岳川，曹紅利，郝心愿，郭玉瓊，葉乃興，王新超*，楊亞軍*

1. 福建農(nóng)林大學園藝學院/茶學福建省高校重點實驗室/中國烏龍茶協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350002；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心/農(nóng)業(yè)部茶樹生物學與資源利用重點實驗室, 浙江 杭州 310008

茶樹CsASR基因的克隆及其表達分析

岳川1,2，曹紅利1,2，郝心愿2，郭玉瓊1，葉乃興1，王新超2*，楊亞軍2*

1. 福建農(nóng)林大學園藝學院/茶學福建省高校重點實驗室/中國烏龍茶協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350002；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心/農(nóng)業(yè)部茶樹生物學與資源利用重點實驗室, 浙江 杭州 310008

逆境脅迫影響茶樹生長發(fā)育及茶葉品質(zhì)，ASR（abscisic acid, stress, ripening-induced）基因在植物抗逆響應(yīng)中具有重要功能。本研究以龍井43品種茶樹為材料，從中克隆了CsASR基因的全長cDNA序列、基因組序列及其啟動子序列，分析了該基因的生物信息學特征及在組織間和不同脅迫處理下的表達模式。結(jié)果顯示，CsASR的cDNA序列全長875 bp，含有546 bp的ORF序列，編碼181個氨基酸，蛋白質(zhì)分子量19.89 kD，理論等電點 5.69；CsASR蛋白結(jié)構(gòu)序列中 74.5%的序列為無序結(jié)構(gòu)，是一種無序蛋白；CsASR的 C-端含有ABA/WDS功能結(jié)構(gòu)域，主要定位于細胞質(zhì)和細胞核中；茶樹CsASR與海棗的ASR相似性最高，為87%，而在進化樹中與棗的關(guān)系最近。CsASR基因含2個外顯子，第1個外顯子長363 bp，第2個外顯子長183 bp，內(nèi)含子較大為2 750 bp，內(nèi)含子中含7種簡單重復(fù)序列和2種DNA轉(zhuǎn)座子序列?？寺～@得起始密碼子ATG上游2 554 bp的啟動子區(qū)序列，該啟動子上含有干旱、低溫、高溫以及ABA等相關(guān)的順式作用元件。CsASR在根中的表達量最低；ABA抑制 CsASR的表達，而干旱、NaCl和低溫脅迫能夠顯著上調(diào) CsASR的表達。表明CsASR基因可能與茶樹抗逆密切相關(guān)。

茶樹；ASR基因；逆境脅迫；基因克隆

逆境脅迫，如干旱、低溫等嚴重影響植物的生長。植物在遭受逆境脅迫時，能夠誘導(dǎo)逆境響應(yīng)基因表達，適應(yīng)不利的環(huán)境條件。ASR（abscisic acid, stress, ripening-induced）基因是在植物中新發(fā)現(xiàn)的一種逆境響應(yīng)特異基因。從Iusem等[1]于1993年發(fā)現(xiàn)ASR基因到目前為止，大量的研究顯示，ASR基因在植物逆境脅迫響應(yīng)和生長發(fā)育調(diào)控中都有重要的作用。ASR是一類由少數(shù)多基因家族編碼的小蛋白（300個氨基酸以下），編碼蛋白分子量在11.0～33.0 kD。其蛋白富含組氨酸、谷氨酸和賴氨酸，具有較高的親水性，這對其在逆境脅迫下的作用發(fā)揮起關(guān)鍵作用[1-2]。它屬于ABA/WDS蛋白家族中一類特異的蛋白亞家族，該家族蛋白與植物抵御滲透脅迫等逆境響應(yīng)密切相關(guān)，ASR的 C-端含有保守的ABA/WDS功能結(jié)構(gòu)域，是 ASR蛋白的重要結(jié)構(gòu)特征。

鑒于ASR在植物中的重要功能，目前，多種植物中的 ASR基因已被鑒定并開展了較深入的研究。大部分植物中的 ASR基因家族成員主要在5個左右，如番茄中含有5個[3]，蘋果中有5個[4]，玉米中最多為9個[5]，而在擬南芥中沒有發(fā)現(xiàn) ASR同源基因。基因功能研究顯示，ASR既可以作為轉(zhuǎn)錄因子在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活基因表達，也能夠在胞質(zhì)中作為分子伴侶起作用[6-11]。大量研究表明，在擬南芥植物中過表達 ASR基因能夠提高植物對低溫、干旱、高鹽等非生物及多種病害的抵御能力。Virlouvet等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在缺水條件下 ZmASR1能夠影響支鏈氨基酸的生物合成等代謝，進而提高玉米的籽粒產(chǎn)量。Saumonneau等[12]和 Jia等[6]的研究顯示，ASR參與 ABA和糖信號介導(dǎo)的植物生長發(fā)育。Arenhart等[9,13-14]的一系列研究表明，OsASR5在水稻抵御鋁毒害中具有重要的功能。Sun等[15]最新研究發(fā)現(xiàn) 1個在香蕉雌花中特異表達的MaASR基因，過表達該基因延遲轉(zhuǎn)基因植株的開花時間。從以上研究結(jié)果可以看出，ASR在植物中具有廣泛的功能，該基因在植物抗逆等生理活動中具有廣闊的研究前景和應(yīng)用價值。

然而，茶樹中有關(guān) ASR基因的信息未見報道。前期，我們從茶樹冷馴化和低溫脅迫等轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出大量與茶樹抗寒等逆境響應(yīng)相關(guān)的基因，其中獲得 1條ASR的同源序列。在此基礎(chǔ)上，本研究首先克隆了茶樹CsASR基因的cDNA全長序列，并擴增獲得了該基因的基因組序列，然后通過 Genome Walker擴增獲得了它的啟動子序列，對CsASR基因的基本生物信息學特征分析，檢測了CsASR在不同組織和低溫、干旱、ABA和鹽脅迫下的表達模式。研究結(jié)果為茶樹抗逆功能基因研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 茶樹總 RNA提取、cDNA合成及基因組DNA提取

參照文獻[16]的方法，用0.5～1.0 g茶樹樣品為材料，提取總RNA，測定其RNA濃度及電泳檢測完整性后，逐步稀釋調(diào)整質(zhì)量濃度到1 μg·μL-1，于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

按照SMART RACE試劑盒（Clontech，Mountain View，USA）的說明，分別用 1 μg茶樹總 RNA 為模板，合成 5′-和 3′-的 cDNA鏈，用于RACE-PCR擴增全長；用1 μg茶樹總 RNA為模板，根據(jù) SuperScript Ⅲ試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，USA）的操作說明，合成cDNA用于熒光定量PCR（qRT-PCR）和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）。

按照天根植物DNA提取試劑盒（DP305-2）的操作說明提取茶樹基因組 DNA，在Nanodrop2000中檢測 DNA的純度并測定濃度，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，檢測合格的DNA樣品置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 CsASR基因的全長cDNA克隆

將茶樹轉(zhuǎn)錄組中的 ASR基因序列片段在NCBI中進行BLASTx比對分析，結(jié)果顯示缺少 3′-端。以該序列為模板，設(shè)計 3′-RACE特異引物CsASR-3：AGACCACCAACGCCTAT GGAAGC，進行 RACE擴增。實驗方法參照SMART RACE試劑盒的說明進行，50 μL反應(yīng)體系，PCR條件為94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物回收純化后，連接到PMD18-T表達載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，于氨芐固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，隨機挑取2個陽性克隆進行測序。測序結(jié)果與原片段進行拼接，初步獲得全長cDNA序列，在ORF兩端設(shè)計RT-PCR引物CsASR-F：CACAATGG CCGAAGAGAAGCA和CsASR-R：AAAGAG GTGGTGGTGCTTC，驗證該序列的準確性，并最終獲得該基因的全長cDNA序列。

1.3 CsASR全長基因組序列和啟動子擴增

參照已獲得的CsASR全長cDNA序列，用龍井 43茶樹品種的 DNA為模板，利用PrimeSTAR HS試劑盒，以步驟 1.2中的RT-PCR引物擴增基因組全長序列，50 μL PCR反應(yīng)體系。參考其他植物中ASR基因的全長，設(shè)置 PCR擴增程序為：98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 3 min，30 個循環(huán)后 72℃反應(yīng) 5 min。PCR產(chǎn)物回收測序，獲得目的基因的基因組序列。

以 CsASR基因組序列為模板，按照Clontech公司的GenomeWalker 2.0試劑盒操作步驟，先構(gòu)建克隆啟動子的DNA酶切文庫，參照實驗要求設(shè)計啟動子擴增引物CsASR-P1：TGGTGGTGTCACCATATCCGGT GGTGG和CsASR-P2：CTCTTCGGCCATTG TGGTGCTGATCGG，采用試劑盒推薦的體系和程序進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物電泳檢測后，回收測序，獲得基因的啟動子序列。

1.4 CsASR基因的生物信息學分析

用 DNAStar軟件包對序列進行拼接；用DNAMAN軟件進行開放閱讀框查詢；核酸序列及氨基酸序列分別在 NCBI數(shù)據(jù)庫中用BLASTn和BLASTx分析；將序列用ClustalW比對后，在CLC6.0中輸出同源比對結(jié)果并在MEGA6.0軟件中用鄰近相連法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；用EXPASY（http://expasy.org/tools）中的TargetP、ProtParam、SingalP等工具對氨基酸序列進行生物信息學分析；NetPhos 2.0 server預(yù)測磷酸化位點；N-糖基化位點和蛋白激酶位點在PROSCAN. BASE （http://npsa-pbil.ibcp.fr）中預(yù)測；FoldIndex（http://bioportal.weizmann.ac.il/fldbin/findex）用于分析序列的可折疊特性；SWISS-MODEL模擬蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，Pymol編輯輸出。

基因的轉(zhuǎn)錄起始位點、外顯子和內(nèi)含子所在位點等信息在 Augustus（http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/submission）中預(yù)測，基因結(jié)構(gòu)在GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn）中顯示。內(nèi)含子重復(fù)序列及轉(zhuǎn)座子序列在RepeatMasker（http://www.repeatmasker.org）中進行預(yù)測分析，CpG島在 MethPrimer（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）中預(yù)測，獲得的啟動子序列先在NCBI中用BLASTn方法比對分析后，在PlantCARE（http://bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html）中對啟動子序列所含順式作用元件進行預(yù)測分析。

1.5 CsASR基因的表達模式分析

以生長健壯的 2年生盆栽龍井 43茶樹為材料，參照Yue等[17]的方法進行低溫（4℃）、ABA（100 μmol·L-1）、高鹽（250 mmol·L-1NaCl）和干旱（10% PEG-6000）處理。調(diào)節(jié)人工氣候室溫度并使之維持在(4±1)℃，將生長在另一溫室(25±2)℃中的茶樹迅速移入低溫氣候室中，進行低溫處理，并于 0、2、8、24 h時分別從至少3株茶苗上取枝條頂端第2～3片成熟葉為材料；用超純水配制 100 μmol·L-1濃度的ABA溶液，均勻噴灑茶樹葉片上，分別在0、2、8、24 h時取枝條頂端第2～3片成熟葉為材料；用純凈水配制250 mmol·L-1的NaCl溶液，采用澆灌方式將溶液緩慢注入盆中，直至澆透，并有大量溶液從底部流出，來對茶苗進行鹽脅迫處理，并于0、8、24 h時取枝條頂端第2～3片成熟葉為材料；將茶苗從土中取出，用自來水洗凈根部土壤后，迅速置于純凈水配制的 10% PEG-6000溶液中，分別在 0、2、8 h時取樣后，用自來水將根部PEG去除，并于純凈水中恢復(fù)，在恢復(fù)48 h時取樣，用于檢測目的基因在干旱脅迫后復(fù)水過程的表達模式。每個處理進行3次生物學重復(fù)。于2013年10月取生長健壯并有花芽開放的茶苗5盆，先取頂端第 2～3片成熟葉、頂芽下 1 cm莖段及全開的茶花，然后將茶苗從盆中取出，先后用自來水和純凈水沖洗除去泥土，迅速剪下幼嫩根。從5盆茶苗上取下的組織混勻后再分別分成3份。所有樣品液氮速凍后保存于－80℃，提取RNA，檢測基因的表達模式。

根據(jù)序列特異性，設(shè)計 qRT-PCR引物qASR-F：AAGCCCATCGATTCAGCTCC 和qASR-R：TTCCATAGGCGTTGGTGGTC，以茶樹polypyrimidine tract-binding protein 1 (PTB1)基因[18]作為內(nèi)參基因，按照 SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TAKARA公司）的操作步驟，采用20 μL體系于ABI PRISM7500實時定量PCR儀上檢測目的基因的表達水平。PCR主要程序為：95℃ 15 s，94℃ 5 s，60℃ 34 s，共 40 個循環(huán)，結(jié)果采用 2-ΔΔCT算法進行分析，并用SPSS17.0對數(shù)據(jù)顯著性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsASR基因的cDNA全長克隆及生物信息學特征分析

RACE-PCR擴增獲得茶樹CsASR基因的3′-端638 bp序列（圖1-A），與原目的片段拼接獲得全長 cDNA序列。該 cDNA序列全長875 bp，其中 ORF序列長 546 bp（圖 1-B），編碼181個氨基酸，并提交GenBank（登錄號為：KF880380）。

2.1.1 CsASR的理化性質(zhì)預(yù)測分析

利用ProtParam對CsASR基因編碼的蛋白的特征進行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)的相對分子量較小，僅為 19.89 kD，分子式為C866H1272N250O292S1；含酸性氨基酸（Asp+Glu）34個，堿性氨基酸（Arg+Lys）18個，理論等電點 5.69，屬酸性蛋白；其半衰期較長，為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為 35.17，表明該蛋白質(zhì)的化學性質(zhì)相對穩(wěn)定。CsASR中富含甘氨酸（Gly，24個，占13.26%）、組氨酸（His，22個，占 12.15%）、谷氨酸（Glu，25個，占13.81%）、蘇氨酸（Thr，18個，占9.94%）、賴氨酸（Lys，16個，占 8.84%）和丙氨酸（Ala，15個，占8.29%）等氨基酸，這與其他植物中報道的 ASR的氨基酸組成比例相似[19]，與ASR蛋白功能密切相關(guān)。

2.1.2 CsASR的序列特征

CsASR的結(jié)構(gòu)具有較強的可變性。利用FoldIndex在線預(yù)測軟件對 CsASR的結(jié)構(gòu)折疊性進行預(yù)測，結(jié)果顯示，在序列中高達74.5%的氨基酸（即135個氨基酸位點）組成的結(jié)構(gòu)屬于無序結(jié)構(gòu)（圖 2），由其構(gòu)成的結(jié)構(gòu)具有較強的可變性，因此，CsASR是一個無序蛋白。

在NetPhos 3.1 Server中對CsASR所含磷酸化位點進行預(yù)測，結(jié)果顯示，該序列含 25個磷酸化位點，其中6個絲氨酸（Ser）位點、12個Thr和7個絡(luò)氨酸（Tyr）位點，約占全序列的13.8%，主要能夠被蛋白激酶C（PKC）、酪蛋白激酶Ⅰ（CKI）、酪蛋白激酶Ⅱ（CKII）和 SRC等蛋白激酶磷酸化；而PROSCAN.BASE中分別預(yù)測到 PKC、CKII和酪氨酸激酶磷酸化位點各為1、2、2個。同時，CsASR還含有8個N-糖基化位點，分別為第 29、42、43、65、67、70、78、112號位點上的甘氨酸（Gly）。

圖1 CsASR克隆電泳圖Fig. 1 Electrophoresis results of CsASR cloning

圖2 CsASR序列的折疊性預(yù)測Fig. 2 The folding characteristics of the CsASR protein

2.1.3 CsASR的亞細胞定位預(yù)測分析

TargetP1.1中的預(yù)測結(jié)果顯示，cTP、mTP、SP和 other的預(yù)測值分別為 0.123、0.118、0.102和 0.919，表明該基因定位在除葉綠體和線粒體外的其他亞細胞器的可能性較大；SignalP4.1中的預(yù)測結(jié)果顯示，該序列中不含信號肽輸出位點；WoLF PSORT預(yù)測的結(jié)果顯示其定位在細胞質(zhì)、細胞核、葉綠體和線粒體的K值分別為6、3、2和1，說明該基因定位在細胞質(zhì)和細胞核等亞細胞器上的可能性最大；綜合TargetP、SignalP和WoLF PSORT的預(yù)測結(jié)果，推測本研究獲得的CsASR可能定位在細胞質(zhì)和細胞核等亞細胞器中。

2.1.4 CsASR的序列聯(lián)配及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

在 NCBI數(shù)據(jù)庫中采用 BLASTX和BLASTP對該基因進行同源比對查找，結(jié)果顯示，未有茶樹等茶組植物中相關(guān)的序列與之匹配；且該基因與比對出的 ASR序列相似性較高，主要都在 50%以上，如與芭蕉（Musa balbisiana）、油棕（Elaeis guineensis）和蓖麻（Ricinus communis）的相似性分別為85%、84%和80%，其中與海棗（Phoenix dactylifera）的相似性最高，為87%。保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，CsASR中的第94位至第170位氨基酸序列為ABA/WDS超家族的保守結(jié)構(gòu)域，這是 ASR主要的特征功能域。

對來自不同物種中的 ASR氨基酸序列進行聯(lián)配分析，結(jié)果顯示，它們的 N-端序列保守性較低，但在N-端第4或第5個氨基酸后面均含有1個由6～8個組His構(gòu)成的保守結(jié)構(gòu)域，而該結(jié)構(gòu)域后的序列相似性較低，氨基酸序列長度變異較大；ASR的 C-端序列保守性較高，含有約90個氨基酸序列長度的保守域，在該保守域中，含有ASR特異的保守功能結(jié)構(gòu)域——ABA/WDS功能域以及1個富含His的功能域（圖3-A）。在MEME中對來自不同物種中的ASR的保守序列進行預(yù)測，結(jié)果顯示，在所預(yù)測的ASR序列中主要含有5個不同的保守結(jié)構(gòu)域，即 M1-M5，且它們在氨基酸序列上的排列順序均相似，其中M1和M2共同構(gòu)成了 ABA/WDS保守功能結(jié)構(gòu)域（圖3-B），這是ASR的特異結(jié)構(gòu)。

選取23種不同植物中的ASR構(gòu)建進化樹分析，結(jié)果顯示，這些ASR可以聚為2類，即Group A和Group B，其中茶樹CsASR聚在Group A中，且與棗（Ziziphus nummularia）的關(guān)系最近（圖4）。

2.2 CsASR基因的全長基因組序列和啟動子序列克隆及分析

以O(shè)RF兩端的引物進行PCR擴增獲得大小約 3 000 bp的條帶（圖 1-C），該片段序列測序后，獲得長度為3 278 bp的序列（GenBank登錄號：KY697275），在NCBI中進行BLASTn序列比對分析，結(jié)果顯示，該基因能夠與茶樹等植物中的 ASR基因的 cDNA序列匹配。在AUGUSTUS中對基因的結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果顯示該序列由1個內(nèi)含子和2個外顯子構(gòu)成，轉(zhuǎn)錄的cDNA序列經(jīng)比對結(jié)果為CsASR基因。2個外顯子中，第1個外顯子較大，長363 bp，第2個外顯子只有183 bp，內(nèi)含子較大，長2 750 bp（圖5）。在多種植物中，ASR主要由2個外顯子組成，但它們所含的內(nèi)含子較小，一般在800 bp以下，蘋果MdASR2的內(nèi)含子最長，為1 587 bp，但比CsASR的內(nèi)含子短（圖5）。對CsASR的內(nèi)含子分析顯示，該序列不含 CpG島；含有 7個不同類型的簡單重復(fù)序列，分別是(TATC)n、(ATT)n、(AT)n、(AAAT)n、(T)n、(TTTTAT)n和(TTTAATT)n，占內(nèi)含子序列長的12.15%，含2種DNA轉(zhuǎn)座子DNA/TcMar-Stowaway（2058-2144）和 DNA/CMC-EnSpm（2082-2153）。

圖3 不同植物中的ASR 序列聯(lián)配（A）及MEME 預(yù)測保守域（B）結(jié)果分析Fig. 3 Alignment of ASR (A) and motif prediction analysis using MEME database (B)

圖4 CsASR的進化樹分析Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of CsASR

圖5 ASR基因結(jié)構(gòu)分析Fig. 5 Structure analysis of the ASR genes

通過GenomeWalker方法，在EcoR V和Pvu II的酶切文庫中擴增出多條清晰片段（圖1-D），將大小在800 bp以上的條帶回收測序，測序結(jié)果拼接獲得2 539 bp的片段，該序列與基因組序列拼接后，獲得起始密碼子ATG上游2 554 bp的啟動子區(qū)（GeneBank登錄號：KY697274）。在PLANTCARE中對該序列所含順式作用元件進行預(yù)測，結(jié)果顯示，CsASR啟動子區(qū)含有多種與植物逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件，如干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的 MBS、低溫響應(yīng)相關(guān)的 LTR、高溫響應(yīng)相關(guān)的 HSE等，其中發(fā)現(xiàn)2個與ABA響應(yīng)相關(guān)的元件，分別在 ATG上游-1553和-2471；在該序列上還預(yù)測到多個與茉莉酸甲酯、乙烯、生長素等植物激素響應(yīng)相關(guān)的元件（表 1）；除了生物鐘 circadian元件外，該啟動子上還含有多個受光照調(diào)控的響應(yīng)元件。從啟動子區(qū)順式作用元件分析結(jié)果表明，該基因與茶樹的環(huán)境適應(yīng)密切相關(guān)。

表1 CsASR啟動子區(qū)與逆境響應(yīng)相關(guān)的主要順式作用元件預(yù)測Table 1 Prediction of the major stress-responsive cis-elements in the promoter ofCsASRgene

2.3CsASR基因的表達分析

采用qRT-PCR技術(shù)對CsASR基因的組織表達特異性及其在 ABA、干旱、高鹽和低溫脅迫下的表達進行了檢測，結(jié)果顯示，CsASR在 4種組織中具有表達，且在根中的表達最低，在莖和花中具有較高的表達量（圖6-A）；ABA處理后，CsASR的表達被顯著抑制，在24 h的處理過程中其表達量均顯著地低于對照；PEG模擬干旱脅迫處理后，CsASR被迅速誘導(dǎo)表達，8 h時表達量最高，達8.32，干旱恢復(fù)處理 48 h后該基因的表達量降低至4.52，但仍顯著高于處理前的水平；NaCl處理能顯著上調(diào)CsASR基因的表達，在 4 h和24 h時間點上檢測的表達量均是處理前的 2倍以上；同樣，低溫脅迫條件下CsASR的表達隨處理時間的延長逐漸升高，在 24 h達到最大，為3.17（圖 6-B～圖6-E）。表明該基因可能參與茶樹抗逆響應(yīng)。

3 討論

ASR基因是一類受干旱誘導(dǎo)的基因。本研究中，我們首先克隆了茶樹CsASR基因的全長 cDNA序列，該基因編碼 181個氨基酸序列，分子量為 19.98 kD，其大小與多種植物中的ASR大小相當。ASR是植物特有的一類小分子蛋白，其蛋白質(zhì)大小主要在 200個氨基酸以下[1]。從香蕉、番茄、二穗短柄草、蘋果、谷子等植物中的ASR基因家族的編碼蛋白大小的結(jié)果中可以看出，幾種植物中已鑒定出的最小ASR僅編碼101個氨基酸（谷子 ASR6，Si011429），番茄 ASR4最大，也僅編碼297個氨基酸[3-4,20-22]。CsASR在C-端具有90個氨基酸左右的保守域，該保守域中包含了 ABA/WDS功能域，該功能域是干旱響應(yīng)相關(guān)基因編碼蛋白特有的一種結(jié)構(gòu)域，所有的ASR等均含有此功能域[1]。CsASR的生物信息學預(yù)測顯示，它既可以定位在胞質(zhì)也可以在細胞核內(nèi)，說明CsASR在胞內(nèi)可能具有多種功能。在多種植物中的研究顯示，ASR定位在細胞核內(nèi)，具有轉(zhuǎn)錄因子的功能，參與相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[6,8-9,12-13,23]；在胞質(zhì)中，ASR作為一種分子伴侶，在逆境脅迫下大量積累，能夠維持細胞中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及增加胞質(zhì)濃度，進而提高對逆境的抵御能力[1,11,24]。CsASR穩(wěn)定性較高，因此它可以在胞質(zhì)中穩(wěn)定存在并發(fā)揮相應(yīng)的分子伴侶功能。同時其可折疊序列占比達74.5%，表明該蛋白的結(jié)構(gòu)可以根據(jù)條件刺激發(fā)生改變進而在多種生理活動中起作用。因此，本研究獲得的CsASR不僅可作為轉(zhuǎn)錄因子參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，還可能以分子伴侶的形式行使其功能，其功能還有待通過轉(zhuǎn)基因等手段進行深入研究。

圖6 CsASR的組織表達（A）及其在逆境脅迫中的表達（B-E）模式分析Fig. 6 Expression patterns of CsASR in tissues (A) and in response to stresses (B-E)

本研究中，還克隆了 CsASR基因的全長基因組序列。CsASR由1個內(nèi)含子和2個外顯子構(gòu)成，其中第一個外顯子較長，第二個外顯子較短（圖5）。由于其編碼基因較小，植物中的 ASR基因主要由2個外顯子組成，但有的木本植物中的ASR基因也含有3個外顯子，如蘋果ASR1和ASR3等，這可能與植物自身基因組大小及復(fù)雜度有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，茶樹CsASR的內(nèi)含子顯著大于其他植物中的ASR，其他植物中內(nèi)含子多在 600 bp以下，最短的只有100 bp左右，而蘋果中最長的ASR2的內(nèi)含子也僅為1 587 bp，小于茶樹2 751 bp的長度（圖5）。重復(fù)序列分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子中有7種不同類型的重復(fù)序列元件占內(nèi)含子長度的12.15%，同時還含有2個DNA轉(zhuǎn)座子，從中可見茶樹基因組之復(fù)雜。此外，我們還克隆獲得了CsASR基因啟動子序列2 554 bp，分析預(yù)測顯示在該啟動子序列上含有多種參與逆境脅迫響應(yīng)的順式作用元件，如干旱、低溫和高溫響應(yīng)元件，同時還含有多種植物激素，如乙烯、生長素和茉莉酸甲酯等相關(guān)的順式作用元件（表 1），表明該基因的表達受多種逆境脅迫調(diào)控。

本研究檢測了CsASR在ABA、干旱、高鹽和低溫脅迫下的表達模式，證實該基因與茶樹的逆境響應(yīng)密切相關(guān)。ABA和低溫刺激能夠快速誘導(dǎo)植物進行響應(yīng)，我們的結(jié)果表明在ABA和低溫處理2 h后CsASR的表達水平就發(fā)生了顯著變化。其中，CsASR基因的表達在ABA處理過程中呈下調(diào)的模式（圖6-B），表明該基因在ABA響應(yīng)中可能起負調(diào)控作用。與茶樹中CsASR相似，水稻OsASR1、OsASR2和 OsASR3 的表達在 ABA（100 μmol·L-1）處理后在葉片中呈下調(diào)模式[25]，谷子ASR6在葉片中的表達也被ABA抑制[21]，而在小麥[8]、番茄和草莓[6]和遼寧堿蓬[19]等多種植物中的研究顯示ASR的表達受ABA誘導(dǎo)，在 ABA調(diào)控的抗逆中起正調(diào)控作用。然而，CsASR在干旱、高鹽和低溫脅迫處理后，其表達被顯著誘導(dǎo)（圖 6-C～圖 6-E），表明 CsASR可能參與了ABA介導(dǎo)的抗逆響應(yīng)調(diào)控。干旱后復(fù)水響應(yīng)也是植物抗旱機理研究中重要的內(nèi)容之一，本研究發(fā)現(xiàn)干旱誘導(dǎo)復(fù)水期間 CsASR仍具有較高的轉(zhuǎn)錄水平，表明該基因在茶樹干旱后恢復(fù)期間也可能發(fā)揮一定的功能。與其他處理不同，我們通過澆灌方式研究了鹽脅迫CsASR在茶樹葉片中的表達模式，并對該基因在 4 h和 24 h的表達量進行了分析，表明CsASR在茶樹抵御鹽脅迫中也可能發(fā)揮功能。將不同植物中的 ASR通過轉(zhuǎn)基因到擬南芥等模式植物中均表明，過表達 ASR基因能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的抗寒、抗旱、抗鹽脅迫等的能力。Li等[24]對 OsASR5在水稻抗旱中的功能及作用機制進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsASR5能夠增強水稻的抗旱能力，深入研究發(fā)現(xiàn)該基因能夠參與 ABA和 H2O2介導(dǎo)的氣孔開閉調(diào)節(jié)，同時作為分子伴侶在胞內(nèi)能夠與逆境響應(yīng)相關(guān)的HSP40和含2OG-Fe (II)氧合酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合，參與植物抗旱響應(yīng)。過表達ASR基因的植株中，ASR能夠通過調(diào)控光合作用、呼吸作用、碳水化合物及植物激素等的代謝，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)、氣孔開閉，參與植物響應(yīng)干旱的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等，促進植物對逆境脅迫的抵御能力[7,19-21,26-27]。另外，有研究發(fā)現(xiàn) ASR基因在植物響應(yīng)鋁脅迫和抗病等方面也有重要的功能[4,9,13,28]，同時 ASR基因與糖信號調(diào)控等也密切相關(guān)[12,29]。鑒于 ASR在植物抗逆中具有廣泛的功能，而擬南芥中不含 ASR基因，因此，后續(xù)可以在擬南芥中對CsASR的功能進行鑒定，為茶樹抗逆機理研究及高抗品種選育提供理論支撐。

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Cloning and Expression Analysis of CsASR Gene in Tea Plant (Camellia sinensis)

YUE Chuan1,2, CAO Hongli1,2, HAO Xinyuan2, GUO Yuqiong1,YE Naixing1, WANG Xinchao2*, YANG Yajun2*
1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science in Universities of Fujian Province/Collaborative Innovation Center of Chinese Oolong Tea Industry, Fuzhou 350002, China; 2. Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, National Center for Tea Improvement, Key Laboratory of Tea Plant Biology and Resources Utilization,Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

Abiotic stress severely affects the growth and development of tea plant and the quality of tea. ASR(abscisic acid, stress, ripening) genes play crucial roles in the plant response to stresses. The full-length cDNA,genomic sequence and the promoter sequence of CsASR gene were cloned from tea cultivar Longjing 43 in this study,The bioinformatic and the expression analysis of CsASR in tissues under different stress treatments were performed.The results revealed that the full-length cDNA of CsASR was 875 bp, containing a 546 bp ORF encoding 181 amino acid. The predict protein molecular and theoretic isoelectric point of CsASR were 19.89 kD and 5.69. Most regionsof the amino acid sequence (74.5%) were predicted as the non-ordered regions, indicating that CsASR is a disordered protein. C-terminal of CsASR contained an ABA/WDS functional domain which was primarily located in both the cytoplasm and the nucleus. The homologous alignment and phylogenetic tree analysis showed that CsASR had the highest similarity (87%) with Phoenix dactylifera, and had the closest genetic relationship with Ziziphus nummularia.The genomic sequence of CsASR gene was comprised by two exons with 363 bp and 183 bp in length, respectively,and had a 2 750 bp intron which contained seven simple repeats and two DNA transposons. The promoter sequence of CsASR was 2 554 bp in length and was predicted to contain several stress-responsive elements related to drought,cold, high temperature stresses and ABA-signaling. The expression analysis showed that CsASR had the lowest level in roots, and its expression was repressed by ABA treatment. While the drought, NaCl and cold stresses could significantly up-regulate the expression of CsASR. The results revealed that CsASR might be closely related to stress response in tea plant.

tea plant, ASR gene, abiotic stress, gene cloning

S571.1；Q52

A

1000-369X（2017）04-399-12

2017-04-10

2017-05-14

國家自然科學基金（31600555）、福建省自然科學基金項目（2017J01616）、國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-23）

岳川，男，講師，主要從事茶樹種質(zhì)資源利用與茶葉品質(zhì)調(diào)控研究。*通訊作者