梁華峰， 謝 靖， 申 婧， 田 鳳， 耿玉榮， 唐 娟， 劉春紅， 張惠麗

次烏頭堿對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)功能與血清中t-PA，PAI-I含量水平的影響

梁華峰， 謝 靖， 申 婧， 田 鳳， 耿玉榮， 唐 娟， 劉春紅， 張惠麗

目的 通過(guò)建立腦梗死大鼠模型，探討次烏頭堿對(duì)神經(jīng)功能與腦梗死大鼠血清中t-PA，PAI-I含量水平的影響。方法 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)，腦梗死組(CI)，次烏頭堿低劑量組(HA-L)、中劑量組(HA-M)和高劑量組(HA-H)，采用線栓法建立大鼠腦動(dòng)脈閉塞模型，建模成功后，次烏頭堿低劑量組、中劑量組和高劑量組分別給予次烏頭堿灌胃0.25 mg/kg，0.75 mg/kg與2.25 mg/kg，每天1次，共給藥3 d。給藥完成后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，ELISA檢測(cè)血清中組織型纖溶酶原激活物(t-PA)和纖溶酶原激活抑制物(PAI-I)的含量水平，TTC染色檢測(cè)腦梗死體積，免疫印跡法檢測(cè)ICAM-1與VCAM-1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與腦梗死組相比，采用次烏頭堿給藥后，腦梗死大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低，血清中t-PA與PAI-I的含量水平明顯下降，腦梗死面積降低，腦組織中ICAM-1與VCAM-1蛋白表達(dá)明顯下降。結(jié)論 次烏頭堿能夠改善腦梗死大鼠的神經(jīng)功能缺損狀態(tài)，可能與其影響纖溶系統(tǒng)以及ICAM-1與VCAM-1因子表達(dá)有關(guān)。

次烏頭堿； 腦梗死； 纖溶酶原； ICAM-1； VCAM-1

急性腦梗死是導(dǎo)致人類(lèi)致殘與死亡的主要疾病之一。大量研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，多種因素參與其中。目前的治療方法主要是采用回復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)，改善局部的血液循壞，以達(dá)到在一定程度上恢復(fù)大腦功能[1]，但在臨床上并未取得十分顯著的成效。次烏頭堿(Hypaconitine，HA)是附子的主要成分之一，主要為二萜類(lèi)雙酯型生物堿[2]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，附子具有強(qiáng)心、抗心律失常、鎮(zhèn)痛以及抗腫瘤等作用，臨床上，常用附子來(lái)治療急性心肌梗死引起的休克、冠心病等，但由于附子的毒性極強(qiáng)，需要經(jīng)過(guò)炮制后才可使用。次烏頭堿是附子所含的二萜類(lèi)雙酯型生物堿中毒性最弱者。目前關(guān)于次烏頭堿的研究較少，有研究表明次烏頭堿通過(guò)抑制鈣調(diào)控蛋白的表達(dá)和縫隙連接蛋白的磷酸化水平來(lái)影響心機(jī)收縮功能與節(jié)律變化[3]。我們通過(guò)建立腦梗死大鼠模型，觀察次烏頭堿對(duì)腦梗死大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠50只，雄性，SPF級(jí)，體重180～220 g，購(gòu)于南京君科生物有限公司，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 試驗(yàn)試劑 次烏頭堿購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所，t-PA與PAI-I的ELISA試劑盒購(gòu)自南京金益柏生物科技有限公司，ICAM-1與VCAM-1抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，β-actin的抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 按照數(shù)字隨機(jī)法將大鼠分為假手術(shù)組(Sham)，腦梗死組(CI)，次烏頭堿低劑量組(HA-L)、中劑量組(HA-M)和高劑量組(HA-H)，每組小鼠各10只，分籠飼養(yǎng)，造模成功后，烏頭堿低劑量組、中劑量組和高劑量組分別給予次烏頭堿灌胃0.25 mg/kg，0.75 mg/kg與2.25 mg/kg，每天一次，共給藥7 d，灌胃前現(xiàn)配置次烏頭堿混懸液。假手術(shù)組給予等量的生理鹽水灌胃。

1.4 腦梗死大鼠模型的建立 采用線栓法建立大鼠腦動(dòng)脈閉塞模型，造模成功標(biāo)準(zhǔn)，參照Longa[4]進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損癥狀0分，活動(dòng)正常1分，對(duì)側(cè)前肢不能完全伸展2分，爬行時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈2分，行走時(shí)身體向偏癱側(cè)傾3分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失4分。選取評(píng)分為1～3分的大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.5 取材 給藥完成后，腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠，一部分快速開(kāi)胸，曝露心臟，心尖處剪開(kāi)一小口，插管至升主動(dòng)脈，快速滴注150 ml生理鹽水，然后用4 ℃的4%多聚甲醛400 ml灌注，持續(xù)1 h后，取腦，腦組織用4%多聚甲醛4 ℃固定2～4 h后，移入30%蔗糖液，置于冰凍切片機(jī)，連續(xù)切片，片厚20 μm。另一部分，取腦組織，迅速置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 TTC染色檢測(cè)腦梗死體積 給藥完成后，麻醉大鼠后斷頭處死，取出完整腦組織，均勻切成5片冠狀切片，分別將腦片進(jìn)入2%TTC溶液中，37 ℃孵育15 min，然后取出置于4%多聚甲醛固定24 h，觀察腦梗死體積，紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織，蒼白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)。

1.7 ELISA法檢測(cè)t-PA，PAI-I含量水平 給藥完成后，眶靜脈采抗凝血，3000 r/min離心，取上層血清，采用商業(yè)t-PA，PAI-I的ELISA試劑盒檢測(cè)血清中t-PA，PAI-I的含量水平。

1.8 免疫印跡法 取出腦組織，在冰上剪碎勻漿，加入全細(xì)胞裂解液(RIPA)，冰浴中勻漿5 min，將勻漿液置于預(yù)冷的離心管中，冰上渦旋，4 ℃15000 r/min離心30 min，取上清液，進(jìn)行蛋白定量，將樣品和緩沖液等體積混合上樣，進(jìn)行電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)膜，加入封閉液進(jìn)行封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加入對(duì)應(yīng)的二抗，37 ℃孵育1 h，將膜取出后置于ECL試劑盒中反應(yīng)約1 min，然后放入凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行曝光拍照，采用數(shù)字圖像分析軟件對(duì)目的條帶和內(nèi)參條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 除腦梗死組大鼠有一只造模后死亡，其他大鼠均存活。假手術(shù)組大鼠并無(wú)神經(jīng)功能缺損的癥狀表現(xiàn)，腦梗死組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)，采用次烏頭堿給藥的大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯低于腦梗死組，如表1所示。

2.2 各組大鼠血清中t-PA，PAI-I含量水平的變化 與假手術(shù)組相比，腦梗死組大鼠血清中t-PA的含量顯著升高(P<0.05)；與腦梗死組相比，采用次烏頭堿給藥后，大鼠血清中中t-PA的含量下降(P<0.05)，并隨劑量增大而逐漸下降；與假手術(shù)組相比，腦梗死組大鼠血清中 PAI-I的含量明顯升高(P<0.05)；與腦梗死組相比，采用次烏頭堿給藥后，大鼠血清中PAI-I含量水平明顯下降，并隨劑量增大而下降(見(jiàn)表2)。

2.3 各組大鼠腦梗死體積 假手術(shù)組大鼠腦組織染色表現(xiàn)為均勻的紅色，腦梗死組大鼠腦組織染色出現(xiàn)大范圍的蒼白色梗死區(qū)，采用次烏頭堿處理后，大鼠腦組織中蒼白色的梗死區(qū)面積縮小(見(jiàn)表1)。

2.4 腦組織中ICAM-1與VCAM-1蛋白表達(dá)水平的變化 與假手術(shù)組相比，腦梗死組大鼠腦組織中的ICAM-1與VCAM-1的蛋白表達(dá)水平顯著上升；與腦梗死組相比，采用次烏頭堿給藥后，低劑量組大鼠腦組織中ICAM-1與VCAM-1的蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，中劑量組與高劑量組均出現(xiàn)明顯下降(見(jiàn)圖2)。

表1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分±s)

與Sham組相比*P<0.05；與CI組相比#P<0.05

表2 次烏頭堿對(duì)大鼠血清中t-PA，PAI-I含量 水平的影響

與Sham組相比*P<0.05；與CI組相比#P<0.05

圖1 各組大鼠腦梗死體積的對(duì)比

與Sham相比*P<0.05；與CI組相比#P<0.05

3 討 論

人體的纖溶系統(tǒng)主要是由纖溶酶原、纖溶酶、纖溶原激活劑(plasminogen activator，PA)和纖溶酶原抑制劑(plasminogen activator inhibitor，PAI)組成，然而纖溶酶的轉(zhuǎn)化主要是依賴(lài)血漿中游離的組織型纖溶酶原激活物(t-PA)和纖溶酶原激活抑制物(PAI-1)的活性[5]。其中組織型纖溶酶原激活物又稱(chēng)為內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物，主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞生成與分泌的，具有激活纖溶酶原轉(zhuǎn)化成纖溶酶的作用，繼而激活整個(gè)纖溶系統(tǒng)，因此t-PA在血液中的含量可反映纖溶系統(tǒng)的功能[6]。纖溶酶原激活抑制劑-1通過(guò)與t-PA以1∶1形成分子復(fù)合物，從而使t-PA失活而發(fā)揮作用，在正常生理狀態(tài)下，血液中的t-PA與PAI-I處于動(dòng)態(tài)平衡。成年大鼠大腦中的多個(gè)部位均有t-PA和PAI-I的表達(dá)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死大鼠血液中t-PA的含量顯著上升，推測(cè)是由于腦梗死急性期纖溶酶原被激活，從而啟動(dòng)纖溶系統(tǒng)，PAI-I含量上升，但幅度明顯小于t-PA，提示腦梗死大鼠的凝血功能與纖溶功能均被激活。而采用次烏頭堿給藥后，能夠緩解t-PA與PAI-I的下降，促進(jìn)二者回到平衡狀態(tài)，從而維持纖溶系統(tǒng)的正常穩(wěn)態(tài)。但目前國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)研究結(jié)果不盡相同，國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)腦梗死患者血漿中t-PA含量水平在急性期降低，恢復(fù)期升高[8]，推測(cè)是由于腦梗死急性期中t-PA被大量消耗。而本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與Hemandez等[9]發(fā)現(xiàn)腦梗死患者t-PA與PAI-1含量均顯著上升一致。

細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)是免疫球蛋白超家族的一員，分布廣泛，炎癥介質(zhì)能夠上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞與其他非造血細(xì)胞ICAM-1與VCAM-1的表達(dá)[10]。研究發(fā)現(xiàn)線栓法建立的小鼠腦動(dòng)脈栓塞模型試驗(yàn)中，在缺血中心區(qū)與半暗帶區(qū)均可觀察到ICAM-1的陽(yáng)性表達(dá)，并從缺血中心區(qū)向周邊逐漸增加[11]。本實(shí)驗(yàn)中觀察到腦梗死大鼠的腦組織中ICAM-1與VCAM-1的蛋白表達(dá)均顯著升高，與前人研究結(jié)果相似，采用次烏頭堿給藥后，大鼠腦組織中的ICAM-1與VCAM-1蛋白表達(dá)明顯下降，推斷次烏頭堿具有降低腦梗死腦組織中ICAM-1與VCAM-1的表達(dá)，可能對(duì)阻斷炎癥的級(jí)聯(lián)反映與腦組織的損傷具有重要的作用。綜上所述，次烏頭堿能改善腦梗死大鼠的神經(jīng)功能缺損狀態(tài)為次烏頭堿用于輔助治療腦梗死患者提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects ofHypaconitine on neurological function，and t-PA and PAI-I levels in serum in cerebral infarction rats

LIANGHuafeng，XIEJing，SHENJing，etal.

(DepartmentofNeurology，TheFirstAffiliatedHospitaloftheMedicalCollege，ShiheziUniversity，Shihezi832000，China)

Objective Ctive：To investigate the effects of Hypaconitine (HA) on neurological function，and t-PA and PAI-I levels in serum in cerebral infarction rats. Methods Rats were randomly divided into the following groups：sham group，cerebral infarction (CI) group，low dose treatment (HA-L) group，media dose treatment (HA-M) group and high dose treatment (HA-H) group. After establishment of cerebral infarction model，rats were

with 0.25 mg/kg，0.75 mg/kg or 2.25 mg/kg of HA by gavage once a day for 3 days. The impairment of neurological function was scored，the levels of t-PA and PAI-I were measured with ELISA，the cerebral infarction volume was analyzed by TTC staining，and ICAM-1 and VCAM-1 protein expression were determined by Western blotting. Results Compared with CI group，HA treatment significantly improved neurological function and decreased the levels of t-PA and PAI-I in serum. Moreover，HA treatment also reduced the cerebral infarction volume and protein expression of ICAM-1 and VCAM-1.Conclusion HA can protect against neurological function impairment in cerebral infarction rats via inhibition of t-PA and PAI-I levels and ICAM-1 and VCAM-1 expressions.

Hypaconitine； Cerebral infarction； Plasminogen； ICAM-1； VCAM-1

1003-2754(2017)07-0625-03

2017-03-10；

2017-06-20

(新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，新疆 石河子 832000) 通訊作者：梁華峰，E-mail：xiehuafengmed@126.com

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