沈維祥，胡澤斌，陳春峰，張小燕，成虹，郜恒駿

TaqMan-MGB熒光探針法檢測北京地區(qū)幽門螺桿菌gyrA基因第87位密碼子和第91位密碼子耐藥突變

沈維祥*，胡澤斌*，陳春峰，張小燕，成虹，郜恒駿

目的采用 TaqMan-MGB 熒光探針法檢測北京地區(qū)幽門螺桿菌喹諾酮類耐藥位點(diǎn) gyrA 基因第 87 位密碼子和第91 位密碼子突變情況，比較與藥敏試驗(yàn)和一代測序法的一致性。

方法收集北京大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科門診尿素酶試驗(yàn)陽性的患者 252 例，所有患者均使用 MGB 熒光探針法和一代測序法對喹諾酮類耐藥位點(diǎn) gyrA 基因第 87 位密碼子和第 91 位密碼子進(jìn)行檢測。其中 158 例患者同時(shí)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)檢測，同時(shí)分析耐藥位點(diǎn)突變發(fā)生率與耐藥表型的關(guān)系。

結(jié)果158 例傳統(tǒng)培養(yǎng)聯(lián)合藥敏法檢測的標(biāo)本中成功培養(yǎng)出 85 例，占 53.8%，其中耐藥型菌株 40 例，敏感型菌株42 例。而 MGB 熒光探針法成功檢出 155 例，占 98.1%，其中野生型 93 例，突變型 62 例。在藥敏試驗(yàn)檢測出的85 例陽性標(biāo)本中，兩種方法檢出的符合率為 94.1%。252 例標(biāo)本中，一代測序法成功檢測出 234 例，占 92.9%，其中野生型 160 例，突變型 74 例。在 74 例突變型標(biāo)本中，含 gyrA 基因第 87 位密碼子突變的標(biāo)本占 60.8%，含 gyrA 基因第 91 位密碼子突變的標(biāo)本占 39.2%。MGB熒光探針法成功檢測出 250 例，占 99.2%，其中野生型161 例，突變型 89 例。在 89 例突變組標(biāo)本中，含 gyrA 基因第 87 位密碼子突變的標(biāo)本占 64.0%，含 gyrA 基因第91 位密碼子突變的標(biāo)本占 36.0%。一代測序法和 MGB 熒光探針法在區(qū)分是否含有突變上的符合率為 95.3%。

結(jié)論TaqMan-MGB 熒光探針法可快速、敏感地檢測患者胃黏膜標(biāo)本中幽門螺桿菌喹諾酮類耐藥位點(diǎn) gyrA 基因第87 位密碼子和第 91 位密碼子的突變情況，與藥敏試驗(yàn)和一代測序法有較高的符合性。

幽門螺桿菌； MGB 熒光探針； 喹諾酮類耐藥

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(4):325-329

喹諾酮類是近幾年應(yīng)用于臨床清除幽門螺桿菌的藥物，Maastricht IV 共識(shí)建議在克拉霉素高耐藥地區(qū)，含鉍劑的四聯(lián)療法失敗后可以使用含左氧氟沙星的三聯(lián)方案[1-2]。中國共識(shí)也建議可以將喹諾酮類抗生素用于幽門螺桿菌感染的治療[3]。但值得注意的是，有些地區(qū)喹諾酮類藥物的濫用容易導(dǎo)致幽門螺桿菌對該類藥物產(chǎn)生耐藥性。另一方面，傳統(tǒng)的幽門螺桿菌臨床檢驗(yàn)方法由于條件要求苛刻，耗時(shí)較長，不能夠滿足臨床檢驗(yàn)的需求[4-5]。因此，方便快速地檢測幽門螺桿菌對喹諾酮類耐藥情況成為臨床亟待解決的問題。本文應(yīng)用基于TaqMan-MGB 熒光探針的實(shí)時(shí)熒光 PCR 法（簡稱MGB 熒光探針法）檢測幽門螺桿菌喹諾酮類耐藥位點(diǎn) gyrA 基因第 87 位密碼子和第 91 位密碼子的突變情況，并與藥敏試驗(yàn)和一代測序法進(jìn)行比較，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 選取 2013年 7月至 2015年7月就診于北京大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科，胃組織活檢顯示尿素酶試驗(yàn)為陽性的患者 252 例，所有患者均簽署知情同意書且在 1 個(gè)月內(nèi)未服用任何抗幽門螺桿菌治療藥物。胃黏膜標(biāo)本于 1 ml 的腦心浸出液液體培養(yǎng)基中，–80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 儀器與試劑 QIAamp DNA mini kit 和BigDye?terminator v3.1 cycle sequencing kit 購自德國 Qiagen 公司；PrimeSTAR?HS（Premix）購自Takara 公司；快速尿素酶檢測試劑盒購自福建貝真生物公司；腦心浸液肉湯/干粉購自上海研生實(shí)業(yè)公司；哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基購自美國 BD 公司；M-H血瓊脂平板購自英國 Oxoid 公司；微需氧袋及E-test 藥敏試條購自法國生物梅里埃公司；NanoDrop 2000 超微量生物檢測儀、ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀、3730 基因分析儀和 MGB 熒光探針及合成引物購自美國 ThermoFisher 公司；臺(tái)式低溫離心機(jī)購自德國 Sigma 公司；Taq 酶、dNTPs 等購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株H.pyloriNCTC11637 來自英國倫敦國家標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收藏中心，保存于北京大學(xué)第一醫(yī)院消化實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 幽門螺桿菌 DNA 提取 以 QIAamp DNA mini kit 抽提 252 例胃黏膜組織的幽門螺桿菌基因組 DNA。

1.2.2 MGB 熒光探針法檢測 設(shè)計(jì)合成 gyrA基因第 87 位密碼子和第 91 位密碼子相應(yīng)的野生型和突變型 MGB 探針，并采用 HPLC 純化方式進(jìn)行制備。所用 MGB 探針序列如表 1 所示。

表1 MGB 探針序列信息Table 1 Sequence information of MGB probe

PCR 體系含 10 × PCR buffer、2 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、2 U Taq 酶、0.3 μmol/L上游引物和 0.03 μmol/L 下游引物。將上述組分混勻后，分別加入 0.1 μmol/L gyrA 基因第 87 位密碼子和第 91 位密碼子相應(yīng)的野生型和突變型MGB 探針。每小管最終體積 25 μl，使得每條MGB 探針分別對 4 種基因型進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增與結(jié)果分析。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 15 s，62 ℃ 延伸 30 s，擴(kuò)增 40 個(gè)循環(huán)；在每一循環(huán)的退火溫度時(shí)收集熒光信號(hào)。

1.2.3 一代測序驗(yàn)證 為驗(yàn)證 MGB 熒光 PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，gyrA 基因第 87 位密碼子和第 91 位密碼子均經(jīng)表 2 中的測序引物擴(kuò)增后進(jìn)行雙向測序。首先采用 PrimeSTAR?HS（Premix）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：PrimeSTAR?HS（Premix）20 μl，測序引物 F 10 pmol，測序引物 R 10 pmol，DNA 模板 100 ng，總體積 50 μl。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性 15 s；98 ℃ 變性 10 s，55 ℃延伸 15 s，72 ℃ 延伸 1 min，擴(kuò)增 30 個(gè)循環(huán)。之后使用 QIAquick PCR purification kit 純化 PCR產(chǎn)物，再使用 BigDye?terminator v3.1 cycle sequencing kit 和 3730 基因分析儀，測序引物進(jìn)行雙向測序。同時(shí)使用幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性質(zhì)控對照進(jìn)行測序試驗(yàn)。

表2 一代測序法所用測序引物序列信息Table 2 Sequence information of sequencing primers

1.2.4 細(xì)菌培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn) 對符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患者，在內(nèi)鏡下距幽門 5 cm 的大彎或小彎處，額外鉗取 1 塊或 2 塊胃黏膜組織置于腦心浸液肉湯中保存，取材后 4 h 內(nèi)接種于哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基并放入微需氧袋中，置 37 ℃ 培養(yǎng) 3～21 d。挑取培養(yǎng)基上的無色透明菌落，依據(jù)全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程（第 3 版）進(jìn)行鑒定。藥敏試驗(yàn)采用 E-test試驗(yàn)檢測 MIC 值確定幽門螺桿菌菌株對左氧氟沙星的耐藥性。收集哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基上新鮮培養(yǎng)的幽門螺桿菌菌落，調(diào)整濃度至 3 × 108cfu/ml，接種于 9 cm 平板瓊脂培養(yǎng)基上，L 棒均勻涂開，晾干后放置一條含藥液的 E-test 試紙條，試紙條標(biāo)有 MIC，刻度面朝上，濃度最大端靠近平板邊緣。37 ℃、微需氧條件下培養(yǎng) 72 h 后讀取結(jié)果。幽門螺桿菌對左氧氟沙星耐藥的判斷標(biāo)準(zhǔn)為 MIC 值＞ 1 μg/ml[6-7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

兩種方法的比較采用四格表分析和配對卡方檢驗(yàn)。P＜ 0.05 表示兩種方法的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MGB 熒光探針法檢測結(jié)果與藥敏試驗(yàn)的結(jié)果比較

158 例尿素酶試驗(yàn)陽性患者的胃黏膜標(biāo)本應(yīng)用藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)出 85 例，培養(yǎng)陽性率為 53.8%（85/158），其中耐藥型菌株 40 例，敏感型菌株45 例。MGB 熒光探針法成功檢測出 155 例，占98.1%（155/158），其中野生型 93 例，突變型62 例，3 例未見擴(kuò)增信號(hào)。在藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)出的85 例標(biāo)本中，兩種方法檢測符合率為 94.1%（80/85）。其中，藥敏試驗(yàn)檢測為敏感的 45 例標(biāo)本中，有 5 例 MGB 熒光探針法檢測出突變位點(diǎn)；藥敏試驗(yàn)檢測為耐藥的 40 例標(biāo)本中均檢測出突變位點(diǎn)，見表 3。

2.2 MGB 熒光探針法檢測結(jié)果與一代測序法的結(jié)果比較

252 例胃黏膜標(biāo)本中一代測序法成功檢測出234 例，占 92.9%（234/252），18 例未見信號(hào)。該18 例胃黏膜標(biāo)本經(jīng)過測序法重復(fù)檢測，仍未出現(xiàn)信號(hào)，表明尿素酶試驗(yàn)可能存在一定的假陽性情況。

234 例成功檢測出的標(biāo)本中包括野生型（即不包含 gyrA 第 87 位密碼子或第 91 位密碼子突變）160 例，占 68.4%（160/234）；突變型（即包含 gyrA 第 87 位密碼子或第 91 位密碼子突變）74 例，占 31.6%（74/234）。在 74 例突變型標(biāo)本中，含 gyrA 第 87 位密碼子突變的標(biāo)本占 60.8%（45/74），含 gyrA 第 91 位密碼子突變的標(biāo)本占39.2%（29/74）。

252 例胃黏膜標(biāo)本中 MGB 熒光探針法成功檢測出 250 例，占 99.2%（250/252），2 例未見信號(hào)。250例成功檢測出標(biāo)本中包括野生型 161 例，占 64.4%（161/250），突變型 89 例，占 35.6%（89/250）。在 89 例突變組標(biāo)本中，含 gyrA 第87 位密碼子突變的標(biāo)本占 64.0%（57/89），含 gyrA第 91 位密碼子突變的標(biāo)本占 36.0%（32/89）。在兩種方法均成功檢測出的 234 例標(biāo)本中，符合率為 95.3%（223/234），見表 4。

3 討論

幽門螺桿菌對喹諾酮類的耐藥主要與 gyrA基因中的喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)（QRDR）發(fā)生點(diǎn)突變有關(guān)，在喹諾酮耐藥菌株中也有學(xué)者檢測到gyrB 基因突變，但往往與 gyrA 基因突變同時(shí)出現(xiàn)[8-9]。因此，本研究主要檢測 gyrA 基因的突變情況，同時(shí)將耐藥突變位點(diǎn)的檢測集中在該基因第87 位密碼子位點(diǎn)突變（Asn 突變?yōu)?Lys 和 Ile）和第 91 位密碼子位點(diǎn)突變（Asp 突變?yōu)?Gly、Asn和 Tyr）。MGB 熒光探針法是基于 PCR 反應(yīng)過程的動(dòng)態(tài)檢測方法，已有相關(guān)報(bào)道將該方法應(yīng)用于幽門螺桿菌其他耐藥位點(diǎn)的突變檢測[10]。

由于患者意愿的原因，在本次研究中同時(shí)進(jìn)行MGB 熒光探針法與藥敏試驗(yàn)檢測的只有 158 例。藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果為敏感型的 45 例標(biāo)本中，MGB熒光探針法檢測 40 例為野生型，3 例為 gyrA基因第 87 位密碼子突變，2 例為 gyrA 基因第91 位密碼子突變。造成個(gè)別標(biāo)本檢測結(jié)果不一致的原因可能是 gyrA 基因發(fā)生突變與喹諾酮類耐藥不存在必然關(guān)系，某些菌株雖然發(fā)生了 gyrA 基因突變，但是菌株藥敏表型仍為敏感。在上述不一致的 5 例患者中有 4 例成功進(jìn)行了隨訪，之后檢測均顯示傳統(tǒng)方法為敏感型，同時(shí)這 5 位患者均應(yīng)用了包含左氧氟沙星的三聯(lián)方案進(jìn)行治療，且均根除失敗。進(jìn)一步說明 MGB 熒光探針法在檢測幽門螺桿菌喹諾酮類耐藥菌株混合感染時(shí)要優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

表3 MGB 熒光探針法與藥敏試驗(yàn)的比較Table 3 Results of both traditional culture with E-test and TaqMan-MGB fluorescent probe real-time PCR

表4 MGB 熒光探針法與一代測序法的結(jié)果比較Table 4 Results of both TaqMan-MGB fluorescent probe real-time PCR and Sanger sequencing

在本研究中，MGB 熒光探針法和一代測序法同時(shí)成功檢出的標(biāo)本共 234 例，2 種方法檢測結(jié)果完全一致的共 223 例，不一致共 11 例，不一致主要集中在一代測序法檢測為野生型而 MGB熒光探針法檢測為 gyrA 基因第 87 位密碼子突變的 9 例，檢測為 gyrA 基因第 91 位密碼子突變的 2 例。造成這種不一致的原因可能為 MGB熒光探針法的靈敏度遠(yuǎn)高于一代測序法。另一方面，18 例使用一代測序法無法檢出的標(biāo)本中，MGB熒光探針法可檢出 12 例野生型，4 例突變型。因此，采用 MGB 熒光探針法可以檢出標(biāo)本中含量更低的野生或突變菌。這兩種方法的符合率為95.3%，表明 MGB 熒光探針法可以應(yīng)用于臨床上幽門螺桿菌喹諾酮類耐藥位點(diǎn)的快速檢測。

綜上所述，本文應(yīng)用 MGB 熒光探針法檢測幽門螺桿菌 gyrA 基因第 87 位密碼子和第 91 位密碼子的突變，操作簡便，敏感性高，與藥敏試驗(yàn)和一代測序法的一致性較好，為幽門螺桿菌喹諾酮類耐藥位點(diǎn)的快速檢測提供了應(yīng)用思路。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(4):325-329

科技部發(fā)布2016年生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室評估結(jié)果

根據(jù)《國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)與運(yùn)行管理辦法》和《國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室評估規(guī)則》，2016年，科技部委托中國生物技術(shù)發(fā)展中心會(huì)同中國科協(xié)生命科學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合體，對生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域共 75 個(gè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了獨(dú)立評估。根據(jù)評估情況，經(jīng)科技部部務(wù)會(huì)會(huì)議審定，評估結(jié)果予以發(fā)布。

詳情請登錄國家科學(xué)技術(shù)部網(wǎng)站 http://www.most.gov.cn/mostinfo/xinxifenlei/fgzc/gfxwj/gfxwj2017/201706/t20170629_13 3829.htm 查閱。

Employment of TaqMan-MGB fluorescent probe real-time PCR for detection of the quinolones resistant mutations of Helicobacter pylori in Beijing area

SHEN Wei-xiang, HU Ze-bin, CHEN Chun-feng, ZHANG Xiao-yan, CHENG Hong, GAO Heng-jun

ObjectiveTo use the method based on TaqMan-MGB fluorescent probe real-time PCR for detection of the prevalence of primary quinolones-resistance and the distribution involvedHelicobacter pylorimutations in Beijing area.

MethodsA total of 252Helicobacter pylori-positive patients undergoing gastroscope in the First Hospital of Beijing University was enrolled.Helicobacter pyloriinfection was identified by histology and rapid urease test.The quinolones resistant status ofgastric mucosa tissues from 158 patients was detected by traditional culture with E-test, TaqMan-MGB fluorescent probe real-time PCR and Sanger sequencing.The detection for the rest of 94 patients was performed by only TaqMan-MGB fluorescent probe real-time PCR and Sanger sequencing.

ResultsAmong the 158 cases using both traditional culture with E-test and TaqMan-MGB fluorescent probe real-time PCR, 53.8%and 98.1% ofHelicobacter pyloripositive cases were detected by traditional assay and TaqMan-MGB method, respectively.Total of 94.1% consistency were showed in both assays in 85 positive case with traditional culture.In the 252 cases, 99.2% and 92.9%Helicobacter pyloripositive cases was detected using TaqMan-MGB fluorescent probe real-time PCR and Sanger sequencing,respectively.Coincidence rate of 95.3% was found in both assays to distinguish mutations.For the 234 positive cases tested by Sanger sequencing, the mutations were detected in 74 cases (including 60.8% mutations with gyrA 87 codon or 39.2% mutations with gyrA 91 codon), while wild type was detected in 160 cases.For the 250 positive cases tested by TaqMan-MGB fluorescent probe real-time PCR, mutations were detected in 89 cases (including 64.0% mutations with gyrA 87 codon or 36.0% mutations with gyrA 91 codon), while wild type (without gyrA 87 codon mutation or gyrA 91 codon mutation) was detectable in 161 cases.

ConclusionThe method based on TaqMan-MGB fluorescent probe real-time PCR could be applied for rapid and sensitive clinical detection of quinolones resistance toHelicobacter pylori.

Helicobacter pylori; TaqMan-MGB probe; Quinolones resistance

s:CHENG Hong, Email: chenghong1969@163.com; GAO Heng-jun, Email: xiaoyan_zhang@shbiochip.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.006

2015年浦東新區(qū)科技發(fā)展基金（PKJ2015-S26）

201203 上海，生物芯片上海國家工程研究中心（沈維祥、陳春峰、張小燕、郜恒駿）；100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所（胡澤斌）；200438 上海，復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（張小燕）；100034 北京大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科（成虹）；200092 上海，同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院消化疾病研究所（郜恒駿）

成虹，Email：chenghong1969@163.com；郜恒駿，Email：xiaoyan_zhang@shbiochip.com

2017-03-14

*同為第一作者

Author Affiliations:National Engineering Center for Biochip, Shanghai 201203, China (SHEN Wei-xiang, CHEN Chun-feng,ZHANG Xiao-yan, GAO Heng-jun); Institute for in Vitro Diagnostic Reagents of National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050, China (HU Ze-bin); School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China (ZHANG Xiao-yan);Department of Gastroenterology, the First Hospital of Beijing University, Beijing 100034, China (CHENG Hong); Institute of Digestive Diseases, Tongji University School of Medicine, Shanghai 200092, China (GAO Heng-jun)