSD值分別為13.03%，2.87%和1.65%。

2.8.2 日間精密度

取空白血漿15份，分為3組，每組5份，制備濃度分別為5 μg·mL-1，20 μg·mL-1，60 μg·mL-1的奧拉西坦模擬血漿樣品，按照“2.2 血漿樣品處理”方法，連續(xù)5天進(jìn)行處理并測(cè)定，計(jì)算出日間精密度。三種不同濃度的奧拉西坦的模擬血漿樣品的RSD值分別為12.60%，5.42%和3.72%。

2.9 穩(wěn)定性

2.9.1 室溫放置穩(wěn)定性

取空白血漿5份，制備濃度為20 μg·mL-1的奧拉西坦模擬血漿樣品，按照“2.2 血漿樣品處理”方法進(jìn)行處理后，分別于0，1，2，3，4 h進(jìn)行測(cè)定。處理血漿樣品放置4 h的RSD值為1.09%，改實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)測(cè)定無影響。

2.9.2低溫保存穩(wěn)定性

取空白血漿6份，分為2組，每組3份，制備成濃度為20 μg·mL-1的奧拉西坦模擬血漿樣品。其中一組按照“2.2 血漿樣品處理”方法即刻進(jìn)行處理并測(cè)定；另一組-40℃低溫避光存放5天后按照“2.2 血漿樣品處理”方法進(jìn)行處理并測(cè)定。其RSD值分別為1.72%和2.62%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明奧拉西坦的血漿樣品在低溫存放5天不影響測(cè)定結(jié)果。

2.9.3 反復(fù)凍融穩(wěn)定性

取空白血漿6份，分為2組，每組3份，制備成濃度為20 μg·mL-1的奧拉西坦模擬血漿樣品。其中一組按照按照“2.2 血漿樣品處理”方法即刻進(jìn)行處理并測(cè)定；另一組反復(fù)凍融3次后按照“2.2 血漿樣品處理”方法進(jìn)行處理并測(cè)定，其RSD值分別為0.58%和1.03%，結(jié)果表明奧拉西坦的血漿樣品經(jīng)過反復(fù)凍融不影響測(cè)定結(jié)果。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇：奧拉西坦在有機(jī)溶劑中分配系數(shù)很小，而在水中溶解性良好。進(jìn)行反相HPLC分析時(shí)，最常采用甲醇作為流動(dòng)相的主要組分。但它的紫外切點(diǎn)為205 nm，測(cè)定奧拉西坦時(shí)采用210 nm與之接近，故不宜以甲醇作為流動(dòng)相，而選用乙腈作為流動(dòng)相。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)資料，調(diào)整流動(dòng)相的比例，最終采用乙腈：水=3.2：96.8作為流動(dòng)相，在該條件下，不僅能使奧拉西坦與血漿內(nèi)源性物質(zhì)有較好的分離，而且使奧拉西坦與內(nèi)標(biāo)均在10 min內(nèi)出峰，縮短分析時(shí)間。

3.2 奧拉西坦消除半衰期約3個(gè)小時(shí)，約3小時(shí)達(dá)峰，整個(gè)采樣時(shí)間至少應(yīng)持續(xù)到3～5個(gè)半衰期，或持續(xù)到血藥濃度為Cmax的1/10～1/20，因此設(shè)定采血時(shí)間分別為0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12 h，并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該取血時(shí)間能夠反映出奧拉西坦在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，并且大鼠的有較好的耐受性，能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。

3.3 本實(shí)驗(yàn)從臨床藥物檢測(cè)角度研究建立高效液相色譜法測(cè)定奧拉西坦在大鼠體內(nèi)的分布濃度，通過對(duì)大鼠體內(nèi)不同劑量給藥和檢測(cè)給藥后不同時(shí)間藥物的分布情況，取得了大量科學(xué)數(shù)據(jù)。為該藥的研究建立了簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的科學(xué)分析方法。

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