胡詩帆+鄧日林+唐澤民+歐陽婧+孫園園+莫林波+張健+楊寅柯

摘 要 為探討穩(wěn)定干擾長非編碼RNA基因Z38對乳腺癌細(xì)胞BT549的影響，向BT549細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾Z38表達(dá)的慢病毒，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定干擾的細(xì)胞，采用RT-PCR檢測Z38的表達(dá)水平、MTT法檢測細(xì)胞增殖及耐藥性、克隆法檢測細(xì)胞集落形成能力、碘化丙啶染色方法分析細(xì)胞周期、流式細(xì)胞術(shù)分析腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和CD24的表達(dá).結(jié)果表明，特異性的慢病毒能顯著降低Z38表達(dá)水平，使細(xì)胞增殖能力、抗化療藥物能力及細(xì)胞集落形成能力顯著降低，導(dǎo)致G2/M期細(xì)胞數(shù)目顯著減少，細(xì)胞周期受阻，并且顯著降低了CD44+/CD24-細(xì)胞群百分比而導(dǎo)致細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性降低.

關(guān)鍵詞 Z38；人乳腺癌；細(xì)胞增殖；CD44+/CD24-

中圖分類號 R737.9；R96文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1000-2537（2017）04-0034-06

Abstract The present study aimed at exploring the effect of stably interfering the long non-coding RNA gene Z38 on the biological behavior of human breast cancer cell line BT549. The lentiviral vector harboring RNAi sequence with the Z38 gene targeted was transfected into BT549 cells， and then screened by puromycin. The expression level of Z38 was determined by RT-PCR. Its cell viability and drug resistance were measured by MTT assay. The colony formation ability of cells was ascertained by cloning method. The cell cycle distribution was analyzed by propidium iodide staining. And the expression of CD44 and CD24 was examined by flow cytometry. Our results indicate that the expression level of Z38 was seriously inhibited by the specific lentiviral vector， which in turn effectively arrested the cell proliferation， drug resistance， colony formation ability， and cell number in G2/M stage. Moreover， our study shows that compared to the control group， the percentage of CD44+/CD24- cell was significantly decreased in the interference group， suggesting that the properties of cancer stem-like cells were markedly impacted.

Key words Z38； human breast cancer； cell proliferation； CD44+/CD24-

近年來，在原核生物、真核生物以及古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)許多ncRNA （non-coding RNA），它們在多個水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[1].人類基因組中有80%左右的基因能夠被轉(zhuǎn)錄，而其中只有2%的序列編碼蛋白質(zhì)，超過90%是ncRNA[2-4]，說明ncRNA是基因組轉(zhuǎn)錄的主要產(chǎn)物.lncRNA（long non-coding RNA）是轉(zhuǎn)錄本超過200 bp，不具備開放閱讀框的ncRNA序列.lncRNA的啟動子相對更加保守，提示這些可能在生物體中發(fā)揮著重要的作用.lncRNA的異常表達(dá)與多種疾病相關(guān)，尤其是對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著重要影響[5].

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種轉(zhuǎn)錄水平上的基因隔斷技術(shù)，具有高效性、特異性、選擇性、快速性和可操作性等優(yōu)點(diǎn)，在基因治療中應(yīng)用廣泛，是現(xiàn)今沉默某些目標(biāo)致癌基因的常用手段[6].慢病毒質(zhì)粒載體系統(tǒng)安全性強(qiáng)、宿主細(xì)胞適用范圍廣，且轉(zhuǎn)染效率高，可在細(xì)胞中長期穩(wěn)定表達(dá)[7-8].采用慢病毒包裝好的RNA干擾載體，可大大提高實(shí)驗(yàn)的可靠性，是目前最為有效的特異下調(diào)靶基因的干預(yù)手段[9].

本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，通過比較乳腺癌[10-11]和正常乳腺組織的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)了一個很有意義的編碼ncRNA的基因，命名為Z38.Z38是一個762 bp的lncRNA.研究表明，Z38在乳腺癌中的表達(dá)很高，但在癌旁乳腺組織中表達(dá)很低（相差8～10倍）.此外，多種腫瘤細(xì)胞株及不同種類的腫瘤病人標(biāo)本都檢測出較高表達(dá)水平的Z38.本研究以lncRNA Z38為研究對象，考察其對人乳腺癌細(xì)胞BT549一些生物學(xué)特性的影響，為今后研究Z38在其他腫瘤細(xì)胞中的作用提供依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料

人乳腺癌細(xì)胞BT549購自中科院上海細(xì)胞庫.RPMI-1640 培養(yǎng)基購自美國 Hyclone公司；FCS（胎牛血清）購自美國 Hyclone公司；pGMLV-Z38-shRNA慢病毒載體系統(tǒng)由吉滿生物有限公司設(shè)計(jì)提供；嘌呤霉素鹽酸鹽購自意大利Bio Basic Inc公司；TRIzol RNA抽提試劑購自Thermo Fisher Scientific公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；MTT試劑購自鵬程生物科技有限公司；鹽酸阿霉素購自湖北巨勝科技有限公司；細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的鼠抗人CD44及多甲藻葉綠素蛋白（PerCP-Cy5.5）標(biāo)記的鼠抗人 CD24單克隆抗體購自BD公司，其余均為國產(chǎn)分析純試劑.

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌BT549細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃及5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3天更換新鮮培養(yǎng)基.

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染

實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照組（blank control）、陰性對照組（pGMLV-scramble）及干擾組（pGMLV-Z38-shRNA）.將細(xì)胞以105個/孔鋪板于6孔板，37 ℃及5%CO2條件下培養(yǎng)過夜.24 h后吸去細(xì)胞原有培養(yǎng)基，分別將細(xì)胞培養(yǎng)基（空白對照組）、陰性對照組病毒液、干擾組Z38-shRNA 病毒液，按照感染復(fù)數(shù)MOI（Multiplicity of Infection）=80稀釋后加入細(xì)胞中，并加入Polybrene，在37 ℃及5%CO2條件下培養(yǎng)過夜，然后吸除含慢病毒的培養(yǎng)基，換為新鮮的培養(yǎng)基.

2.3 嘌呤霉素篩選感染細(xì)胞穩(wěn)定株

在24孔板內(nèi)以2×105 個/孔的密度鋪板轉(zhuǎn)染了慢病毒的細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過夜后去除培養(yǎng)基，加入含3 mg/L嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基，約每2～3天替換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基，并每天檢測細(xì)胞并觀察活細(xì)胞生長比例、EGFP的表達(dá)，評估感染效率.

2.4 Real Time-PCR檢測細(xì)胞Z38基因表達(dá)

分別提取經(jīng)慢病毒篩選后的空白對照、陰性對照以及干擾組細(xì)胞的總RNA，通過RT-PCR檢測細(xì)胞Z38基因的表達(dá)情況.GAPDH基因引物序列為F：5′-AACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，R：5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′.Z38基因引物序列為F：5′-AGTGGGATTGTGGAGACGGTGT-3′，R：5′-AGGTAAAAGGAACTGGCAACGC-3′.

2.5 MTT法檢測RNA干擾對細(xì)胞增殖的影響

按照2×103個/孔將處于對數(shù)生長期細(xì)胞鋪板48孔板，置于37 ℃及5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).在第1，3，5，7天分別每組取6孔，每孔加5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸除原有培養(yǎng)液，每孔加 DMSO 150 μL，溫和震蕩10 min溶解紫色甲瓚，在酶標(biāo)儀上測定490 nm波長下的吸光度（OD）值，以時間為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線.細(xì)胞相對存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%.

2.6 MTT法檢測細(xì)胞經(jīng)RNA干擾對阿霉素耐藥性的影響

將細(xì)胞在含0.1 mg/L的阿霉素細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)3個月，并逐漸將阿霉素濃度提高到1 mg/L.細(xì)胞隔日更換新鮮培養(yǎng)基，每3～4天傳代一次.耐藥細(xì)胞初步誘導(dǎo)成功后，將細(xì)胞在無阿霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少6個月，檢測仍保持相似的耐藥性且狀態(tài)良好的細(xì)胞[12-13]，然后以2×104個/孔鋪板48孔板，培養(yǎng)12 h后每孔加不同濃度梯度（1，2，3，5，10，20，30，50 mg/L）阿霉素，37 ℃培養(yǎng)48 h后用MTT法檢測細(xì)胞在490 nm波長下的OD值.相對抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對照組OD值×100%.

2.7 克隆法檢測 RNA干擾對細(xì)胞集落形成的影響

將指數(shù)生長期細(xì)胞反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分分散制成單細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞懸液濃度稀釋至10個/mL，然后將細(xì)胞接種于96孔板，確保每孔1個細(xì)胞/100 μL培養(yǎng)基（若不是則剔除），置于37 ℃及5%CO2中培養(yǎng)2～3周，根據(jù)pH變化更換新鮮培養(yǎng)液.待培養(yǎng)皿中出現(xiàn)克?。ù笥诨虻扔?0個細(xì)胞組成的細(xì)胞群作為一個克?。瑮壢ヅ囵B(yǎng)液，用甲醇固定15 min，棄甲醇后空氣干燥，用Giemsa染液染色10 min、流水緩慢洗去染液、空氣干燥.在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆集落數(shù).并計(jì)算細(xì)胞集落生長百分比，集落形成百分比=（克隆集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%.

2.8 流式檢測RNA干擾對細(xì)胞周期的影響

配置適量的碘化丙啶染色液（每3 mL染色緩沖液中加入碘化丙啶染色液（20×）150 μL，RNase A（50×）60 μL），4 ℃保存.收集乳腺癌BT549細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)為105～106），離心棄上清，用預(yù)冷的PBS洗滌，再次離心棄上清，加入預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃固定12 h，離心沉淀細(xì)胞，棄上清.每管細(xì)胞樣品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細(xì)胞，后在37 ℃避光溫浴30 min，隨后4 ℃或冰浴避光存放，用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm處檢測紅色熒光，結(jié)果用FlowJo 7.6軟件處理.

2.9 流式檢測RNAi對細(xì)胞表面標(biāo)志物CD44/CD24表達(dá)量的影響

取對數(shù)生長期細(xì)胞消化重懸，過48 μm細(xì)胞篩，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個/200 μL，每組分別設(shè)同型對照管、CD44單陽抗體管、CD24單陽抗體管、雙陽抗體管，用流式分析儀檢測每管細(xì)胞CD44+/CD24-細(xì)胞占總細(xì)胞的比例.

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用 SPSS 19.0 for Windows 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P<0.05為差異有顯著性意義.

3 結(jié)果

3.1 慢病毒轉(zhuǎn)染乳腺癌BT549細(xì)胞情況

慢病毒感染細(xì)胞并經(jīng)嘌呤霉素篩選后，在熒光顯微鏡下比較同一視野的細(xì)胞熒光照片和明場照片，顯示其感染效率將近100%，如圖1A所示（彩圖見封三）.

3.2 慢病毒轉(zhuǎn)染對乳腺癌BT549細(xì)胞Z38表達(dá)水平的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，BT549細(xì)胞經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后，干擾組的 Z38表達(dá)水平較陰性對照組與空白對照組均顯著下調(diào)（P<0.05），而空白對照組與陰性對照組Z38基因表達(dá)水平無明顯區(qū)別（P>0.05），如圖1B.

3.3 干擾Z38表達(dá)對細(xì)胞增殖能力的影響

采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測Z38基因表達(dá)水平對細(xì)胞增殖能力的影響.由圖2A可知，待培養(yǎng)第3天后，空白對照組、陰性對照組及干擾組細(xì)胞OD值開始出現(xiàn)明顯區(qū)別，第5天三組OD值分別為0.322±0.006 6（空白對照組）、0.321±0.005 6（陰性對照組）、0.259±0.006 8（干擾組），其中干擾組細(xì)胞相對于陰性對照組細(xì)胞存活率達(dá)到80.7%.第7天的OD值分別為0.547±0.005 6（空白對照組）、0.557±0.008 7（陰性對照組），0.436±0.006 8（干擾組），其中干擾組細(xì)胞相對陰性對照組細(xì)胞存活率為78.3%.因此，干擾組與對照組細(xì)胞相比，增殖活性明顯降低（P<0.05）.

3.4 干擾Z38表達(dá)降低細(xì)胞對阿霉素的耐藥性

在含阿霉素的培養(yǎng)基作用48 h后，干擾組細(xì)胞增殖的抑制率明顯高于對照組（P<0.05），見圖2B，空白對照組和陰性對照組抑制率相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）.阿霉素濃度越高對細(xì)胞增殖的抑制效果越明顯.

3.5 干擾Z38表達(dá)對細(xì)胞集落形成能力的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白對照組、陰性對照組、干擾組細(xì)胞集落形成百分比分別為21.2%，22.1%，9.8%，干擾組細(xì)胞的集落形成能力較陰性對照組明顯降低（P<0.05），如圖2C.

3.6 干擾Z38表達(dá)對BT549細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，空白對照組、陰性對照組和干擾組處于G2/M期的細(xì)胞比例分別為22.18%（圖3A），23.87%（圖3B），6.05%（圖3C），其中干擾組處于G2/M期的干擾組細(xì)胞數(shù)量比重明顯減少（P<0.05），且干擾組細(xì)胞主要在S-G2轉(zhuǎn)換時受到抑制，見圖3D.

3.7 干擾Z38表達(dá)對BT549細(xì)胞表達(dá)CD44+和CD24-的影響

采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞中CD44+/CD24-細(xì)胞群百分比.干擾組CD44+/CD24-細(xì)胞群所占細(xì)胞百分比為6.20%（圖4A），顯著低于對照組細(xì)胞所占的12.30%（圖4B），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）.

4 討論

哺乳動物中，超過30 bp的dsRNA導(dǎo)致廣泛的基因沉默現(xiàn)象，使特異性干擾目的基因變得十分困難.在RNAi研究中，可以采用直接轉(zhuǎn)染人工合成的siRNA，還可以采用質(zhì)粒或病毒載體介導(dǎo)的shRNA.人工合成的寡核苷酸siRNA和質(zhì)粒介導(dǎo)RNAi均有一定的局限性，它們的轉(zhuǎn)染效率較低、抑制持續(xù)時間較短.shRNA病毒載體的優(yōu)勢在于對目的細(xì)胞感染效率高和基因沉默效果穩(wěn)定[14].目前，化療仍是治療乳腺癌的主要方法.阿霉素等蒽環(huán)類是臨床常用的抗乳腺癌藥物[15]，由于細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生，其臨床應(yīng)用受到很大限制[16-17]，尋求能提高乳腺癌化療敏感性的方法是近年研究的熱點(diǎn).本研究結(jié)果顯示，Z38-shRNA可以提高細(xì)胞對阿霉素的敏感性，從而降低腫瘤細(xì)胞的抗化療耐藥性.

Al-Hajj等[18]首次利用乳腺干細(xì)胞表型標(biāo)志物（CD44+/CD24-）從人乳腺癌細(xì)胞中分離出乳腺癌干細(xì)胞.Shipitsin等[19]發(fā)現(xiàn)，CD44+/CD24-可以作為乳腺癌干細(xì)胞的標(biāo)志物.該類群細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥的關(guān)鍵.筆者的流式分析檢測結(jié)果表明，在干擾組的細(xì)胞中，CD44+/ CD24-細(xì)胞群數(shù)目占細(xì)胞總數(shù)百分比明顯下降，進(jìn)一步說明干擾Z38基因能夠一定程度地下調(diào)乳腺癌BT549細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥能力[20].

本實(shí)驗(yàn)室前期研究證明Z38在乳腺癌標(biāo)本、組織及細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于癌旁組織及細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，將Z38基因克隆到質(zhì)粒載體中轉(zhuǎn)染乳腺細(xì)胞能夠顯著提高細(xì)胞增殖能力，并且利用Z38抑制劑能夠引起高表達(dá)Z38基因的癌細(xì)胞凋亡.

本研究采用RNA干擾技術(shù)初步證實(shí)了干擾Z38基因能夠抑制乳腺癌BT549細(xì)胞增殖能力和耐藥性，并能夠顯著降低腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和再生.該研究結(jié)果為Z38基因作為乳腺癌基因治療靶點(diǎn)，深入研究Z38的調(diào)控機(jī)制，闡明Z38在細(xì)胞增殖和凋亡中的作用機(jī)理，并確定Z38能否成為其他多發(fā)癌癥（肝癌、肺癌、直腸癌、胃癌等）的抗癌靶點(diǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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