劉雅玲 周辰 潘曉東 尹冬華

胰島素對(duì)2型糖尿病心肌病大鼠的心肌保護(hù)機(jī)制

劉雅玲 周辰 潘曉東 尹冬華

目的 探討胰島素干預(yù)對(duì)2型糖尿病心肌病(DCM)大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激和白介素-6(IL-6)水平的影響。 方法 16只雄性Wistar大鼠采用鏈脲佐菌素(STZ)+高脂飲食誘發(fā)2型糖尿病。隨機(jī)分為干預(yù)組(IN組,n=8)和糖尿病組(DM組,n=8),另選8只作為正常對(duì)照組(Con組,n=8)。IN組于成模第1周給予諾和靈30R皮下注射,而DM組和Con組予以等量生理鹽水皮下注射。成模8周后比較各組超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、IL-6水平的差異,并觀察心肌細(xì)胞病理學(xué)改變。 結(jié)果 心肌組織HE染色顯示DM組大鼠心肌纖維明顯減少、排列紊亂,橫紋消失,細(xì)胞核固縮或增大,間質(zhì)反應(yīng)性增生。與Con組比較,DM組大鼠血糖、心重(HW)/體重(BW) 比、MDA、IL-6水平升高(P<0.05),SOD、GSH水平均降低(P<0.05),IN組上述指標(biāo)均較DM組有改善(P<0.05)。 結(jié)論 胰島素對(duì)DCM大鼠心肌細(xì)胞有抗炎、抗氧化作用。

胰島素; 白介素-6; 氧化應(yīng)激; 糖尿病; 心肌病

糖尿病發(fā)病率逐年上升,其并發(fā)癥的危害不容忽視。其中糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)作為一項(xiàng)遠(yuǎn)期并發(fā)癥,越來越引起人們的重視。DCM是指排除了冠心病、高血壓及其他已知的疾病所致的心肌損傷后而診斷的一類獨(dú)立的、特異性的心肌病,其早期表現(xiàn)為心室舒張功能障礙,隨后可出現(xiàn)收縮功能受損,逐漸發(fā)展為充血性心力衰竭。DCM的發(fā)病機(jī)制尚未明了。近年來認(rèn)為，糖尿病是一種炎癥反應(yīng)性疾病,氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在糖尿病心臟遠(yuǎn)期并發(fā)癥中有促進(jìn)作用[1]。胰島素作為體內(nèi)唯一降糖激素,其抗炎抗氧化的作用正引起廣泛關(guān)注[2]。本文擬探討胰島素在DCM大鼠中發(fā)揮抗炎、抗氧化作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購入健康雄性Wistar大鼠28只。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司,諾和靈30R(批號(hào):VVG0316)購自丹麥諾和諾德公司,鹽酸氯胺酮(2 ml:0.1 g)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥公司,丙二醛(MDA)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒和谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒購自南京建成生物研究所,白介素-6(IL-6)測定試劑盒購自上海超研生物科技公司,羅氏血糖儀購自羅氏公司,723可見分光光度計(jì)購自上海光譜儀器公司,光學(xué)顯微鏡(Olympus-BH2)購自日本Olympus公司。

1.2 2型糖尿病大鼠模型的建立及分組動(dòng)物處理 20只6月齡的健康雄性Wistar大鼠,體質(zhì)量200～220 g,予以高脂飼養(yǎng)4周,過夜禁食12 h后,每只按25 mg/kg腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ溶于pH 4.4的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液),于72 h、7 d斷尾取靜脈血測血糖,2次隨機(jī)血糖濃度均≥16.7 mmol/L為2型糖尿病造模成功。其中死亡1只,建模未成功3只,符合標(biāo)準(zhǔn)的16只大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn),隨機(jī)分成2組:胰島素干預(yù)組(IN組,n=8)和糖尿病組(DM組,n=8),繼續(xù)高脂飼養(yǎng)。另選8只做正常對(duì)照(Con組,n=8),基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng),每只腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。IN組每日下午五點(diǎn)至六點(diǎn),給予4 U諾和靈30R皮下注射,注射前及注射后2 h測血糖，避免低血糖。DM組和Con組予以等量生理鹽水皮下注射,共干預(yù)8周。

1.3 動(dòng)物處理 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn),測終末點(diǎn)血糖,稱取大鼠體質(zhì)量(BW),予以鹽酸氯胺酮2 ml:生理鹽水8 ml,稀釋后按1 ml/100 g右下腹腔麻醉,打開腹腔,下腔靜脈采血5 ml備用后,迅速打開胸腔取出心臟放入冰生理鹽水中漂洗后稱心重(HW),取左室前壁。

1.4 SOD、GSH、MDA測定 抽取下腔靜脈血約3 ml,2500 r/min離心10 min,取上清,采用化學(xué)比色法,按試劑盒說明書制備空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和各測定管,充分混勻,蒸餾水調(diào)零,測定各管吸光度(A)值,根據(jù)公式:樣品含量=(測定管A值-空白管A值)/(標(biāo)準(zhǔn)管A值-空白管A值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度,計(jì)算樣品中SOD、GSH、MDA含量。

1.5 IL-6測定 抽取下腔靜脈血約2 ml,1000 r/min離心20 min,取上清,用酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA)按試劑盒說明經(jīng)過加樣、洗滌、溫育等步驟測定IL-6。

1.6 HE染色 左室前壁心肌組織經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片、浸染、沖洗、封膠,蓋片等步驟后,光鏡下觀察病理學(xué)變化,攝片。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 Con組大鼠無糖尿病癥狀,生長及營養(yǎng)狀況良好,毛發(fā)有光澤,體重逐漸增加。DM組大鼠明顯多飲、多尿、多食及消瘦,皮毛污穢無澤;而IN組上述表現(xiàn)減輕,糖尿病癥狀得以改善。

2.2 大鼠終點(diǎn)血糖、HW/BW的比較 與Con組比較,DM組和IN組血糖水平、HW/BW明顯增高(P<0.05);與DM組比較,IN組血糖水平、HW/BW降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)血糖濃度和HW/BW比值(, n=8)

注:與Con組比較,*P<0.05,與DM組比較,△P<0.05

2.3 各組SOD、GSH、MDA水平的比較 與Con組比較,DM組和IN組大鼠SOD、GSH水平明顯降低(P<0.05),MDA水平增高(P<0.05),與DM組比較,IN組SOD、GSH水平增高(P<0.05),MDA水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠SOD、GSH、MDA水平的比較(, n=8)

注:與Con組比較,*P<0.05,與DM組比較,△P<0.05

2.4 各組IL-6水平比較 與Con組比較,DM組和IN組大鼠IL-6水平明顯升高(P<0.05),與DM組比較,IN組IL-6水平明顯降低(P<0.05),見表3。

表3 各組大鼠IL-6水平比較(, n=8)

注:與Con組比較,*P<0.05,與DM組比較,△P<0.05

2.5 心肌細(xì)胞HE染色 光鏡下觀察Con組心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰,肌纖維呈短柱狀,相互連接成網(wǎng),排列整齊致密,橫紋清晰可見,細(xì)胞核居中呈圓形,大小均一(圖1-A);DM組心肌纖維減少、斷裂且排列紊亂,大量橫紋消失或模糊,細(xì)胞核增大,有固縮的細(xì)胞核,間質(zhì)增生,炎細(xì)胞浸潤(圖1-B);IN組心肌纖維結(jié)構(gòu)尚清晰,部分排列紊亂,橫紋可見,可見少量固縮的細(xì)胞核,間質(zhì)輕度增生性反應(yīng)(圖1-C)。

注:A:Con組;B:DM組;C:IN組圖1 大鼠心肌細(xì)胞HE染色(×200)

3 討論

DCM是一種不可逆的慢性心肌損害。近年來國內(nèi)外研究表明DCM存在氧化應(yīng)激。長期的高糖高脂損害,使心肌細(xì)胞的線粒體在能量代謝過程中產(chǎn)生過多的氧自由基(ROS),從而消耗大量的ROS清除劑SOD、GSH,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化而產(chǎn)生MDA。過量的ROS一方面造成心肌細(xì)胞自由基損傷,使心肌細(xì)胞能量代謝障礙,脂肪酸氧化增加;另一方面過多的ROS可能通過磷酸化激活A(yù)kt、JAK/STAT等多種通路上調(diào)IL-6的表達(dá)[3-4]。IL-6是一種多肽物質(zhì),可由免疫細(xì)胞、損傷心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌。正常情況下,體內(nèi)存在一定低水平的IL-6以維持促進(jìn)生長和分化等多種生理功能。而持續(xù)過量的IL-6會(huì)破壞細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致心肌細(xì)胞炎性損傷[5-6]。這種作用是通過IL-6及其受體(IL-6R)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。IL-6R由兩種不同的膜蛋白組成,即特異性配基結(jié)合鏈IL-6Rα和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈gp130。IL-6與IL-6Rα結(jié)合,再與gp130連接,形成gp130同源二聚體,通過gp130亞單位激活細(xì)胞內(nèi)JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使STAT磷酸化聚合為復(fù)合體,進(jìn)入胞核中,與靶基因啟動(dòng)子序列的特定位點(diǎn)結(jié)合,促進(jìn)更多炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄,造成細(xì)胞損傷[7]。心肌細(xì)胞存在大量的gp130,是IL-6作用的靶細(xì)胞,大量炎癥介質(zhì)釋放導(dǎo)致心肌纖維破壞,心肌肥厚,間質(zhì)纖維化。

本實(shí)驗(yàn)采用小劑量STZ部分破壞了大鼠胰島導(dǎo)致胰島素產(chǎn)生不足,配以高脂飼養(yǎng)產(chǎn)生胰島素抵抗,較好地模擬了T2DM的疾病特點(diǎn)。根據(jù)黃昶荃等[8]采用小劑量的STZ配合高脂飼料喂養(yǎng),誘導(dǎo)2型糖尿病模型,成模8周后即出現(xiàn)DCM。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DM組大鼠出現(xiàn)“三多一少”的典型糖尿病癥狀,血糖增高,心體比(HW/BW)增加,提示DM組大鼠存在心臟肥大。在光鏡下DM組心肌纖維明顯減少且排列紊亂,間質(zhì)反應(yīng)性增生,與DCM的心肌病理變化一致。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DM組MDA高于Con組,SOD、GSH低于Con組,表明DM組大鼠體內(nèi)存在氧化應(yīng)激,生成過多的ROS,大量消耗了SOD、GSH,過氧化脂質(zhì)生成過量的MDA。同時(shí)DM組IL-6亦顯著高于Con組,表明IL-6在DM組大鼠中過度表達(dá),過量的IL-6會(huì)造成心肌炎性損傷,因此光鏡下看到DM組較Con組心肌組織損害加重。

經(jīng)胰島素干預(yù)后,IN組大鼠的血糖、HW/BW顯著低于DM組,光鏡下心肌纖維的結(jié)構(gòu)和間質(zhì)增生情況均較DM組有所改善,提示胰島素可減輕糖尿病心肌病大鼠的心肌損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IN組MDA、IL-6水平低于DM組,高于Con組;SOD、GSH高于DM組,低于Con組;表明胰島素干預(yù)后,IN組氧化應(yīng)激減輕,IL-6表達(dá)降低,提示胰島素存在降糖之外的作用。相關(guān)研究表明:一方面胰島素能減輕氧化應(yīng)激,如通過其信號(hào)傳導(dǎo)通路降低線粒體產(chǎn)生的活性氧水平[9]、上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的表達(dá),從而消除過多的ROS[10];另一方面胰島素可通過ERK通路、PI3K/FOXO-1通路影響STAT轉(zhuǎn)錄,阻斷IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,抑制炎癥介質(zhì)的生成,從而抑制炎性反應(yīng),發(fā)揮保護(hù)作用[11-12]。

綜上,本實(shí)驗(yàn)研究顯示DCM大鼠體內(nèi)存在氧化應(yīng)激和過度表達(dá)的IL-6,造成心肌炎性損傷和氧化損傷。氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)可能相互促進(jìn),共同參與了2型糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制。而胰島素具有抗炎、抗氧化等降血糖之外的作用,從而抑制炎性反應(yīng),發(fā)揮保護(hù)心肌的作用。這些作用機(jī)制還有待更深入的研究和發(fā)掘,為以后疾病治療提供新的思路和策略。

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Effect of insulin on myocardial protection in type 2 diabetic rats with cardiomyopathy

LIUYa-ling,ZHOUChen,PANXiao-dong,YINDong-hua.
DepartmentofCadresofHealth,JiangsuProvinceOfficialHospital,Nanjing210024,China

Objective To investigate the influence of insulin on oxidative stress and interleukin-6(IL-6) in type 2 diabetic rats with cardiomyopathy. Methods Sixteen male Wistar rats were induced to type 2 diabetes(T2DM) by streptozotocin(STZ) and high fat diet. They were randomly divided into intervention group (IN group,n=8) and diabetes mellitus group (DM group,n=8). Another eight rats fed with ordinary diet were chosen as normal control group (Con group,n=8). Novolin 30R was subcutaneously injected to the IN group in the first week, while the DM group and the Con group

the same amount of saline by subcutaneous injection. Eight weeks later the levels of superoxide dismutase (SOD), glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA) and IL-6 were compared among the three groups, and the pathological changes of myocardial cells were observed. Results HE staining showed that the cardiac muscle fibers in DM group was decreased and disarranged and cross striation disappeared, with karyopyknosis or enlarged nuclear. At the same time interstitial reactive proliferation were also observed in DM group. Compared with Con group, the levels of blood glucose, HW/BW, MDA and IL-6 were higher (P<0.05) in DM group; while the levels of SOD and GSH were lower (P<0.05). The above indexes were all improved in IN group than those in DM group(P<0.05). Conclusions Insulin has the anti-inflammatory and anti-oxidative effects in myocardial cells in diabetic cardiomyopathy rats.

insulin; IL-6; oxidative stress; diabetes mellitus; cardiomyopathy

210024江蘇省南京市，江蘇省省級(jí)機(jī)關(guān)醫(yī)院干部保健科

周辰，Email:zcly789@sina.com

R 587.2

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.08.009

2016-03-25)