李宛靜，徐曉娟△，黃映紅，鄧蒂斯，雒芙蓉，張 純

(1.成都中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，成都 610075)

【實驗研究】

補腎化痰方調控大鼠卵巢GC中APN信號通路機制的研究

李宛靜1，徐曉娟1△，黃映紅2，鄧蒂斯1，雒芙蓉1，張 純1

(1.成都中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，成都 610075)

目的：通過分析補腎化痰方對大鼠顆粒細胞脂聯素受體1/2(AdipoR1/2)蛋白表達水平及下游分子相關基因表達的差異，探討該復方激活卵巢GC中APN信號通路的機制。方法：采用雌性SD大鼠，體外培養(yǎng)卵巢顆粒細胞，Western-blotting測定AdipoR1/2的蛋白表達量，Real-time PCR測定AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19a的mRNA表達。結果：與空白組比較，羅格列酮組、中藥中低劑量組大鼠GC的AdipoR1/2含量均明顯上升且差異有統(tǒng)計學意義；GC中AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19a的mRNA表達量亦有明顯的變化趨勢，與空白組比較，羅格列酮組、中藥中低劑量組的mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義。結論：補腎化痰方能激活大鼠GC中APN信號通路的機制，可能與該方調節(jié)卵巢生殖激素轉化及卵巢局部糖脂代謝相關。

補腎化痰方；卵巢顆粒細胞；APN信號通路

補腎化痰方在中醫(yī)婦科臨床治療多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)、卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)、不孕癥(Infertility)等疾病中已經取得顯著療效，然其具體機制尚不明確。近年研究發(fā)現，卵巢顆粒細胞(granulosa cell, GC)在諸多婦科疑難病種的發(fā)病機制中扮演著重要角色，能影響排卵、黃體生成、女性甾體激素水平及卵巢局部的糖脂代謝水平[1]。本文采用該復方干預體外培養(yǎng)卵巢顆粒細胞，旨在闡明該方通過激活卵巢GC中APN信號通路，發(fā)揮調節(jié)卵巢生殖激素轉化及卵巢局部糖脂代謝的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用3～4周齡清潔級雌性SD大鼠，體質量約60～70 g，由成都中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供(動物許可證號SCXK(川)2013-24)。

1.2 實驗用藥物及主要試劑

補腎化痰方組成：菟絲子30 g，覆盆子30 g，桑椹子30 g，補骨脂10 g，鹿角霜10 g，紫河車10 g，茯苓20 g，陳皮15 g，車前子15 g，肉蓯蓉15 g等，由成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院實驗室統(tǒng)一制備成14.8 g/ml、7.4 g/ml、3.7 g/ml的水煎液，分別相當于成人用藥等效劑量10、5、2.5倍。羅格列酮(太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司生產，批號15020009)，FSHR第一抗體(武漢博士德生物工程有限公司，多克隆兔抗鼠，生產批號AD082527)；AdipoR1第一抗體(Santa Cruz Company，多克隆抗體，羊抗鼠)；孕馬血清(PMSG,Solarbio，生產批號20141117)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo公司)；TRIZOL試劑液(Invitrogen Company)；反轉錄試劑盒(BIO-RAD；iScriptTMcDNA Synthesis Kit)；熒光定量PCR 所用試劑盒(BIO-RAD；SsoFastTMEvaGreen?Superemix)。

1.3 補腎化痰方含藥血清的制備

取6～7周齡的SD雌鼠50只，體質量約180～200 g，隨機分為中藥高、中、低劑量組、羅格列酮組、空白組各10只。中藥高、中、低劑量組分別給予7.4 g/100 g、3.7 g/100 g、1.85 g/100 g的補腎化痰方水煎液，羅格列酮組按成人劑量的10倍給予羅格列酮0.08 mg/100 g，空白組大鼠給予等體積生理鹽水。各組均灌胃2次/d，連續(xù)3 d后禁食12 h，于第4天一次性給予全天劑量，1 h后股動脈取血。將各組血液于4℃下靜置4 h，2000 r/min離心15 min，取上清抽濾除菌同組混勻，56℃條件下滅活30 min并分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 大鼠GC的分離、培養(yǎng)及鑒定

參照Lovekamp[4]等方法，取雌性SD大鼠30只，皮下注射PMSG 40 IU，48 h 后分離GC，將GC加入含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中制備單細胞懸液，按3×105個/ml接種于24孔板，并將細胞分為空白血清組、中藥高、中、低劑量組、羅格列酮組，每組10孔，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)3 d后棄培養(yǎng)液，加入含空白血清或含藥血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)48 h,處理方法如下。

空白組每孔加入含20%空白血清的DMEM培養(yǎng)液1 ml； 中藥高劑量組每孔加入含20%高劑量補腎化痰方血清的DMEM培養(yǎng)液1 ml； 中藥中劑量組每孔加入含20%中劑量補腎化痰方血清的DMEM培養(yǎng)液1 ml； 中藥低劑量組每孔加入含20%低劑量補腎化痰方血清的DMEM培養(yǎng)液1 ml； 羅格列酮組每孔加入含20%羅格列酮血清的DMEM培養(yǎng)液1 ml。

GC的鑒定：將GC以2×106/ml 的密度接種于已預置好小蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，37℃、5% CO2及完全飽和濕度條件下培養(yǎng)制成細胞爬片。當細胞生長至70%融合時取出玻片，行細胞免疫化學染色。

1.5 Western Blotting檢測GC的AdipoR1/2表達

提取各組GC的總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度，Western blotting檢測 GC 的AdipoR1表達水平，一抗1∶200稀釋，二抗1∶1000稀釋。掃描PVDF膜上各條帶，記錄各條帶的平均光密度值，用以表示GC細胞膜AdipoR的相對含量，比較各組GC細胞膜AdipoR1表達的差異。

1.6 Realtime PCR檢測GC中AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19amRNA的表達

表1顯示，使用Invitrogen TRIZOL試劑提取細胞總RNA，用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳，然后用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察RNA的完整性。所得RNA采用BIO-RAD公司的iScriptTMcDNA Synthesis Kit進行反轉錄為cDNA，設計引物后對PCR進行擴增。熒光定量PCR 所用試劑盒為BIO-RAD 公司的SsoFastTMEvaGreen ?Superemix，PCR反應在Bio-Rad IQ5 PCR儀上進行，每個樣品均重復3次以避免加樣誤差，實驗數據利用iQ5-Cycler進行分析，分析方法為ΔΔCt法。根據NCBI公布的基因序列進行引物設計。

表1 檢測基因的引物序列表

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 大鼠卵巢組織中卵泡GC鑒定

圖1顯示，采用免疫組織化學染色法對取材正確性進行鑒定，結果顯示所培養(yǎng)的細胞為大鼠卵巢組織中卵泡顆粒細胞。

圖1 大鼠卵巢組織中卵泡顆粒細胞免疫化學染色結果(100×)注：GC取材于大鼠卵巢組織中的卵泡，箭頭標示處為卵巢顆粒細胞

2.2 補腎化痰方對GC的AdipoR1/2表達的影響

圖2 大鼠卵巢組織中卵泡顆粒細胞AdipoR1、AdipoR2蛋白的Western blotting檢測電泳條帶注：Western blotting法檢測采用雙盲法，每個蛋白組別順序不同。K.空白血清組；D.中藥低劑量組；G.中藥高劑量組；L.羅格列酮組；Z.中藥中劑量組

圖2表3顯示，本研究采用Western blotting觀察補腎化痰方調控GC細胞膜上AdipoR1、AdipoR2的表達水平，各組細胞的總蛋白質濃度分別為空白血清組2.52 mg/ml，中藥中劑量組2.53 mg/ml，中藥低劑量組2.14 mg/ml，中藥中劑量組2.48 mg/ml，羅格列酮組3.12 mg/ml。結果顯示，GC細胞膜表面均存在AdipoR1、AdipoR2的特異性表達；與空白血清組比較，中藥低劑量組、中劑量組和羅格列酮組的表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中中藥中劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

組 別樣品孔AdipoR1表達量AdipoR2表達量空白組31.02±0.011.07±0.12羅格列酮組33.65±0.07*4.44±0.09*中藥低劑量組310.62±0.10**3.88±0.06*中藥中劑量組314.05±0.15**5.23±0.09**中藥高劑量組32.58±0.17*3.33±0.11*

注：與空白組比較:*P<0.05，**P<0.01

2.3 補腎化痰方對GC的AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19a表達的影響

表3顯示，本研究采用Realtime-PCR法測定卵巢顆粒細胞AMPK、Cyp19a、PPAR-α/β/γ的表達有明顯的變化趨勢。與空白組比較，羅格列酮組及中藥中、低劑量組的表達量均明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

組 別例數AMPKPPAR-αPPAR-βPPAR-γCyp19a空白組32.00±0.113.06±0.241.52±0.274.03±0.272.07±0.24羅格列酮組34.00±0.45*7.47±0.20*4.58±0.41*9.93±0.44**4.97±0.41*中藥低劑量組34.19±0.17*6.29±0.26*3.01±0.18*7.97±0.28*4.43±0.24*中藥中劑量組35.04±0.41**8.95±0.48**5.27±0.22**9.22±0.26**6.05±0.23**中藥高劑量組33.77±1.06*5.38±0.26*2.69±0.21*4.86±0.244.02±0.25*

注：與空白組比較：*P<0.05；**P<0.01

3 討論

本實驗基于中醫(yī)理論及導師徐曉娟教授長期臨床實踐，選用補腎經典復方五子衍宗丸及痰濕證常用方蒼附導痰湯臨證加減，去五味子選用更精于補益精血的桑椹子。全方補腎陽益精血、補中寓行、燥濕健脾、行氣解郁化痰，兩方合用共奏補腎健脾化痰、調理沖任之功?，F代藥理學研究顯示，補腎化痰類中藥具有類雌激素樣作用，可作用于下丘腦調節(jié)促性腺激素分泌[2]，促進顆粒細胞增殖[3]，增加卵泡對卵泡刺激素的反應性，引起下丘腦-垂體反饋，促進初級卵泡向優(yōu)勢卵泡發(fā)育，減少痰濕體質患者體內脂肪積聚，改善血中載脂蛋白含量和血液的濃黏凝聚狀態(tài)。臨床及實驗研究均證實[4]，補腎化痰復方可以調節(jié)患者體內雌激素和雄激素水平而促排卵，并能改善糖脂代謝功能。

已有研究證實[5]，豬卵巢中脂聯素與雌激素的合成有關。有研究已證實，GC通過影響促性腺激素對卵母細胞進行調節(jié)，能構建有利于卵母細胞發(fā)育成熟的分子微環(huán)境[6]。因此，APN/AMPK信號通路的激活，能夠正向調節(jié)卵巢GC生殖激素的轉化，并促進卵泡的發(fā)育。有研究證實，CYP19a基因是編碼雌激素生成的關鍵酶——細胞色素P450芳香化酶，是雌激素合成最后一步的限速酶，其表達與雌激素生成相關[7]。據此推測此為該方改善PCOS、卵巢早衰、不孕癥等疾病的機制。有研究證實[8-9]，該條通路的激活能夠促進脂肪酸的燃燒與能量的消耗；而PPAR-γ是與肥胖、胰島素抵抗密切相關的基因，其激動劑羅格利酮已經廣泛應用于臨床治療2型糖尿病及PCOS伴發(fā)胰島素抵抗的患者。有研究表明，脂聯素及其mRNA表達在肥胖者表達量下降，而其表達水平隨體質量減輕又再次增加[10]。亦有研究顯示，血清及卵泡液脂聯素含量與BMI呈負相關；在肥胖型PCOS痰濕證中，血清及卵泡液的APN水平及AdipoR1/2表達水平均顯著性下降。

根據本實驗結果提示，補腎化痰方能活化AdipoR1/2，上調CYP19a的表達，促進雄烯二酮向雌激素轉化，而機體維持正常的雌激素水平是卵泡發(fā)育及子宮內膜發(fā)育的必備條件，因此該法能夠有效改善卵泡發(fā)育障礙，而臨床能夠有效治療PCOS、POF、Infertility等疾病，其機制可能與此有關。另外根據實驗結果提示，該方能活化AdipoR，并能上調PPARα/β/γ的表達，改善因女性生殖內分泌紊亂引起的卵巢局部糖脂代謝紊亂，為卵母細胞發(fā)育為優(yōu)勢卵泡提供良好的分子微環(huán)境。

綜上所述，本項研究結果與課題組整體實驗采用肥胖型PCOS大鼠觀察補腎化痰方對GC中APN信號通路的影響及其對糖代謝、卵泡發(fā)育的調控作用一致，故可推測補腎化痰方能通過調控APN/AMPK信號通路傳導正向調節(jié)卵巢激素轉化及卵巢糖脂代謝。

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Study on the Mechanism of APN Signaling Pathway Regulating GC in Ovary of Rats by Tonifying Kidney and Resolving Phlegm Prescription

LI Wan-jing1, XU Xiao-juan1△, HUANG Ying-hong2, Deng Di-si1, LUO Fu-rong1, ZHANG Chun1

(1.ClinicalmedicineschoolofChengduUniversityofTCM,Chengdu610075，China; 2.BasicmedcineschoolofChengduUniversityofTCM,Chengdu610075,China)

Objective: By analyzing the protein expression levels of adiponectin receptor1/2(AdipoR1/2) and the gene expression differences related downstream molecules, in order to explore the mechanism of activation the APN signal pathway in rat ovarian granulosa cells(GC) by the Tonifying Kidney and Resolving Phlegm(TKRP) method.Methods: Selected female SD rats, cultured rat ovarian GC in vitro, measured the protein levels of AdipoR1/2 by Western-blotting and the mRNA expression of AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19a by Real-time PCR. Results: Compared with the control group,AdipoR1/2 expression of rosiglitazone and middle、low dose group of the TKRP has up to a higher level, which has statistical significance;the mRNA expression of AMPK、PPAR-α/β/γ、Cyp19a in middle、low dose group of the TKRP was also significantly higher than the control group.Conclusion: The TKRP can activate the APN signal pathway in rat ovarian GC, it may be associated with the TKRP regulating reproductive hormone conversion and glycolipid metabolism in ovary.

Tonifying Kidney and Resolving Phlegm Recipe; Ovarian granulosa cells; APN signal pathway

國家自然科學基金資助項目(81470199)-經APN信號通路探討補腎化痰法調控肥胖型PCOS卵泡發(fā)育機制研究；四川省教育廳基礎項目研究(142A0315)-以APN信號途徑為靶點研究補腎化痰法調控肥胖型PCOS雌鼠GC增殖分化機制

李宛靜(1990-)，女，四川華鎣人，醫(yī)學碩士，從事中西醫(yī)對肥胖多囊卵巢綜合征發(fā)病機制研究。

△通訊作者：徐曉娟(1969-)，女，江蘇鎮(zhèn)江人，副研究員，醫(yī)學博士，碩士研究生導師，從事補腎中藥對女性生殖內分泌調控研究，Tel：13980971928，E-mail: 847956379@qq.com。

R285.5

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1006-3250(2017)05-0642-03

2016-11-09