喬朋艷劉洪臣

·論著·

高齡老年人牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)與生物學(xué)特性分析實(shí)例報(bào)告

喬朋艷劉洪臣

目的：對(duì)高齡老年人牙髓干細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，探討其生物學(xué)特性。方法：應(yīng)用聯(lián)合酶消化法，分離培養(yǎng)一例88歲老年男性患者右上第三磨牙的牙髓細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)并傳代，流式分析鑒定，體外培養(yǎng)觀察細(xì)胞的形態(tài)、增殖、分化能力。結(jié)果：首次成功分離培養(yǎng)高齡老年人牙髓干細(xì)胞；倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞透亮，呈長(zhǎng)梭形；流式細(xì)胞學(xué)分析顯示，體外培養(yǎng)的老年人牙髓干細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記CD73、CD90、CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD14、CD19、CD34、CD45及HLA-DR；細(xì)胞活力良好，可成骨向分化。結(jié)論：高齡老年人牙髓組織中存在牙髓干細(xì)胞，活力良好，具有一定的分化潛能。

牙髓干細(xì)胞；再生醫(yī)學(xué)；組織工程；高齡老年人；高齡老年人牙髓干細(xì)胞

老年人因牙周病、外傷、腫瘤以及系統(tǒng)性疾病所致牙頜面缺損的人群患病率高[1，2]，剩余骨量不足、骨質(zhì)不佳，嚴(yán)重影響其種植修復(fù)與功能重建[3]，干細(xì)胞介導(dǎo)的種植區(qū)骨增量與骨結(jié)合為重點(diǎn)探討的問(wèn)題，獲得生物學(xué)性能良好的自體種子干細(xì)胞一直為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[4]。

美國(guó)學(xué)者Gronthos等，于2000年首次發(fā)現(xiàn)和命名人牙髓干細(xì)胞(Dental pulp stem cells，DPSCs)[5]，這是一類存在于人體牙髓組織中具有較強(qiáng)自我更新和多向分化潛能的未分化細(xì)胞或前體細(xì)胞，屬間充質(zhì)干細(xì)胞，在合適的體內(nèi)或體外環(huán)境下可分化為多種人體細(xì)胞，為組織、器官修復(fù)和自體、異體移植的細(xì)胞治療等提供細(xì)胞來(lái)源[6-9]。

研究發(fā)現(xiàn)，牙髓干細(xì)胞取材方便、易于獲得和保存，其增殖和分化能力優(yōu)于自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow stem cells，BMSCs)[8,10-12]。但也有研究顯示：不同年齡、來(lái)源及代數(shù)的干細(xì)胞生物學(xué)活性或有差異[13,14]；對(duì)干細(xì)胞基因組、端粒、細(xì)胞周期抑制因子、線粒體等相關(guān)分子機(jī)制的研究表明，干細(xì)胞亦存在增齡性功能下降，表現(xiàn)為干細(xì)胞數(shù)量的減少和分化方向的改變[15]。本課題組前期研究亦證實(shí)，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化能力隨年齡的增加而顯著下降，成脂分化能力增強(qiáng)，但因胚層起源不同其活性及受年齡影響的程度存在差異：老年人頜骨來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，來(lái)自外胚層神經(jīng)嵴，其增殖和成骨分化特性優(yōu)于四肢骨來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[14]，可修復(fù)下頜骨臨界骨缺損。因此，保持干細(xì)胞的活力、延緩干細(xì)胞衰老及延長(zhǎng)干細(xì)胞的壽命具有重要意義。牙髓干細(xì)胞的數(shù)量和生物學(xué)特性隨年齡變化的規(guī)律是什么，高齡老年人牙髓干細(xì)胞可否作為組織再生修復(fù)的種子細(xì)胞，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)研究報(bào)道。因此，本研究擬分離培養(yǎng)高齡老年人牙髓干細(xì)胞(Geriatric dental pulp stem cells,GDPSCs)，觀察細(xì)胞的形態(tài)、增殖、分化等生物學(xué)特性，探索其未來(lái)在臨床應(yīng)用的可能性。

1.材料與方法

1.1 離體牙收集經(jīng)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，臨床搜集1例88歲老年男性患者右上第三磨牙，牙齒拔出后，立即放入預(yù)冷含2倍培養(yǎng)濃度雙抗(100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素)的α-MEM培養(yǎng)基中(Invitogen，美國(guó))。

1.2 原代細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌條件下劈開(kāi)牙齒，取出牙髓，切除根尖部約2 mm牙髓組織，0.01M的滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后剪成大小約1mm×1mm×1mm的組織塊，0.3%的I型膠原酶(Worthington Biochemical Corp.，美國(guó))和0.4%的中性蛋白酶Dispase II(Sigma，美國(guó))(1∶1)37℃消化1h，輕輕吹打離散單細(xì)胞團(tuán)塊，將形成的單細(xì)胞懸液通過(guò)孔徑為70μm的細(xì)胞篩網(wǎng)，800r/min離心5min，將細(xì)胞沉淀用含20%胎牛血清(FBS，Invitogen，美國(guó))+100U/ml青霉素+100mg/ml鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液重懸，以1×104-1×105/mL密度接種于5mL培養(yǎng)瓶(Corning，美國(guó))中，置于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，24h首次換液，以后每3天換液。光鏡觀察分離培養(yǎng)的該例高齡老年人牙髓干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí)，2.5g/L的胰酶(Invitogen，美國(guó))消化傳代。

1.3 流式分析鑒定選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P4代DPSCs，制備細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，使用人間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記檢測(cè)試劑盒(BD，美國(guó))，按說(shuō)明書要求，在標(biāo)號(hào)為①-⑧的1.5 mL的EP管中，依次加樣如下：

①5μL CD90 FITC+100μL細(xì)胞懸液

②5μL CD44 PE+100μL細(xì)胞懸液

③5μLCD105PerCP-Cy5.5+100μL細(xì)胞懸液

④5μL CD73 APC+100μL細(xì)胞懸液

⑤100μL細(xì)胞懸液

⑥20μL Neg+20μL Pos isotype control cocktails+100μL細(xì)胞懸液

⑦20μL Neg+20μL Pos marker cocktails+ 100μL細(xì)胞懸液

⑧20μLPosmarker cocktail+5μLPEdrop in+ 100μL細(xì)胞懸液

室溫避光孵育30分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定。

1.4 細(xì)胞活性分析取生長(zhǎng)良好的P4代細(xì)胞，在96孔板中接種100μL濃度為2×104cells/ml細(xì)胞懸液，即2000個(gè)細(xì)胞/孔，每板設(shè)10個(gè)復(fù)孔(n=10)，共接種10塊96孔板，置于培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)，分別在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天觀察細(xì)胞增殖情況。使用CCK-8(Dojindo，日本)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖特性，向每孔加入10μL CCK-8溶液，放回培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時(shí)，每孔取上清100μL放入一塊新的96孔板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm的吸光度值，繪制生長(zhǎng)曲線，測(cè)定細(xì)胞增殖情況。

1.5 多向分化潛能①成骨向分化，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P4代DPSCs，以2×105個(gè)/孔接種于六孔培養(yǎng)板里(n=4)，常規(guī)換液。待細(xì)胞達(dá)到約80%融合時(shí)，加入成骨誘導(dǎo)液(Cyagen Biosciences，Guangzhou China)，每3天換液，2周后終止誘導(dǎo)，茜素紅染色；②成脂向分化：選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P4代DPSCs，以2×105個(gè)/孔接種于六孔培養(yǎng)板里(n=4)，常規(guī)換液。待細(xì)胞達(dá)到約100%融合時(shí)，加入成脂誘導(dǎo)液(Cyagen Biosciences，Guangzhou China)，首先使用A液誘導(dǎo)3天，換B液誘導(dǎo)1天，如此A液和B液交替作用，3周后終止誘導(dǎo)，油紅-O染色。

2.結(jié)果

2.1 細(xì)胞原代培養(yǎng)及傳代聯(lián)合酶消化法獲取的該例高齡老年人牙髓干細(xì)胞，在轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶培養(yǎng)24小時(shí)后首次換液，即可見(jiàn)細(xì)胞貼壁，但數(shù)量較少，呈現(xiàn)克隆式貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)的原代細(xì)胞(P0)生長(zhǎng)達(dá)80%融合的時(shí)間約為10天，1瓶傳3瓶培養(yǎng)，至P1細(xì)胞生長(zhǎng)再次達(dá)80%融合的時(shí)間則為3-4天，細(xì)胞透亮、形態(tài)為長(zhǎng)梭形，圖1為傳代培養(yǎng)的P1、P4代DPSCs。

圖1 分離培養(yǎng)的DPSCs，A：P1代，B：P4代

2.2 流式分析鑒定流式細(xì)胞學(xué)分析顯示，體外培養(yǎng)的該例高齡老年人牙髓干細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記CD73、CD90、CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD14、CD19、CD34、CD45及HLA-DR(圖2)。

圖2 DPSCs流式分析鑒定結(jié)果

2.3 細(xì)胞活性分析使用CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，在接種后的1-2天為生長(zhǎng)遲滯期，3-7天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，7天達(dá)到平臺(tái)期，9天之后開(kāi)始進(jìn)入衰退期(圖3)。

圖3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果

2.4 分化能力觀察

2.4.1 成骨向分化經(jīng)過(guò)2周的體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，使用茜素紅染色，肉眼可見(jiàn)鈣化，光鏡觀察可見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)形成(圖4、5)。

圖4 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，茜素紅染色，肉眼觀察

2.4.2 成脂向分化經(jīng)過(guò)3周的體外成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后，使用油紅-O染色，光鏡下觀察，見(jiàn)少量脂滴樣物質(zhì)形成(圖6)。

圖5 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，茜素紅染色，光鏡下觀察，可見(jiàn)鈣化結(jié)節(jié)形成(箭頭)

圖6 誘成脂導(dǎo)培養(yǎng)3周后，油紅-O染色，見(jiàn)少量脂滴樣物質(zhì)形成

3.討論

3.1 分離、培養(yǎng)及鑒定研究者一般從臨床拔除的智齒、正畸減數(shù)牙、無(wú)治療價(jià)值的牙周炎患牙、多生牙以及牙髓炎患牙拔除的牙髓組織中獲取人牙髓干細(xì)胞[6,7]。牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)主要有兩種方法：外植體法(the explant method，DPSC-OG)和牙髓組織酶消化法(the enzymatic digestion of pulp tissue method，DPSC-ED)[16]，本研究采用后者獲得研究所需牙髓干細(xì)胞，進(jìn)行貼壁培養(yǎng)和擴(kuò)增。使用細(xì)胞流式分析儀對(duì)CD73+、CD90+、CD105+、CD34-、CD45-、CD14-、CD19-和HLA-DR-等針對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定[17]，結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的該例高齡老年人的牙髓細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞(圖2)，間充質(zhì)干細(xì)胞主要表面標(biāo)記物均在該牙髓干細(xì)胞上陽(yáng)性表達(dá)，提示其擁有良好的增殖分化能力。

3.2 不同年齡來(lái)源牙髓干細(xì)胞的一般特性與對(duì)比分析研究表明，牙齒的年齡不同，所分離的牙髓干細(xì)胞展現(xiàn)的沿特定細(xì)胞系分化的特點(diǎn)和傾向或不同[13]；但最近有學(xué)者比較了年輕恒牙牙髓干細(xì)胞和乳牙牙髓干細(xì)胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs)，提示不同來(lái)源、不同年齡的牙齒來(lái)源干細(xì)胞(Dental stem cells，DSCs)在細(xì)胞形態(tài)、增值速度、細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)、分化潛能方面表現(xiàn)相似。恒牙牙髓干細(xì)胞和乳牙牙髓干細(xì)胞，從臨床應(yīng)用的角度來(lái)說(shuō)，應(yīng)該是同等的機(jī)會(huì)[18]。許多使用恒牙牙髓干細(xì)胞與乳牙牙髓干細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比的體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果均顯示二者的效果相似；甚至有研究顯示，恒牙牙髓干細(xì)胞的體外可傳代次數(shù)更多，而其成骨能力等生物學(xué)特性不受影響[18]。Laino等研究了45歲人牙髓干細(xì)胞，其生物學(xué)性能仍良好[17]。Wu等比較了4-8歲、12-20歲、32-49歲及55-67等幾個(gè)年齡組的人牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)特性，結(jié)果為，較其他組，55-67歲年齡組牙髓干細(xì)胞活性及分化能力部分減弱[19]，但并未見(jiàn)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步比較研究。本研究首次成功分離的該例高齡老年人牙髓干細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示，在接種后的1-2天為生長(zhǎng)遲滯期，3-7天細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，7天達(dá)到高峰，之后處于平臺(tái)期，隨著細(xì)胞的繼續(xù)增殖出現(xiàn)接觸抑制，第9天進(jìn)入衰退期(圖3)，符合一般細(xì)胞學(xué)的生長(zhǎng)規(guī)律；體外誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果顯示出其一定的多向分化能力(圖4-6)。

3.3 牙髓干細(xì)胞的應(yīng)用研究牙髓干細(xì)胞目前被廣泛應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)研究。有學(xué)者預(yù)測(cè)，牙髓組織將成為整形外科、口腔及口腔頜面外科組織重建、器官修復(fù)和臨床疾病治療的重要干細(xì)胞來(lái)源[18,20]，拔除的第三磨牙、正畸減數(shù)牙、多生牙等將不再被視作醫(yī)療廢棄物[21-23]。目前，牙髓干細(xì)胞主要用于牙齒及頜骨組織、肌肉、骨骼系統(tǒng)組織的修復(fù)及再生研究，已有牙髓干細(xì)胞用于糖尿病所致嚴(yán)重肢體缺血壞死、骨壞死所致骨缺損、燒傷所致皮膚損傷的再生以及肝臟、神經(jīng)、骨骼肌肉、血管及皮膚再生的報(bào)道[24-27]，顯示出良好的應(yīng)用前景。

此外，牙髓干細(xì)胞或可用于一些系統(tǒng)性疾病的免疫調(diào)節(jié)治療。研究顯示，干細(xì)胞具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠通過(guò)誘導(dǎo)免疫耐受以及高表達(dá)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，降低炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的組織損傷，有利于損傷組織的恢復(fù)和預(yù)后改善[28]，牙髓干細(xì)胞現(xiàn)已被應(yīng)用于多種疾病的免疫調(diào)節(jié)治療，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化癥[29,30]等，受試對(duì)象在接受干細(xì)胞或其分泌物治療后，相關(guān)癥狀得以緩解。未來(lái)，2型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等亦有望通過(guò)牙髓干細(xì)胞進(jìn)行治療[31,32]。研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞治療的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制更宏觀和多元化，干細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)后會(huì)較快發(fā)生凋亡，凋亡過(guò)程中的干細(xì)胞與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用，引發(fā)系列鏈狀反應(yīng)，細(xì)胞活性越好，與機(jī)體相互作用越強(qiáng)[29-32]。因此，活性更好的牙髓干細(xì)胞在上述疾病的治療中可發(fā)揮更大的作用。

綜上所述，分離培養(yǎng)的該例高齡老年人牙髓干細(xì)胞具備一定的增殖、分化潛能，尚需要進(jìn)一步的體內(nèi)、外系統(tǒng)對(duì)照研究，并對(duì)老年人牙髓干細(xì)胞的活力、干細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)分子(端粒酶活性、細(xì)胞周期抑制因子等)、多向分化能力及調(diào)控進(jìn)行深入研究，為臨床獲取、存儲(chǔ)及調(diào)控老年人牙髓干細(xì)胞用于組織再生修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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The preliminary research on geriatric dental pulp stem cells from an 88-year-old man

QIAO Peng-yan,LIU Hong-chen(Instituteof Stomatology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China)

Objective:To isolate and obtain dental pulp stem cells(DPSCs)from the oldest-old and explore their biological functions.Methods:The dental pulp cells from an 88-year-old male patient’s upper third molar were isolated using the enzymatic digestion ofpulp tissue method,cultured,passaged and analyzed byflow cytometry.Cell morphology,proliferation and differentiation ability were observed in vitro.Results:It is the first to successfully isolated,cultured and passaged the geriatric dental pulp stem cells(GDPSCs).The morphology of the cells were spindle or exhibited several pseudopods under inverted phase contrast microscope and were positive for human multipotent mesenchymal stromal cells(MSCs)surface markersCD73,CD90,and CD105,butnegative forCD14,CD19,CD34,CD45 and HLA-DR.These cellsalso exhibited good self-renewal abilityand multilineage differentiation potential.Conclusion:DPSCs can be isolated from the pulp tissues of the oldest-old and present well proliferation and differentiation potentials.

dental pulp stem cells;regenerative medicine;tissue engineering;oldest-old;geriatric dental pulp stem cells

R787

A

1672-2973(2017)04-0193-05

2017-04-10)

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃) (項(xiàng)目編號(hào)：2015AA033502)

喬朋艷解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所博士后北京100853

劉洪臣通訊作者解放軍總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所所長(zhǎng)主任醫(yī)師教授北京100853