席 柔 ， 朱曉波 ， 鄭明學 ，貢 鑫 ， 白 瑞 ，史晨婕 ， 張李琦 ， 蘇曉晴 ， 張 黎 ， 徐之勇

(山西農業(yè)大學動物科技學院， 山西太谷030801)

增效助懸劑對堆型艾美耳球蟲活卵囊免疫效果的影響

席 柔 ， 朱曉波 ， 鄭明學 ，貢 鑫 ， 白 瑞 ，史晨婕 ， 張李琦 ， 蘇曉晴 ， 張 黎 ， 徐之勇

(山西農業(yè)大學動物科技學院， 山西太谷030801)

為檢驗本課題研制的球蟲疫苗免疫增效助懸劑對疫苗免疫效果的功效。通過測定免疫攻毒雞的相對增重率、死亡率、病變記分、卵囊減少率等來觀察和分析雞球蟲病疫苗免疫增效助懸劑對疫苗免疫產生期的影響。結果顯示，與飲水對照組相比,增效助懸劑組的相對飲水率為105.89%；一次免疫，增效劑免疫組和免疫對照組雞群已能對大劑量強毒株攻擊產生保護力，但病變記分均≥1，相對增重未達到80%，未達到良好免疫效果；二次免疫，增效劑免疫攻毒組于二免后第6天產生良好免疫保護，免疫對照組于二免后第7天達到良好免疫效果。表明球蟲疫苗免疫增效助懸劑不影響雛雞飲水，且使用該助懸劑可縮短免疫產生期。

球蟲 ； 增效助懸劑 ； 免疫產生期

雞球蟲病是由多種球蟲引起的一種腸道寄生蟲病，15～50日齡的雛雞發(fā)病率和死亡率都極高。免疫預防是目前控制該病較為理想的方法，雞球蟲疫苗為球蟲病的防治提供了新的有效途徑。雞球蟲疫苗的常用免疫方法有經(jīng)口滴服、噴霧拌料法、飲水等途徑，其中經(jīng)口滴服和噴霧拌料法有很多不足之處。飲水免疫法簡單方便，對雞只應激小，但由于球蟲卵囊密度比水大，將活疫苗加入水中，球蟲卵囊會因為重力作用很快下沉，造成免疫不均勻或漏免。在免疫時需要助懸劑使蟲苗均勻的懸浮于水中，同時延長雞只飲水時間，力求使雞獲得均一有效的球蟲免疫保護力[1]。

雞球蟲疫苗在免疫接種后通常需要14 d才能產生免疫效力[2]，由于疫苗免疫產生期較長，若接種雞群在未產生足夠免疫力的免疫空白期內感染雞球蟲，則會造成免疫失敗。但若為加速免疫效力的產生而加大免疫劑量，則會因影響雞增重，甚至誘發(fā)雞球蟲病，因此縮短免疫產生期是十分有必要的。免疫佐劑可非特異性地改變或增加機體與特異性免疫原性物質結合，刺激機體產生穩(wěn)定、長期的特異性免疫反應，可縮短免疫產生期，同時減少疫苗用量。

因此將助懸劑與免疫佐劑二者復配制成球蟲疫苗免疫增效助懸劑可以提高免疫效果，降低成本。國內將其二者復配制成球蟲疫苗免疫增效助懸劑的研究較少，本文通過分析探討球蟲疫苗免疫增效助懸劑在球蟲疫苗免疫接種中對免疫效果的影響，為有效使用雞球蟲疫苗控制雞球蟲病的發(fā)生發(fā)展提供新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗蟲株和動物 堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)強毒株(Ea04，201311)，和堆型艾美耳球蟲早熟株(Eap16，201311)，由山西農業(yè)大學獸醫(yī)病理實驗室提供。海藍白雛雞，購自山西省太谷縣康牧禽業(yè)，飼養(yǎng)于經(jīng)嚴格消毒后的無球蟲的SPF隔離器中。

1.2 主要試劑 球蟲助懸劑(卡波姆、HPMC)和雞球蟲病疫苗增效助懸劑(HPMC、卡波姆、黃芪多糖、殼聚糖、葡萄糖)，由山西農業(yè)大學獸醫(yī)病理實驗室研制。

1.3 球蟲疫苗免疫增效助懸劑對雛雞飲水量影響試驗 將體重近似的20只6日齡雛雞隨機分為2組，分別記為增效助懸劑組T1(8.25 g增效助懸劑溶于100 mL水中)，空白對照組C0(100 mL涼白開水)。稱量飲水前T1組和C0組的水壺重量分別為W1、W2，加入飲水后的水壺總重分別為W11、W21，飲水4 h后，剩余飲水的水壺總重分別為W12、W22。計算T1組相對飲水量。

相對飲水率=[(W11-W1)-(W12-W1)]/[(W21-W2)-(W22-W2)]×100%

1.4 球蟲疫苗免疫增效助懸劑對球蟲疫苗免疫產生期的影響試驗 空腹稱重后，將體重近似的7日齡健康雛雞隨機分為20組，10只/組，T11～T12為首免增效助懸劑免疫組、T13～T14為助懸液免疫對照組、C11～C12為攻毒對照組，T21～T24為二免增效助懸劑免疫組、T25～T28為助懸液免疫對照組、C21～C24為攻毒對照組和C10、C20為2個空白對照組。

于7日齡，T11～T12和T13～T14分別通過飲用含E.acervulina早熟卵囊(12 000個孢子化卵囊/組)的增效助懸劑稀釋液40 mL和助懸液40 mL(球蟲助懸劑0.25 g/100 mL水)免疫4 h后換回原來的飲水，首免后8、9 d分別對T11～T12、T13～T14、C11～C12，灌胃攻20×104個/只E.acervulina強毒株，攻毒后觀察雞的精神狀態(tài)和糞便情況，各組攻毒后第8天空腹稱重后剖殺，記錄攻毒前和剖解前體重、十二指腸病變記分、死亡率、每克糞便卵囊數(shù)(OPG)和糞便重量，計算相對增重率、病變記分減少率、卵囊減少率。

于7日齡，T21～T24組和T25～T28的免疫方法和劑量分別同T11～T12和T13～T14組，首免后第10天分別通過飲用含E.acervulina早熟卵囊(0.9×104個孢子化卵囊/組)的240 mL增效助懸劑稀釋液和240 mL助懸液免疫，4 h后換回原來的飲水，二免后于5、6、7、14 d分別對T21～T24、T25～T28、C21～C24灌胃攻20×104個/只E.acervulina強毒株，攻毒后觀察和測定指標同首免攻毒組(T11～T12和T13～T14)。

1.5 檢測指標和方法

1.5.1 每克糞便卵囊數(shù)(OPG) 稱取2 g雞糞，溶于20 mL水中制成10倍的稀釋液，攪拌均勻后，血球記數(shù)板計數(shù)。

1.5.2 小腸病變記分 按Johnson和Reid等[3]推薦的5分制記分法進行記分。

1.5.3 增重情況平均增重=(末總重-初總重)/雞數(shù)；相對增重率(%)=感染組雞平均增重/健康對照組雞平均增重×100%。

1.5.4 病變記分減少率(RLS) 按Martin等[4]的標準計算，當RLS≥70%判為有保護力。

1.5.5 卵囊減少率 按McDonald等[5]的標準計算，減少率≥75%判為有保護力。

1.5.6 疫苗免疫效力判定標準 攻毒對照組十二指腸病變記分≥3；免疫攻毒組十二指腸病變記分≤1，病變記分減少率≥70%，相對增重率≥80%，卵囊減少率≥75%判為免疫效果良好。

2 試驗結果

2.1 球蟲疫苗免疫增效助懸劑對雛雞飲水量的影響 雛雞分別飲用涼白開水和增效助懸劑稀釋液，4 h后測得相對飲水量為105.89%，表明球蟲疫苗稀釋液對雛雞飲水無明顯影響，可在日常飲水中加入球蟲疫苗免疫增效助懸劑進行免疫，見表1。

表1 球蟲疫苗免疫增效助懸劑的相對飲水量

2.2 球蟲疫苗免疫增效助懸劑對球蟲疫苗免疫產生期的影響

2.2.1 一次免疫后免疫產生期試驗 免疫攻毒組雞精神狀態(tài)良好，食欲正常，而攻毒對照組雞出現(xiàn)精神沉郁、羽毛蓬亂、采食減少的現(xiàn)象。各攻毒組雞攻毒后出現(xiàn)個別雞拉土黃色的水樣稀糞。各組雞均未死亡。

隨著免疫后攻毒時間的推移，首免增效助懸劑免疫組(T11、T12)和助懸液免疫攻毒對照組(T13、T14)相對增重率均呈上升趨勢，平均病變記分呈下降趨勢。于免疫后第8、9天攻毒，T11、T12組相對增重率、卵囊減少率、RLS高于T13、T14組；T11、T12組平均病變記分低于T13、T14組，且免疫增效助懸劑免疫組和助懸液免疫攻毒對照組平均病變記分均低于攻毒對照組，差異極顯著(P<0.01)，但還未達到良好免疫效果，見表2。

表2 一次免疫的免疫產生期

注：大寫字母不同表示同一列差異極顯著(P<0.01)，小寫字母不同表示同一列差異顯著(P<0.05)，下表同

2.2.2 二次免疫后免疫產生期試驗 攻毒對照組雞攻毒后表現(xiàn)同首免攻毒對照組，免疫攻毒組雞精神狀態(tài)良好，食欲正常，出現(xiàn)個別雞拉土黃色的水樣稀糞，但二免攻毒組程度較首免攻毒組輕。各組雞均未死亡。

隨二次免疫后攻毒時間的推移，增效助懸劑免疫組(T21～T24組)和助懸液免疫攻毒對照組(T25～T28組)的相對增重率、卵囊減少率均呈上升趨勢，平均病變記分呈下降趨勢。于免疫后第5、6、7、14天攻毒，T21～T24組相對增重率、卵囊減少率高于T25～T28組，平均病變記分低于T25～T28組，增效助懸劑免疫組和助懸液免疫攻毒對照組分別于免疫后大于等于6d和7d達到了良好免疫效果，見表3。

3 討論與小結

試驗結果表明,雞球蟲病疫苗增效助懸劑對雛雞飲水無明顯影響，且飲水免疫后，增效助懸劑組換回白開水，連續(xù)觀察數(shù)小時，雛雞飲水無異常，可將雞球蟲疫苗增效助懸劑加入日常飲水中來免疫雞群。使用增效助懸劑的雞只于二免后第6天達到良好免疫效果并且使疫苗免疫產生期縮短了1d。這是由于免疫佐劑在其中發(fā)揮了重要作用，免疫佐劑可促進抗原遞呈細胞攝取抗原的速度和分泌白細胞介素的產生，還通過APC向免疫效應細胞遞呈免疫原，誘導CD8+T細胞應答，使免疫加速進行[6]。

表3 二次免疫的免疫產生期

兩次免疫效果優(yōu)于一次免疫。顧有方等[7]試驗研究了GC02雞球蟲病疫苗不同免疫次數(shù)的免疫效果，結果表明，二次免疫的效果優(yōu)于一次免疫和3次免疫，二次免疫后的雞群可有效地降低雞球蟲病的發(fā)生，且對雛雞增重有顯著的促進作用。卞國志等[8]試驗觀察不同免疫劑量和免疫次數(shù)對E.necatrix免疫保護力的影響，2次免疫處理組的各項指標均明顯優(yōu)于一次免疫組，表明在籠養(yǎng)條件下由于缺乏卵囊的循環(huán)感染，1次免疫后所激發(fā)的免疫力持續(xù)時間較短，要達到球蟲病的有效控制，需進行二次免疫接種。

[1] 高冬梅,陳曉月.家禽免疫方法及注意事項[J].家禽科學,2014,06:33-35.

[2] 李洲. 雞球蟲疫苗的免疫效力及使用效益的研究[D].南京：南京農業(yè)大學, 2011.

[3] Johnson J,Reid W M.Anticoccidial drugs:lesion scoring techniques in battery and floorpen experiments with chickens[J].Exp Parasitol,1970,8:30-36.

[4] Martin A G, Danforth H D, Barta J R,etal. Analysis of immunologicl cross-protection and sensitivities to anticoccididial drugs among five geographical and temporal strains of Eimeria maxima [J].In t J Parasito, 1997, 27(5): 527-533.

[5] McDonald V,Shirley M W, Bellatti M A. Eimeria maxima: characteristics of attenuated lines obtained by selection for precocious development in the chicken [J]. Exp Parasit,1986,61:92-200.

[6] 李學釗,洪煬,王治倉,等. 免疫佐劑研究進展及前景展望[J]. 中國動物傳染病學報, 2014, 22(4): 81-86.

[7] 顧有方, 蔡漢喬, 陳會良, 等. GC_(02)雞球蟲病疫苗免疫效果的觀察[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2006, 28(5): 553-558．

[8] 卞國志, 蔡建平, 謝明權, 等. 不同劑量和免疫次數(shù)對雞毒害艾美爾球蟲免疫保護力度影響[J]. 中國獸醫(yī)學報, 2006, 26(1): 39-42．

Effect of Synergy Suspending AgentsonE.acervulinaOocysts Immunization

XI Rou , ZHU Xiao-bo , ZHENG Ming-xue , GONG Xin , BAI Rui , SHI Chen-jie , ZHANG Li-qi , SU Xiao-qing , ZHANG Li , XU Zhi-yong

(College of Animal Science&.Technology of Shanxi agriculture, Taigu 030801，China)

In order to test the effect of synergy suspending agents on chicken vaccine immunization,we analyzed the immune efficacy of the vaccine by measuring the relative weight gain rate,mortality rate,intestinal lesion scores,and oocysts reduction rate.The results showed that compared with control group,the relative drinking water rate of the synergy suspending agent group was 105.89%. In the first immunization, the chicken in the synergy suspending agent group and immunization group already had the good protective immunity on the challenge of megadose virulent strain,although the average lesion scores in both groups were more than 1,and the relative weight gain rate didn’t reach 80%.In the second immunization,the chicken in synergy suspending agent group had a good immune protection at day 6 and the chicken in immunization group had a good immune protection at day 7. Our findings indicate that this synergy suspending agent can be added in chicken immunization,and the immune production time is shorten.

Coccidium ; Synergy Suspending Agent ; Immune Production Time

ZHENG Ming-xue

2016-09-23

國家自然科學基金項目(31272536)；山西省現(xiàn)代農業(yè)雞產業(yè)技術系項目上(2016-11-03)

席柔(1993-)，女，碩士生，主要從事雞球蟲發(fā)病與免疫機理研究，E-mail:781837589@qq.com

鄭明學,E-mail:zhengmingxue288@163.com

S852.4

A

0529-6005(2017)07-0024-03