景丹丹, 龔一富, 張 燕, 俞 凱, 黎 明, 王日昕

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

鉛暴露對(duì)大彈涂魚(yú)(Boleophthalmuspectinirostris)組織形態(tài)的影響

景丹丹, 龔一富, 張 燕, 俞 凱, 黎 明, 王日昕

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

為了研究環(huán)境中鉛離子(Pb2+)對(duì)大彈涂魚(yú)肝、腸和脾組織結(jié)構(gòu)的損傷，實(shí)驗(yàn)挑選體質(zhì)量(21.80±2.70)g的健康大彈涂魚(yú)96尾，分為4組，高劑量Pb2+處理組(2 mg/L)、中劑量Pb2+處理組(1 mg/L)、低劑量Pb2+處理組(0.5 mg/L)和空白組，進(jìn)行毒性試驗(yàn)，分別于第12 h、48 h和96 h取樣，對(duì)各組織器官進(jìn)行組織切片分析。結(jié)果表明：隨著Pb2+濃度的升高及處理時(shí)間的延長(zhǎng)，肝組織出現(xiàn)組織水腫，部分細(xì)胞質(zhì)空泡化、細(xì)胞核固縮；腸組織上皮細(xì)胞受損，杯狀細(xì)胞明顯增多；脾中淋巴細(xì)胞增多。研究表明，Pb2+暴露對(duì)大彈涂魚(yú)肝、腸及脾組織結(jié)構(gòu)均會(huì)造成傷害。

鉛；大彈涂魚(yú)；毒性機(jī)制；生物富集；組織結(jié)構(gòu)

近年來(lái)，隨著工業(yè)廢水的排放、化肥農(nóng)藥的施用，水體重金屬污染現(xiàn)象日益嚴(yán)重。鉛(Pb)是一種廣泛存在于自然界中的重金屬元素。在水域生態(tài)系統(tǒng)中，鉛可通過(guò)生物富集作用逐級(jí)放大，尤其對(duì)處于食物鏈頂部的魚(yú)類來(lái)說(shuō)危害較大。哺乳動(dòng)物鉛中毒機(jī)制研究已較為深入：Pb能夠與Ca2+競(jìng)爭(zhēng)受體，影響細(xì)胞內(nèi)第二信使的活性，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[1]；干擾即刻早期基因(IEG)表達(dá)，影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[2]；誘導(dǎo)視桿細(xì)胞凋亡，影響線粒體功能[3]；過(guò)度激活自由基(ROS)，造成氧化損傷[4]。吳晨等[5]發(fā)現(xiàn)在醋酸鉛灌胃誘導(dǎo)下小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，細(xì)胞核體積縮小，染色質(zhì)濃縮，線粒體腫脹，并出現(xiàn)空泡及線粒體的崩解。Pb在水生生物體內(nèi)具有很強(qiáng)的蓄積性，在污染后不易被監(jiān)測(cè)且難降解，不僅對(duì)水生生物系統(tǒng)構(gòu)成危害，還可通過(guò)食物鏈對(duì)人類健康造成威脅[6]。

大彈涂魚(yú)(Boleophthalmuspectinirostris)在分類上屬于鱸形目、蝦虎魚(yú)亞目、彈涂魚(yú)科、大彈涂魚(yú)屬，為暖水廣溫廣鹽性兩棲經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，主要分布于近海及灘涂上[7]。大彈涂魚(yú)對(duì)多種環(huán)境污染物敏感，是良好的環(huán)境污染指示者，在近岸養(yǎng)殖水體監(jiān)測(cè)方面能夠起到重要作用[8]。目前，魚(yú)類消化道組織學(xué)研究較多[9-13]，但重金屬脅迫對(duì)魚(yú)類組織學(xué)的研究較少。隨著鉛污染日益嚴(yán)重，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注鉛對(duì)魚(yú)類的組織結(jié)構(gòu)損傷。戴偉等[14]研究發(fā)現(xiàn)，飼料鉛暴露誘導(dǎo)羅非魚(yú)，致使肝細(xì)胞發(fā)生顆粒性樣變、水樣變和脂肪樣變，同時(shí)胰腺細(xì)胞內(nèi)酶原顆粒減少，發(fā)生炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

本文對(duì)不同鉛濃度不同暴露時(shí)間下大彈涂魚(yú)的肝、腸和脾的形態(tài)組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，旨在通過(guò)組織學(xué)的研究探討鉛對(duì)魚(yú)類組織器官造成的損害程度，為有效評(píng)價(jià)鉛對(duì)生物的危險(xiǎn)性和對(duì)機(jī)體可能產(chǎn)生的損傷作用提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用大彈涂魚(yú)購(gòu)自浙江寧波，體重(21.80±2.70)g。大彈涂魚(yú)在寧波大學(xué)校內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)72 h后，選取大小均勻、性別為雄性、表皮無(wú)損傷、健康的大彈涂魚(yú)進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)。所用海水為購(gòu)買(mǎi)的清潔海水。

1.2 方法

1.2.1 鉛處理

將醋酸鉛配置成一定質(zhì)量濃度的母液，實(shí)驗(yàn)前將母液用清潔海水稀釋至指定質(zhì)量濃度。將大彈涂魚(yú)隨機(jī)分配到12個(gè)10 L塑料養(yǎng)殖桶中，每桶8尾。實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置0(對(duì)照)、0.5、1和2 mg/L Pb2+處理組(每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù))，脅迫周期為96 h。養(yǎng)殖過(guò)程中，每天更換相同Pb2+濃度的海水，水溫20℃～25℃，鹽度12‰，保持自然光照。

1.2.2 取樣

在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的12、48和96 h，從各處理組隨機(jī)取魚(yú)，每次每桶取3尾，冰浴麻醉后解剖獲得肝、腸和脾，用生理鹽水洗凈，放入10%福爾馬林中固定48 h。

1.2.3 組織石蠟包埋與切片

取固定了48 h的大彈涂魚(yú)各組織，分別配置70%、80%、90%、95%和100%的梯度酒精進(jìn)行脫水處理，二甲苯透明。

在組織包埋機(jī)中，石蠟溫度為65℃，二甲苯∶石蠟(1∶1)浸透組織，再用石蠟浸蠟2次。包埋，切片厚度為6 μm。用毛筆將蠟片放到載玻片上，蛋白甘油黏附。55℃蒸餾水中展片，60℃烘箱1 h進(jìn)行干片。

1.2.4 染色

將烘干后的蠟片用蘇木精和伊紅等試劑進(jìn)行染色，樹(shù)脂封片，在Olympus BX-51顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度鉛暴露對(duì)大彈涂魚(yú)肝結(jié)構(gòu)的影響

鉛暴露對(duì)大彈涂魚(yú)肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響如圖1所示，對(duì)照組(A-1、A-2、A-3)中肝細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，清晰可見(jiàn)，細(xì)胞呈多邊形，相鄰細(xì)胞分界明顯，肝細(xì)胞單層排列形成肝板?？梢?jiàn)管腔較大、管壁薄的小葉間靜脈(A-2)；0.5 mg/L Pb2+處理96 h后，肝組織開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞空質(zhì)化，即細(xì)胞膜受損，細(xì)胞核裸露現(xiàn)象明顯(B-3)；在高濃度鉛(1和2 mg/L)處理后，開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞核縮小，甚至消失的現(xiàn)象(C-3、D-1、D-2、D-3)。

圖1 鉛暴露對(duì)大彈涂魚(yú)肝臟結(jié)構(gòu)的影響(H-E，×200)

A-1、A-2、A-3為對(duì)照組； B-1、B-2、B-3為0.5 mg/L； C-1、C-2、C-3為1 mg/L； D-1、D-2、D-3為2 mg/L。其中，HC：肝細(xì)胞；HP：肝板；IV：小葉間靜脈；CV：細(xì)胞質(zhì)空泡化；PN：核固縮；V：空泡化

2.2 不同濃度鉛暴露對(duì)大彈涂魚(yú)腸結(jié)構(gòu)的影響

如圖2所示，對(duì)照組(a-1、a-2、a-3)的腸壁結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核清晰且分布規(guī)律；Pb2+暴露12 h時(shí)，對(duì)照組的腸壁結(jié)構(gòu)與正常組并無(wú)大的區(qū)別；Pb2+暴露48 h和96 h時(shí)，隨著鉛濃度的升高，腸壁結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞核分布不規(guī)律，杯狀細(xì)胞開(kāi)始明顯增多，且固有膜開(kāi)始縮小(c-3、d-2、d-3)。

2.3 不同濃度鉛暴露對(duì)大彈涂魚(yú)脾組織的影響

對(duì)照組(1-1、1-2、1-3)的脾紅髓區(qū)與白髓區(qū)相混合，分界不明顯，白髓區(qū)顏色較深并且范圍較大；隨著Pb2+濃度的升高和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，白髓區(qū)的范圍逐漸縮小，并且出現(xiàn)大量的藍(lán)色淋巴細(xì)胞，并且在鉛暴露第96 h，高濃度鉛組(3-3、4-3)脾組織間開(kāi)始出現(xiàn)空白，脾結(jié)構(gòu)變疏松，見(jiàn)圖3。

圖2 鉛暴露對(duì)大彈涂魚(yú)肝臟結(jié)構(gòu)的影響(H-E，×200)

a-1、a-2、a-3為對(duì)照組； b-1、b-2、b-3為0.5 mg/L； c-1、c-2、c-3為1 mg/L； d-1、d-2、d-3為2 mg/L。其中，MC：肌層；IV：腸絨毛；LP：固有膜；GC：杯狀細(xì)胞

3 討論

鉛能夠通過(guò)皮膚、鰓等組織進(jìn)入魚(yú)體內(nèi)，引起魚(yú)體的一系列生理變化，當(dāng)環(huán)境中鉛濃度過(guò)高時(shí)會(huì)對(duì)魚(yú)體組織造成損傷，引起組織結(jié)構(gòu)異常和組織病變，嚴(yán)重影響魚(yú)類的生命代謝活動(dòng)。另外重金屬離子能使核酸解聚，結(jié)合在磷酸酯基上的重金屬離子可從 RNA 和核酸的磷酸二酯鍵上奪取電子，從而使得成鍵不穩(wěn)定、易水解，這樣生物大分子可降解成小的碎片， 甚至消失[15]。

肝臟是魚(yú)類重要的解毒器官，能夠有效地清除環(huán)境污染物，將有毒物質(zhì)代謝分解成無(wú)毒或低毒物質(zhì)，并排出體外，因此魚(yú)類肝臟組織的結(jié)構(gòu)變化可以作為環(huán)境中有毒物質(zhì)的生物指標(biāo)[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，大彈涂魚(yú)肝組織在鉛的暴露作用下，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度的增加，肝細(xì)胞排列紊亂，部分肝細(xì)胞空泡化，表明肝臟組織是鉛及其代謝物的靶器官，由于鉛進(jìn)入肝臟組織中，誘導(dǎo)肝組織產(chǎn)生過(guò)多的氧自由基攻擊細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜破損，細(xì)胞核裸露，從而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)空泡化。本研究還發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞在鉛暴露作用下表現(xiàn)出組織腫脹，以及核固縮甚至消失的現(xiàn)象，推測(cè)可能是由于肝細(xì)胞凋亡導(dǎo)致。這與前人的研究結(jié)果是一致的：陳其晨等[18]研究發(fā)現(xiàn)暴露在污染物中的白鰱和草魚(yú)，其肝實(shí)質(zhì)部的大部分呈現(xiàn)出細(xì)胞空泡化，僅能見(jiàn)到染色較深的核和核仁；此外肝細(xì)胞還出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，核仁消失不見(jiàn)；細(xì)胞間隙及竇狀隙腔都相應(yīng)擴(kuò)大。在污染物的脅迫下，魚(yú)類肝組織會(huì)通過(guò)增大肝竇間隙，增強(qiáng)肝組織進(jìn)行物質(zhì)交換的能力，從而減輕機(jī)體損傷，但由于竇間隙的增大導(dǎo)致肝細(xì)胞與血液間物質(zhì)交換發(fā)生變化，造成大量液體滯留從而使肝組織發(fā)生水腫[19-22]。

圖3 鉛暴露對(duì)大彈涂魚(yú)脾臟結(jié)構(gòu)的影響(H-E，×200)

1-1、1-2、1-3為對(duì)照組； 2-1、2-2、2-3為0.5 mg/L； 3-1、3-2、3-3為1 mg/L； 4-1、4-2、4-3為2 mg/L。 其中，M：黑色素巨噬細(xì)胞；MC：黑色素巨噬細(xì)胞中心；L：淋巴細(xì)胞；LC：淋巴細(xì)胞聚集區(qū)

消化系統(tǒng)功能的完整性對(duì)于魚(yú)類來(lái)說(shuō)，是整個(gè)生命活動(dòng)得以維持的關(guān)鍵。魚(yú)類腸道對(duì)食物的消化和吸收直接影響魚(yú)類生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖[23]。魚(yú)類的腸道分為黏膜層、黏膜下層、肌肉層和漿膜層。黏膜層的上皮由單層柱狀上皮細(xì)胞構(gòu)成，其中散布不少杯狀細(xì)胞。杯狀細(xì)胞能分泌消化酶，且分泌黏液，借以保護(hù)上皮細(xì)胞[24]。吳昊[25]研究發(fā)現(xiàn)，河南華溪蟹在急性29.00 mg/L鎘暴露4 d后，光鏡下觀察到急性鎘處理對(duì)消化系統(tǒng)的損傷作用較大，可見(jiàn)后腸組織的肌纖維出現(xiàn)水腫、玻璃樣變性，中腸組織甚至出現(xiàn)大面積細(xì)胞從基膜脫落、破裂及壞死的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大彈涂魚(yú)的腸道結(jié)構(gòu)進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察，發(fā)現(xiàn)隨著鉛濃度的升高和鉛暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，腸壁結(jié)構(gòu)被破壞，上皮細(xì)胞受損，杯狀細(xì)胞不斷增多，推測(cè)可能是鉛導(dǎo)致了腸道抗氧化系統(tǒng)的損傷，產(chǎn)生過(guò)多的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，從而導(dǎo)致杯狀細(xì)胞的增多。另外推測(cè)鉛通過(guò)破壞腸道結(jié)構(gòu)使腸道無(wú)法發(fā)揮正常功能從而使機(jī)體產(chǎn)生中毒現(xiàn)象。

脾臟是硬骨魚(yú)類重要的免疫造血器官，由紅髓、白髓以及血管網(wǎng)組成[26]。白髓由淋巴細(xì)胞組成，是特異性免疫發(fā)生的主要場(chǎng)所。當(dāng)抗原入侵脾臟引起體液免疫應(yīng)答時(shí)，白髓中的淋巴細(xì)胞會(huì)大量增加[27]。紅髓中存在著大量的血細(xì)胞，是免疫吞噬發(fā)生的主要場(chǎng)所[28]。王少博等[29]研究發(fā)現(xiàn)在鎘暴露后，草魚(yú)脾臟出現(xiàn)明顯的細(xì)胞破裂，組織內(nèi)出現(xiàn)較多的空隙，細(xì)胞分布變松散。鮑紅丹等[30]發(fā)現(xiàn)，低水平鉛暴露，能夠使小鼠脾臟紅髓與白髓分界不清楚，且白髓發(fā)育不良。另外有研究表明，鉛對(duì)免疫功能的影響與鉛對(duì)抑制培養(yǎng)脾細(xì)胞的增生反應(yīng)有關(guān)[31]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著Pb2+濃度的升高和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，大彈涂魚(yú)脾臟白髓區(qū)的范圍逐漸縮小，脾組織間開(kāi)始出現(xiàn)空隙，脾結(jié)構(gòu)變疏松，并且出現(xiàn)數(shù)量較多的黑色素巨噬細(xì)胞，這種細(xì)胞能夠吞噬脂褐素，因此細(xì)胞的體積相對(duì)較大，聚在一起就成了脂褐素細(xì)胞團(tuán)。研究提示鉛暴露引起脾組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，可能是鉛中毒影響免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要機(jī)制。

綜上所述，不同濃度鉛暴露會(huì)對(duì)大彈涂魚(yú)的組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的損傷，而延長(zhǎng)暴露時(shí)間亦會(huì)有同樣的作用，說(shuō)明無(wú)論是高濃度的鉛暴露還是低濃度鉛的持續(xù)暴露都會(huì)使大彈涂魚(yú)的組織結(jié)構(gòu)遭受損傷，因此，本研究為鉛對(duì)大彈涂魚(yú)損傷提供了基本理論基礎(chǔ)。

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Effects of Pb2+on tissue structure of liver, intestines and spleen in mudskipperBoleophthalmuspectinirostris

JING Dan-dan, GONG Yi-fu, ZHANG Yan, YU Kai, LI Ming, WANG Ri-xin

(School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In order to study the effects of Pb2+on tissue structure of liver, intestines and spleen of fish, Mudskippers (21.80±2.70)g were randomly stocked into 16 tanks with 8 fish each in triplicate. The fish were exposed to 0, 0.5, 1 and 2 mg/L Pb2+, and sampled on the 12th, 48thand 96thh. The results showed that Pb2+exposure results in tissue edema, cytoplasm vacuolization and in liver, epithelial cell damage, gobiet cells increased in intestinal, and lymphocytes increased in spleen. The results indicated that Pb2+exposure can cause damage to the structure of liver, intestines and spleen of mudskipper.

Pb2+;Boleophthalmuspectinirostris; toxic mechanism; bio-concentration; structure

2016-08-02；

2016-08-19

國(guó)家自然科學(xué)基金(31272661)；寧波市自然科學(xué)基金(2016A610083)

景丹丹，碩士研究生，主要從事海洋生物學(xué)研究，E-mail:1149859493@qq.com

龔一富，副教授, 主要從事植物分子生物學(xué), E-mail: gongyifu@163.com

Q495；X174

A

2095-1736(2017)04-0029-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.04.029