楊 潔,楊承祖,宋延平,姜姍姍

陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003 )

·實(shí)驗(yàn)研究·

扶脾化瘤飲對人胃癌裸鼠移植瘤生長及TNF、NK活性的影響*

楊 潔,楊承祖,宋延平,姜姍姍

陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003 )

目的：觀察中藥復(fù)方扶脾化瘤飲對荷人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤生長及對荷瘤裸鼠TNF、NK活性的影響。方法：建立人胃癌SGC-7901細(xì)胞BALB/C裸小鼠皮下移植瘤模型，隨機(jī)分為5組，每組8只。荷瘤對照組予純凈水灌胃，扶脾化瘤飲大、中、小劑量組予扶脾化瘤飲煎劑灌胃，20ml/kg，1次/d；陽性對照組予環(huán)磷酰胺灌胃，20mg/kg，1次/d。觀察各組裸鼠移植瘤生長情況，采用L929細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)檢測TNF活性及NK細(xì)胞活性。結(jié)果：扶脾化瘤飲大、中劑量對荷人胃癌SGC-7901裸鼠具有顯著的抑瘤作用，抑瘤率為44.46%、35.79%(P<0.01,P<0.05)，同時能顯著促進(jìn)產(chǎn)生TNF，細(xì)胞毒指數(shù)分別為55.53%、52.52%(P<0.01)；扶脾化瘤飲大劑量對脾臟NK細(xì)胞活性也有提高作用，細(xì)胞殺傷率為30.59%(P<0.05)。結(jié)論：扶脾化瘤飲可以抑制人胃癌SGC-7901的生長，且能拮抗荷瘤所致的免疫功能的抑制。

扶脾化瘤飲是治療中晚期胃癌及轉(zhuǎn)移性胃癌的經(jīng)驗(yàn)用方，臨床療效確切，臨床也用于放療、化療的輔助治療[1]。為研究其抗腫瘤作用及免疫學(xué)方面可能的機(jī)制，我們觀察了該方對荷人胃癌SGC-7901裸鼠移植瘤生長及對腫瘤壞死因子TNF及脾臟NK細(xì)胞活性的影響。

材料與方法

1 動物和瘤株 BALB/C裸鼠，SPF級，4～6周齡，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量許可證號：SCXK(湘)2009-0004；人胃癌SGC-7901細(xì)胞株，從解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心購入。

2 試 藥 扶脾化瘤飲，由陜西省中醫(yī)醫(yī)院藥劑科生產(chǎn)，批號1210801；陽性藥環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：12080321。

3 試驗(yàn)條件 室溫22～28℃，相對濕度40～60%，空調(diào)調(diào)溫，排氣扇通風(fēng)換氣每天2次，每次1 h。試驗(yàn)小鼠雌雄分籠喂養(yǎng)，水(純凈水)、標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料自由攝取。鼠舍保持整潔衛(wèi)生。光/暗時間為12/12 h。

4 儀 器 電子天平，型號：BS210S，精確度：0.1 mg，北京賽多利斯天平廠；普通光學(xué)顯微鏡，日本olympus；SW-CJ-IF型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀，美國伯樂(Bio-Rad)；CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國SHELDON公司。

5 腫瘤動物模型制作 細(xì)胞培養(yǎng)及接種[2-3]：將人胃癌細(xì)胞株SGC-7901在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后用胰酶消化，收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)至1×107個細(xì)胞/ml。取3只BALB/C無胸腺裸鼠，以0.2 ml/只的劑量將瘤液接種于背部。待裸鼠背部腫瘤長至體積約為1000 mm3時進(jìn)行移植。

腫瘤移植：脫頸椎處死裸鼠，消毒后將背部皮膚切開，取出腫瘤，置于放入少許細(xì)胞培養(yǎng)液的無菌平皿內(nèi)，清除外周血管及結(jié)締組織后切成小塊，用無菌玻璃勻漿器進(jìn)行研磨，磨勻后放入無菌容器內(nèi)，加生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個細(xì)胞/ml。取40只BALB/C無胸腺裸鼠，以0.2 ml/只劑量分別接種于裸鼠右前肢腋窩皮下。接種過程須在30 min內(nèi)完成。

6 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 待荷瘤裸鼠的瘤塊體積長至約100～300 mm3后，將其隨機(jī)分為五組: 荷瘤對照組、陽性對照組、扶脾化瘤飲大、中、小劑量組，每組8只。荷瘤對照組灌胃純水，陽性對照組灌胃環(huán)磷酰胺(20 mg/kg)，扶脾化瘤飲大、中、小劑量分別灌胃劑量為6.0 g/kg、3.0 g/kg、1.5 g/kg。各組灌胃體積均為20 ml/kg，接種次日起每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d。

7 觀察指標(biāo)

7.1 腫瘤抑制率:末次給藥1 h后，稱重、脫頸椎處死裸鼠，剝離瘤塊稱重，按公式計(jì)算抑瘤率：腫瘤抑制率=[(模型對照組瘤重-給藥組瘤重)/模型對照組瘤重]×100%。

7.2 腫瘤壞死因子(TNF)活性測定[2-3]:末次給藥1 h后，稱重、脫頸椎處死裸鼠，摘取并研磨脾臟，裂解紅細(xì)胞，將離心得到的淋巴細(xì)胞沖洗1次，離心，用培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為5×106/ml，即為脾細(xì)胞備用液。用培養(yǎng)液將部分備用液細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml，接種于24孔培養(yǎng)板，500 μl/孔，再加入5 μg/ml的ConA，500 μl/孔，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，吸出細(xì)胞培養(yǎng)上清，1500 r/min離心15 min，取上清液備用。

將生長良好的靶細(xì)胞L929經(jīng)胰酶消化后，用培養(yǎng)液配制成4×105/ml的濃度，接種于96孔培養(yǎng)板。每只小鼠脾細(xì)胞懸液均設(shè)5復(fù)孔，加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各100 μl，另設(shè)1孔為效應(yīng)細(xì)胞對照，加入效應(yīng)細(xì)胞和RPMI-1640(含10%小牛血清)各100 μl。于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h后，吸去上清液100 μl，加入MTT(1 mg/ml)試液 100 μl，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h后，2000 r/min離心5 min，吸棄上清液，每孔加DMSO 100 μl，作用30 min，用酶標(biāo)儀測570 nm處的OD值。按公式計(jì)算TNF 細(xì)胞毒指數(shù)。TNF 細(xì)胞毒指數(shù)=[(靶細(xì)胞OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/ 靶細(xì)胞OD值]×100%。

7.3 NK細(xì)胞活性測定[2-3]:將制備的脾細(xì)胞備用液濃度調(diào)為3.0×106/ml，靶細(xì)胞L929濃度調(diào)為1.2×105/ml，兩種細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板。每只小鼠脾細(xì)胞懸液均設(shè)5復(fù)孔，加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各100 μl，另設(shè)1孔為效應(yīng)細(xì)胞對照，加入效應(yīng)細(xì)胞和RPMI-1640(含10%小牛血清)各100 μl。同時設(shè)靶細(xì)胞對照，加入靶細(xì)胞和RPMI-1640各100 μl。于37 ℃、 5%CO2條件下殺傷20 h后，棄上清，每孔加入MTT(5 mg/ml)試液10 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清，每孔加入DMSO 100 μl，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測定570 nm處OD值，按公式計(jì)算NK細(xì)胞殺傷率。NK細(xì)胞殺傷率=[(靶細(xì)胞OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/ 靶細(xì)胞OD值]×100%。

結(jié) 果

1 體內(nèi)抑瘤作用 扶脾化瘤飲6.0 g/kg、3.0 g/kg劑量能明顯抑制荷人胃癌SGC-7901裸鼠瘤體的生長(P<0.01，P<0.05)，抑瘤率分別達(dá)到44.46%、35.79%；陽性藥環(huán)磷酰胺平均抑瘤為71.35%。提示扶脾化瘤飲對荷人胃癌SGC-7901裸鼠腫瘤生長具有明顯的抑制作用,見表1。

表1 扶脾化瘤飲對荷人胃癌SGC-7901裸鼠腫瘤生長的影響

注：與荷瘤對照組相比,*P<0.05 ； △P<0.01

2 TNF活性測定結(jié)果 扶脾化瘤飲6.0g/kg、3.0g/kg與荷瘤對照組比較TNF明顯升高 (P<0.01)，環(huán)磷酰胺組與荷瘤對照組比較，具有降低TNF活性的作用。提示扶脾化瘤飲具有增強(qiáng)小鼠脾臟TNF活性的作用,見表2。

表2 扶脾化瘤飲對荷胃癌SGC-7901裸鼠TNF活性的影響

注：與荷瘤對照組相比,△P<0.05

3 NK細(xì)胞活性測定結(jié)果 扶脾化瘤飲6.0g/kg與荷瘤對照組比較NK明顯升高(P<0.05)，環(huán)磷酰胺組與荷瘤對照組比較NK有所降低。提示扶脾化瘤飲具有增強(qiáng)NK細(xì)胞活性作用,見表3。

表3 扶脾化瘤飲對荷胃癌SGC-7901裸鼠NK細(xì)胞活性的影響

注：與荷瘤對照組相比,*P<0.05

討 論

腫瘤患者多處于免疫抑制狀態(tài)，免疫調(diào)節(jié)功能水平顯著低下。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后和患者的免疫狀態(tài)關(guān)系十分密切，加之手術(shù)、放化療等常規(guī)治療使免疫功能受損愈加嚴(yán)重，骨髓抑制影響療效。近年來中醫(yī)藥治療胃癌研究取得一定進(jìn)展，在西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)上配合中醫(yī)藥治療能有效提高患者生存期，抑制瘤體生長及提高免疫功能[4-6]。扶脾化瘤飲以益氣健脾、化痰散結(jié)為法，全方重用炙黃芪、黨參、炒白術(shù)、半夏、枳殼、厚樸等藥材，主治由脾氣虛弱、濕滯中焦、痰瘀互結(jié)所致的胃癌。與單純西醫(yī)常規(guī)治療相比，本方能有效提高患者生存期及生活質(zhì)量、提高機(jī)體免疫功能、改善臨床癥狀[1]。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方還具有抑制S180瘤體生長，明顯改善術(shù)后及放化療患者臨床癥狀，提高外周血白細(xì)胞減少情況的療效[7]。

本實(shí)驗(yàn)采用人胃癌SGC-7901裸鼠皮下移植瘤模型動態(tài)觀察扶脾化瘤飲對胃癌腫瘤生長的影響，結(jié)果顯示經(jīng)扶脾化瘤飲作用后，SGC-7901胃癌生長受到明顯抑制，與對照組比較具有明顯差異，提示益氣健脾、化痰散結(jié)中藥制劑扶脾化瘤飲可以有效抑制胃癌生長。L929細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)檢測TNF活性及NK細(xì)胞活性結(jié)果顯示：扶脾化瘤飲能顯著促進(jìn)產(chǎn)生TNF,同時對脾臟NK活性也有提高作用，能拮抗荷瘤所致的免疫功能的抑制，推測扶脾化瘤飲通過激活體內(nèi)巨噬細(xì)胞，釋放出細(xì)胞因子而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的功效。

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(收稿：2017-03-15)

Effect of Fupi Hualiu decoction on subcutaneously implanted human gastric cancer in nude mice

Yang Jie，Yang Chengzu，Song Yanping，et al

Shannxi Academy of Traditional Chinese Medicine (Xi’an 710003 )

Objective: To investigate the effects of Fupi Hualiu decoction，a Chinese herbal formula，on tumor growth and the activity of TNF and NK． Methods: Forty BALB/C nude mice transplanted with SGC-7901 cells were randomly divided into five groups(8 mice per group)，and intragastric administered with normal saline or Fupi Hualiu decoction(20ml/kg)，or cyclophosphamide(20mg/kg) daily．Tumor volume were observed．Activity of TNF、NK were detected by L929 cell killing test． Results: Fupi Hualiu decoction of high and media groups had obvious inhibition to the tumor volume compared with controls,the tumor inhibition rate was 44.46%(P<0.01) and 35.79%(P<0.05).The production of TNF in mice bearing tumor was also enhanced significantly,Fupi Hualiu at the dose as above had cytotoxicity index of 55.53%、52.52%(P<0.01).The activity of NK cell could be increased by Fupi Hualiu at high dose,the killing ratio was 30.59%(P<0.05). Conclusion: Fupi Hualiu decoction has inhibitory effects on tumor growth in SGC-7901 gastric carcinoma，and has antagonism action to the immunosuppressive caused by tumor.

Stomach neoplasms/traditional Chinese medicine therapy @Fupi Hualiu decoction Tumor necrosis factors Mice,nude

*陜西省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2010K14-03-12)

胃腫瘤/中醫(yī)藥療法 @扶脾化瘤飲 腫瘤壞死因子 小鼠,裸

R735.2

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.08.074